Этот метод позволяет точно и точно количественно определить микроорганизмы из смешанной популяции очень похожих штаммов с использованием быстрых и высоких пропускной способности молекулярной основе методов. В конечном счете, в обеспечении сравнения пригодности, которые должны быть сделаны между штаммами. Способность одновременно оценивать многие штаммы в одном бассейне существенно снижает хорошо колодец или вариабельность организма к организму, потому что все штаммы подвергаются точно таким же условиям.
Адаптивность этого метода позволяет использовать его практически для любого генетически податливого организма и практически любой экспериментальной конструкции, которая требует точной количественной оценки микробов. Начните эту процедуру с разработки генетических маркеров на бактериальные хромосомы, как описано в текстовом протоколе. Создайте пул геномной ДНК, которая содержит все штрих-коды, за исключением одного.
Используйте этот пул в качестве разбавления для выполнения серии разбавления геномной ДНК, содержащей единственный оставшийся штрих-код. Подготовка реакций для цифрового ПЦР в дублировании в соответствии с рекомендациями производителя по использованию цифрового супермикса ПЦР, предназначенного для химии на основе зонда. Используйте объединяют геномную ДНК в качестве шаблона ДНК.
Кроме того, добавьте 20 X грунтовка зонд Master Mix, как описано в текстовом протоколе. Подготовка реакций управления репликацией для цифрового ПЦР в соответствии с рекомендациями производителя. Реакции управления для каждой смеси зонда должны состоять из элементов управления шаблонами, отрицательного контроля и положительного контроля.
Повторите эти шаги для создания цифровых реакций ПЦР для каждого штрих-кода геномного образца ДНК. Создание капель для каждого состояния реакции с помощью генератора капель, в соответствии с инструкциями производителя. Передача вновь созданных капель в соответствующую пластину 96 хорошо.
Используйте 200 микролитровых пипеток на многоканарной пипетки от 5 до 50 микролитров. После того, как все капли были сгенерированы и переданы, печать пластины с уплотнитель пластины фольги. Используйте рекомендованный производителем тепловой велосипедист для выполнения велосипедных условий.
В то время как термоциклинг выполняется, запрограммируйте программное обеспечение для анализа данных с информацией об установке пластины, например, название образца, тип эксперимента и используемый Supermix. Также включите имя Target 1 и тип Target 1, а также имя Target 2 и тип Target 2. После того, как термоциклинг завершен, перенесите завершенные реакции на считыватель капель и начните процесс чтения, в соответствии с инструкциями производителя.
Когда все скважины будут прочитаны и запуск будет завершен, откройте файл данных с помощью программного обеспечения для анализа данных. Выберите все скважины, которые используют тот же грунтовка зонд Mastermix. На вкладке Капель, изучить количество капель, проанализированных в каждой хорошо, в том числе как положительные, так и отрицательные капли.
Исключите из анализа любую колодец, который составляет менее 10 000 капель. Переместись на вкладку 1D Amplitude и изучите амплитуды положительных и отрицательных капель. Убедитесь, что они состоят из 2 различных групп населения.
В программном обеспечении используйте функцию порогового значения, чтобы сделать разрез между положительными и отрицательными каплями для каждого используемого зонда. После того, как соответствующие пороговые значения будут применены ко всем скважинам, программное обеспечение вычислит количество копий ДНК в каждой реакции. Экспорт данных в электронную таблицу для облегчения дальнейшего анализа.
Используя эти значения, вычислите исходное число копий каждого уникального геномного штрих-кода в образце. Определите средний ложноположимый показатель от отрицательных контрольных реакций и вычтете это значение из значений, полученных в экспериментальных реакциях. Умножьте значения по мере необходимости, основываясь на разбавлениях, которые были выполнены при настройке каждого эксперимента.
Теперь определите относительную пригодность организма, вычислив конкурентоспособный индекс или отменив конкурентоспособный индекс из цифровой количественной оценки штамма на основе ПЦР. Выполните этот шаг для каждого штрих-кода штамма в любое время точек. Геномная ДНК, содержащая штрих-код АА, была разбавлена на фоне всех других штрих-кодов геномной ДНК.
Канал 1 представляет зонд FAM для штрих-кода AA, в то время как канал 2 представляет зонд HEX для штрих-кода AO. Результаты каждого зонда представлены как отдельные капли флуоресцентной амплитуды и гистограммы, представляющие частоту флуоресцентной интенсивности всех капель в выбранных скважинах. Для каждого состояния, положительные и отрицательные капли должны образовывать 2 различных популяций.
Популяции должны быть разделены с использованием функции пороговых значений для определения положительных и отрицательных капель. Пороговые значения будут варьироваться в зависимости от зондов, которые были использованы, но все скважины, которые используют ту же смесь зонда должны иметь одинаковые пороги. В случае АА, которая была разбавлена, гистограмма, как представляется, только изображают одну популяцию, потому что положительные капли значительно превосходят отрицательные капли.
Тем не менее, 2 различных популяций по-прежнему видны путем изучения капельной флуоресцентной амплитуды в левой панели. По мере разбавления штрихкодированной геномной ДНК АА произошло снижение положительных капель, в то время как количество положительных капель АО остается неизменным. После применения соответствующих пороговых значений во всех скважинах программное обеспечение будет вычислять количество копий ДНК в каждой реакции.
Если вы регулярно выполняете ПЦР в рамках своих исследований, вы можете выполнить этот метод для оценки пригодности вашей модели организма. Эта процедура обычно используется для определения конечных результатов экспериментов вверх по течению. Его истинная полезность заключается в содействии легкости и универсальности для любых экспериментов, которые полагаются на бактериальную количественную оценку.
Мы используем этот метод для оценки пригодности сальмонеллы в мурин модели инфекции. Кроме того, этот метод адаптируется для использования с другими патогенными микроорганизмами в нашей лаборатории.
