Yavru büyüklüğünü ve embriyonik canlılığı belirlemek için kullanılan bu protokol birçok C.elegans laboratuvarı tarafından kullanılmaktadır. Kaba boyut ve embriyonik canlılıktaki azalmalar, miyoz, döllenme ve embriyogenez gibi önemli gelişimsel süreçlerdeki kusurları gösterebilir. Bu teknik, acemi C.elegans araştırmacıları için açık talimatlar sağlar.
Kurulumu ve yürütülmesi nispeten basittir ve yeni mutant suşlarla çalışırken harika bir başlangıç noktasıdır. Bu teknik için en büyük zorluk, embriyoya karşı döllenmemiş embriyo tanımlamasıdır. Yeni araştırmacılar, bu deneylere başlamadan önce embriyoların, oositlerin ve farklı larva aşamalarının tanımlanması için pratik yapmalıdır.
Başlamak için, plakanın arkasını etiketleyin, ayrı bir L4 aşamalı hermafroditi plakaya aktarın. Embriyo veya diğer solucanların plakaya transfer edilmediğinden emin olun. Solucanların yetişkinlere dönüşmesine izin verin ve 20 santigrat derecelik standart kültür sıcaklığında 24 saat boyunca kendi soylarını bırakın.
Plakayı üçüncü günde puanlayın. Ertesi gün, bir dizi yeni plakayı etiketleyin ve bir günlük solucanı yeni plakaya aktarın. Solucanların embriyoları 20 santigrat derecede 24 saat boyunca bırakmalarına izin verin.
Plakayı dördüncü günde puanlayın. Üçüncü günde, bir dizi yeni plakayı etiketleyin ve ikinci gün bireysel solucanları yeni plakaya aktarın. Solucanların 20 derecede 24 saat boyunca soy bırakmasına izin verin.
Plakayı beşinci günde puanlayın. İnce bir işaretleyici kullanarak 35 milimetrelik bir kapak üzerine ızgara deseni çizin. Daha önce sayılan solucanları takip etmek için ızgaralı kapağı sayım için test plakasının altına yerleştirin.
Bir diferansiyel hücre sayacı kullanarak, canlı larvaları ve yumurtadan çıkmamış embriyoları bireysel kare içinde sayın. Kare kenarlıklardaki solucanlar için solucan kafasının konumuna göre sayılır. Kafaları karenin üst ve sol kenarlarına dokunan solucanları sayın.
Canlı larvaların ve yumurtadan çıkmamış embriyoların sayısını bir laboratuvar defterine kaydedin. Dördüncü günde, canlı larvaları ve yumurtadan çıkmamış embriyoları sayarak ikinci gün plakasını puanlayın ve bunları bir laboratuvar defterine kaydedin. Beşinci günde, canlı larvaları ve yumurtadan çıkmamış embriyoları sayarak üçüncü gün plakasını puanlayın ve bunları bir laboratuvar defterine kaydedin.
Plakanın arkasını etiketledikten sonra, tek bir L4 hermafrodit solucanını plakaya aktarın. Embriyo veya diğer solucanların plakaya transfer edilmediğinden emin olun. Tek bir L4 erkek solucanını bir L dört hermafrodit içeren plakaya aktarın.
Solucanların çiftleşmesine ve 20 santigrat derecede 24 saat boyunca soy bırakmasına izin verin. Üçüncü günde yumurtadan çıkmamış embriyolara karşı canlı larvalar için plakayı puanlayın. Ertesi gün, bir dizi yeni plakayı etiketleyin ve hermafrodit ve erkeği yeni plakaya aktarın.
Hermafroditin yetişkinliğe ulaştığından emin olun. Hermafroditlerin 20 santigrat derecede 24 saat boyunca soy bırakmasına izin verin. Dördüncü günde yumurtadan çıkmamış embriyolara karşı canlı larvalar için plakayı puanlayın.
Üçüncü günde, bir dizi yeni plakayı etiketleyin ve hermafrodit ve erkeği yeni plakaya aktarın. Solucanların 20 derecede 24 saat boyunca soy bırakmasına izin verin. Beşinci günde canlı ve yumurtadan çıkmamış embriyolar için plakayı puanlayın.
Bir diferansiyel hücre sayacı kullanarak, canlı larvaları ve yumurtadan çıkmamış embriyoları bir plakadan itibaren sayın ve bunları bir laboratuvar defterine kaydedin. Dördüncü günde, canlı soyları ve yumurtadan çıkmamış embriyoları ikinci gün plakasından sayın ve bunları bir laboratuvar defterine kaydedin. Erkekler için bir gün tabağı kontrol edin.
Çiftleşme meydana gelmişse, hermafroditlerin erkeklere beklenen genetik oranı 50 ila 50'dir. Bir gün plaka herhangi bir erkek içermiyorsa, erkek ve hermafrodit arasında çiftleşme gerçekleşmedi. Bu çiftleşme çiftini atın ve gözlemi laboratuvar defterine kaydedin.
Beşinci günde, canlı larvaları ve yumurtadan çıkmamış embriyoları üçüncü günden itibaren sayın ve bunları bir laboratuvar defterine kaydedin. N2 için embriyonik canlılık testi% 98.9'luk bir canlılık yüzdesi verirken, hem him-5 (e1490) hem de spo-11 (ok79) sırasıyla % 74.9 ve% 0.8'lik bir yüzde ile embriyonik canlılıkta bir azalma göstermiştir. Ortalama yavru büyüklüğü N2, him-5(e1490) ve spo-11(ok79) sırasıyla 217, 105 ve 219 olarak belirlenmiştir.
C.elegans gelişiminin çeşitli aşamalarının tanınması, doğru ve tekrarlanabilir veriler için önemlidir. Resimler ve diseksiyon mikroskobu kullanarak solucan gelişimine aşina olmanızı öneririz. Bu prosedür, bir genin gelişimsel bir sürece dahil olup olmadığını belirlemek için harika bir ilk adımdır ve hangi sürecin bozulduğunu belirlemek için sitolojik analizlerle takip edilebilir.
