Cette technique permet une quantification précise et précise des micro-organismes à partir d’une population mixte de souches très similaires utilisant des techniques moléculaires rapides et à haut débit. En fin de compte, en permettant des comparaisons de la condition physique à faire entre les souches. La capacité d’évaluer simultanément de nombreuses souches dans un seul pool réduit considérablement la variabilité bien-à-puits ou d’organisme à organisme parce que toutes les souches sont exposées exactement aux mêmes conditions.
L’adaptabilité de cette technique lui permet d’être utilisé pour presque n’importe quel organisme génétiquement malléable et presque n’importe quelle conception expérimentale qui nécessite une quantification précise des microbes. Commencez cette procédure par l’ingénierie de marqueurs génétiques sur les chromosomes bactériens, tel que décrit dans le protocole de texte. Créez un pool d’ADN génomique qui contient tous les codes à barres sauf un.
Utilisez ce pool comme diluant pour effectuer une série de dilution avec de l’ADN génomique contenant le code à barres restant unique. Préparez les réactions pour pcr numérique en double selon les recommandations du fabricant pour l’utilisation d’un supermix PCR numérique conçu pour la chimie basée sur les sondes. Utilisez l’ADN génomique mis en commun comme modèle d’ADN.
En outre, ajoutez la sonde Master Mix de 20 X comme décrit dans le protocole de texte. Préparez des réactions de contrôle de répétition pour pcr numérique selon les recommandations du fabricant. Les réactions de contrôle pour chaque mélange de sonde doivent être composées de contrôles de modèle, de contrôles négatifs et de contrôles positifs.
Répétez ces étapes pour créer des réactions PCR numériques pour chaque échantillon d’ADN génomique codé à barres. Générer des gouttelettes pour chaque condition de réaction à l’aide d’un générateur de gouttelettes, selon les instructions du fabricant. Transférer les gouttelettes nouvellement créées dans la plaque de puits 96 appropriée.
Utilisez 200 pointes de pipette microlitres sur une pipette multicanal de 5 à 50 microlitres. Une fois que toutes les gouttelettes ont été générées et transférées, sceller la plaque à l’l’insurcellement d’une plaque d’aluminium. Utilisez le cycleur thermique recommandé par le fabricant pour effectuer les conditions de cyclisme.
Pendant que le thermocyclisme est effectué, programmez le logiciel d’analyse de données avec les informations de configuration de la plaque, telles que le nom de l’échantillon, le type d’expérience et supermix utilisé. Incluez également le nom cible 1 et le type cible 1, ainsi que le nom cible 2 et le type cible 2. Une fois le thermocyclisme terminé, transférez les réactions terminées au lecteur de gouttelettes et commencez le processus de lecture, selon les instructions du fabricant.
Lorsque tous les puits ont été lus et que la course est terminée, ouvrez le fichier de données du PLQ à l’aide du logiciel d’analyse de données. Sélectionnez tous les puits qui utilisent la même sonde d’amorce Mastermix. Sur l’onglet Gouttelettes, examiner le nombre de gouttelettes analysées dans chaque puits, y compris les gouttelettes positives et négatives.
Exclure de l’analyse tout puits de moins de 10 000 gouttelettes totales. Passez à l’onglet Amplitude 1D et examinez les amplitudes des gouttelettes positives et négatives. Assurez-vous qu’ils comprennent 2 populations distinctes.
Dans le logiciel, utilisez la fonction de seuil pour faire une coupure entre les gouttelettes positives et négatives pour chaque sonde qui a été utilisée. Une fois que des seuils appropriés ont été appliqués à tous les puits, le logiciel calculera le nombre de copies d’ADN dans chaque réaction. Les données d’exportation vers une feuille de calcul pour faciliter une analyse plus approfondie.
À l’aide de ces valeurs, calculez le numéro de copie initial de chaque code à barres génomique unique de l’échantillon. Déterminez le taux moyen de faux positifs à partir des réactions de contrôle négatives et soustrayez cette valeur des valeurs obtenues dans les réactions expérimentales. Multipliez les valeurs au besoin, en fonction des dilutions effectuées lors de la mise en place de chaque expérience.
Maintenant, déterminez la condition physique relative d’un organisme en calculant l’indice concurrentiel ou en annulant l’indice concurrentiel de la quantification numérique basée sur pcr de la souche codée à barres. Effectuez cette étape pour chaque souche codée à barres à tout moment. L’ADN génomique contenant le code à barres AA a été dilué dans un arrière-plan de tout autre ADN génomique codé à barres.
Le canal 1 représente la sonde FAM pour le code à barres AA, tandis que channel 2 représente la sonde HEX pour le code à barres AO. Les résultats de chaque sonde sont présentés à la fois comme amplitude fluorescente de gouttelette individuelle et un histogramme représentant la fréquence de l’intensité fluorescente de toutes les gouttelettes dans les puits sélectionnés. Pour chaque condition, les gouttelettes positives et négatives devraient former 2 populations distinctes.
Les populations doivent être séparées à l’aide de la fonction seuils pour définir les gouttelettes positives et négatives. Les valeurs seuils varient en fonction des sondes utilisées, mais tous les puits qui utilisent le même mélange de sondes doivent avoir des seuils identiques. Dans le cas des AA dilués, l’histogramme ne semble représenter que la population unique parce que les gouttelettes positives sont largement plus nombreuses que les gouttelettes négatives.
Cependant, 2 populations distinctes sont encore visibles en examinant l’amplitude fluorescente de gouttelette dans les panneaux gauches. Comme l’ADN génomique codé à barres AA a été dilué, il y a eu une diminution des gouttelettes positives, tandis que le nombre de gouttelettes positives d’AO reste constant. Une fois que des seuils appropriés ont été appliqués à tous les puits, le logiciel calculera le nombre de copies d’ADN dans chaque réaction.
Si vous effectuez régulièrement pcr dans le cadre de vos recherches, vous pouvez effectuer cette technique pour évaluer la condition physique de votre organisme modèle. Cette procédure serait normalement utilisée pour déterminer les résultats finaux des expériences en amont. Sa véritable utilité est de promouvoir la facilité et la polyvalence pour toutes les expériences qui reposent sur la quantification bactérienne.
Nous utilisons cette technique pour évaluer l’aptitude à la salmonelle dans un modèle murin d’infection. En outre, cette technique est en cours d’adaptation pour être utilisée avec d’autres micro-organismes pathogènes dans notre laboratoire.
