TEdeff kanserlerinin immünoterapiye karşı önemli bir engel olduğu göz önüne alındığında, farmakolojik modelimiz avantajlı bir araçtır çünkü bu tür kanserlerde gözlenen yaygın transkripsiyonel ve epigenetik kusurları taklit eder ve bu genetik olmayan anormallikleri inceleyip yeni bilgiler edinmek, mevcut ilaçlar için yeni kullanımlar bulmak veya bu kanserlere karşı yeni stratejiler bulmak için bu genetik olmayan anormallikleri incelemenize olanak sağlar. Bu, kanserlerde transkripsiyonel uzama defektlerini incelemek için kolay ve genelleştirilebilir bir modeldir, bu da hem in vitro hem de in vivo tümör-immün etkileşimleri incelemesini sağlar. Bu yöntem insan karsinom hatlarına da uygulanabilir.
Bunu T47D ve CAL51 üzerinde kısa bir süre için test ettik ve bu da benzer TEdeff benzeri özelliklere yol açtı. Burada tanımladığımız protokol, kronik CDK9 inhibisyonu ile TEdeff benzeri özelliklerin üretimi için kritik olan bilinen değişkenleri en aza indirmek için temel bir çerçeve sağlar. Ancak, diğer murine hatları için flavopiridol tam sublethal dozu optimize etmek için dikkatli olunmalıdır.
Hücre kaplama yoğunluğu, kültür koşulları, sitokin stimülasyon koşulları varyasyon etkisi farklı hücre lirdik hatları için değişebilir. Oligo dT manyetik boncuklar kullanarak daha önce ribozomal RNA-tükenmiş örneklerin yarısından poliA-pozitif RNA ayıklayarak başlayın. Şişedeki boncukları 30 saniye girdap yaparak yeniden askıya alın ve 200 mikrolitre lik boncukları bir tüpe aktarın.
Eşit hacimli bağlama arabelleği ekleyin ve içeriği karıştırın. Bir dakika için bir mıknatıs tüp yerleştirin ve supernatant atın. Daha sonra, mıknatıs tan tüp çıkarın ve bağlayıcı tampon 100 mikrolitre yıkanmış boncuklar yeniden askıya.
Ribozomal RNA ile tükenmiş numunenin hacmini pH 7.5'te 10 milimolar Tris-HCl ile 100 mikrolitreye ayarlayın. Örneğe 100 mikrolitre bağlama tamponu ekleyin. İkincil RNA yapılarını bozmak için karışımı 65 dereceye ısıtın ve hemen buza yerleştirin.
Toplam 200 mikrolitre RNA'yı 100 mikrolitre yıkanmış boncuklara ekleyin ve beş dakika boyunca bir rotor üzerinde iyice karıştırın. Tüpü mıknatısın üzerine bir ila iki dakika yerleştirin, dikkatlice tüm supernatant çıkarın, sonra mıknatıs tüp kaldırmak ve yıkama tampon 200 mikrolitre ekleyin. Dikkatle yukarı ve aşağı birkaç kez pipetleme tarafından örnek karıştırın, bir dakika için mıknatıs için tüp dönmek ve supernatant çıkarın.
Daha sonra, izole boncuk bağlı mRNA saflık ve konsantrasyonu ölçmek için bir spektrofotometre kullanın. Monoklonal 7-methylguanozin antikor ile beş asal kapaklı RNA immünoppresipitate protein A sütunlar giriş olarak ribozomal RNA tükenmiş örnek kalan yarısını kullanın. Proteini yıkayın Üreticinin protokolüne göre RIP kitinden manyetik boncuklar antikor boncuklar için önceden bağlamak için, 7-metilguanozin antikor boncuk için 100 mikrolitre yıkama tampon askıda asılı.
Düşük hızda dönerken 30 dakika oda sıcaklığında karışımı kuluçkaya yatırın. Sonra tüpleri kısa bir süre santrifüj edin ve manyetik ayırıcıya koyun. Süpernatant'ı çıkarın ve atın, sonra tüpleri manyetik ayırıcıdan çıkarın ve 500 mikrolitre yıkama tamponuyla boncukları askıya alın.
Tüpleri girdap, kısa bir süre santrifüj, ve manyetik ayırıcı geri yerleştirin, ve tekrar supernatant atın. Daha sonra, antikorbağlı boncuklara 120 nanogram ribozomal RNA'yı ekleyin ve karışımı bir mikrolitre RNase inhibitörü ile birlikte 60 ila 90 dakika oda sıcaklığında hafif ajitasyonla kuluçkaya yatırın. Kuluçkadan sonra, numuneyi 10 saniye boyunca 300 kez g'de döndürün ve kapaksız mRNA ile süpernatantı yeni bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
Yıkama tampon 100 mikrolitre ile yıkama iki kez daha tekrarlayın ve toplanan supernatant havuz. El yazması talimatlara göre hazırlanan 300 mikrolitre üre lysis tamponu ekleyerek boncuklardan kapaklı mRNA'yı alın ve karışımı 2-3 dakika boyunca 65 dereceye ısıtın. 300 mikrolitre eluted numuneile 300 mikrolitre fenol:chloroform:izoamyl alkol, karıştırmak için ters ve 10 dakika bekletin.
Numuneyi tekrar hafifçe karıştırın ve iki dakika santrifüj edin. Üst katmanı dikkatlice yeni bir tüpe yerleştirin ve alt katmanı atın. Numuneye 300 mikrolitre 2-propanol ve 30 mikrolitre üç molar sodyum asetat ekleyin, birkaç kez ters çevirin ve 20 saat boyunca eksi 20 derece santigrat koyun.
Kuluçkadan sonra, numuneyi 10 dakika 4 santigrat derecede santrifüj edin. Dikkatle supernatant atın ve beş dakika oda sıcaklığında pelet kuru. Nükleaz içermeyen sudaki peleti yeniden askıya alın ve RNA'nın saflığını ve konsantrasyonu bir spektrofotometre ile ölçün.
Cd8-pozitif hücreleri el yazması yönlere göre izole edin, ardından ticari olarak mevcut manyetik ayırma sistemi arabelleğindeki hücreleri yeniden askıya alın. Hücrelerin her bir mililitre için antikor kokteyl 100 mikrolitre ekleyin ve 15 dakika boyunca buz hücreleri kuluçka. Daha sonra, antikor kokteyl her 100 mikrolitre başına manyetik boncuk 100 mikrolitre ekleyin ve başka bir 15 dakika buz üzerinde hücreleri bırakın.
Kuluçkadan sonra, hücrelere yedi mililitre manyetik ayırma tamponu ekleyin, taze bir tüpe 3-4 mililitre aliquot ekleyin ve tüpü beş dakika boyunca manyetik bir yere yerleştirin. CD8 pozitif hücrelerle sıvıyı buz üzerinde taze bir tüpe ayırın. Daha sonra, manyetik boncuklar için hücrelerin kalan üç ila dört mililitre ekleyin ve beş dakika boyunca mıknatıs üzerinde tüp yerleştirin.
CD8 pozitif hücrelerin ikinci toplu ilk toplu ile tüp için decant. Tohum, 75'teki ortak uyarıcı molekülle birlikte yapışık fibroblast SAMBOK hücreleri ile birlikte, 24 kuyuplakasında her 100 hücreyi ve bunları 37 derecelik bir santigrat, %5 karbondioksit nemlendirilmiş kuluçka makinesinde yetiştirmiştir. 24 saat sonra, APC monolayer'ı Iscove'un modifiye edilmiş Dulbecco'su ile bir kez yıkayın ve el yazması talimatlara göre desteklenen iki mililitre lik orta daki altı saf hücreye 0,5 kat 10 ekleyin.
Kültür hücreleri 20 saat, daha sonra yavaşça medya toplayarak ve iki dakika için 191 kez g hücreleri peletleme yapışmaz OT-I hücreleri hasat. Hücreleri sayın ve b16/F10, işlenmemiş B16/F10-OVA ve Flavopiridol ile önceden işlenmiş B16/F10-OVA hücreleri ile ortak kültürde bire bir oranında tohumlayın. Kültür 37 derece santigrat, 5% karbondioksit nemlendirilmiş inkübatör 20 saat boyunca hücreleri, sonra OT-I CD8-pozitif hücreleri kaldırmak ve PBS yapışık B16/F10-OVA hücreleri yıkayın.
Ekli hücrelerin üç grup trypsinize %05 EDTA'da tripsin ile beş dakika boyunca 191 kez g'de beş dakika peletleyin. Soğuk PBS'de hasat edilen B16/F10-OVA hücrelerini canlılık boyası ve ilgili etiketli antikorlarla kuluçkaya yatırın, ardından akış sitometrisi ile canlılığı analiz edin. Bu protokol, RNA polimeraz II'nin C-terminal tekrar etki alanında serin 2 konumunda derin bir fosforilasyon kaybı ve ekson sınırlarının tanımlanması nda ve kaçak şifreli transkripsiyonların inhibe edilmesinde rol alan H3K36me3'te önemli bir azalma gösteren transkripsiyon uzama kusurlu hücre modeli oluşturmak için kullanılmıştır.
Hücreler, yanlış kapaklı ve poliadenemamış mRNA oranlarıartan kritik mRNA işleme kusurları göstermektedir. Ayrıca bu hücre modelinde anahtar inflamatuar yanıt yolu genlerinin ve Fasl aracılı hücre ölümünün spesifik baskısı gözlenmektedir. Hücre modeli sitotoksik T-hücre saldırısına direnç confers olup olmadığını test etmek için bir keşif testi kronik flavopiridol kaynaklı transkripsiyon uzama defektleri bir anti-tümör bağışıklık atağı kaçış aracı ihsan edebilir gösterir.
Flavopiridol tarafından tedavi edilen B16/F10 hücreleri, OVA genini aşırı ifade eden CD8-pozitif sitotoksik T hücrelerine duyarlı değildi, ova ifade eden hücrelere karşı seçici bir toksisiteye sahip. Flavopiridol ile önceden tedavi edilmeyen hücreler büyük hücre ölümü ile uğrarken, OVA antijenini ifade etmedeki ebeveyn B16/F10 hayatta kaldı. 25-nanomolar flavopiridol tedavisinde fosfoserin 2 ve H3K36 trimethylation düzeyinde azalmanın hem phopsho-STAT1 hem de fosfo-NF-kappaB düzeyinde bir azalma sağlamadığını unutmamak önemlidir.
Her fare karsinom hattı benzersizdir ve JAK1 ve CCNT1 flavopiridol etkisini kurtarabilir. Ayrıca, Bu model doğuştan gelen ve adaptif anti-tümör bağışıklık yanıtlarına karşı TEdeff kanserleri tarafından sunulan direnci izlemek için in vivo kullanılabilir. Örneğin, anti-asialo tedavileri NK hücrelerinin aktivitesini düzenlemek için kullanılabilir, ve bağışıklık kontrol noktası tedavisi TEdeff tümör taşıyan farelere uygulanabilir.
Tümöre infiltrasyon lu lenfosit veya TIL yükü immünoterapide başarının bir göstergesidir. Modelimiz, tedeff kanser mikroortamında immünoterapi öncesi ve sonrası TIL'lerin aktivasyon ve tükenme derecesini keşfetmemizin önünü açmıştır.
