J.H. is supported by NIH K99/R00 Pathway to Independence Award (5K99CA172700) and NCI Brain Cancer SPORE Career Development Award (2P50CA127001).

NOT: Bu protokol tüm adımlar UT MD Anderson Kanser Merkezi tarafından onaylanmıştır. MTERT-ER, alel 1 Üretimi <ol><li> Knock-tanıtılması ERT2-LBD (Ligant Bağlama Alanı) üst ve (intron 2 boyunca ekson 1) mTERT genomik sekans ile çerçeve içinde bir Lox ihtiva eden hedefleme vektörü - fare ES hücreleri içine Füme fragmanı (Şekil 1A) - pgk - neo elektroporasyon ile. </li><li> Kültür 6-10 gün neomisin ES hücreleri. Neomisin dirençli klonlar almak ve 48 gözlü levhalar genleşir. Bir ticari kit kullanılarak genomik DNA ayıklayın ve vuruş-in alel güney lekesi ile onaylayın. </li><li> Ters bir mikroskop altında C57BL içine mikromanipulasyon kiti ile / 6 blastosistler% 95&#39;in üzerinde, normal kromozom iki ES hatları enjekte. Vekil annelerin 23 rahim içine blastosistler implante. C57BL / 6 fe yüksek dereceli erkek Khimaira&#39;da (% 70-90) Mateerkek. </li><li> Güney blot heterozigot mTERT-ERneo hayvanların genotiplendirmesi onaylayın. </li><li> NeoR kaseti silmek için heterozigot mTERT-ERneo hayvanlar ve EIIa-Cre hayvanları Mate. Homozigosite oluşturmak için en az üç kez ve daha fazla arası bir cins heterozigot mTERT ER hayvanlar için, C57BL / 6 hayvan için heterozigot hayvanlar Mate. </li></ol> LSL-mTERT alel 2. Üretim <ol><li> Knock-bir loxP ihtiva eden hedefleme vektörü sunulması - üç Tapa - Yeni - LoxP fragmanını ve elektroporasyon 23, fare ES hücreleri içerisine (ekson 1 ve intron 2, Şekil 1B arasında) mTERT genomik sekans. </li><li> Kültür 6-10 gün neomisin ES hücreleri. Neomisin dirençli klonlar almak ve 48 gözlü levhalar genleşir. Bir ticari kit kullanılarak genomik DNA ayıklayın ve güney blot 23 ile vuruş-in alel onaylayın. </li><li> Injeters bir mikroskop altında bir mikromanipulasyon kiti ile C57BL / 6 blastosist içine% 95 normal karyotipli ct iki ES hatları. Vekil annelerin 23 rahim içine blastosistler implante. C57BL / 6 kadın yüksek dereceli erkek Khimaira&#39;da (% 70-90) Mate. </li><li> Güney blot heterozigot LSL-mTERT hayvanların genotiplendirmesi onaylayın. </li><li> En az üç kez, C57BL / 6 hayvan için heterozigot hayvanlar Mate ve ayrıca arası cins heterozigot LSL-mTERT hayvanlar homozigosite üretir. </li></ol> In vivo mTERT-ER ve LSL-mTERT Farelerde Telomeraz 3. Yeniden MTERT-ER <ol><li> Enjeksiyondan önce tüm cerrahi aletler sterilize. </li><li> % 50 (h / h), oksijen /% 50 (hac / hac): diazot monoksit gazı karışım içinde izofluran odası (indüksiyon için% 4, muhafaza edilmesi için% 2) ile fareler anestezi. Ya da bir ketamin-ksilizin karışımı ile farelerin (100 m uyutmakg / kg vücut ağırlığı, + 10 mg / kg vücut ağırlığı). </li><li> Derin anestezi ulaşıldıktan sonra, indüksiyon odasından anestezi hayvan kaldırmak ve izofluran odasının (% 2) bağlı tüp içinde kendi kafa tutmak. </li><li> Hayvan derinden anestezi sağlamak için farelerin ayak pedleri sıkıştırın. Kurumasını gözleri önlemek için her iki göze merhem koy. Povidon-iyot çözeltisi ile farelerin arkasını silin. </li><li> Arka cilt altında hassas trokar (10 G) ile yavaş salan 4-OHT pelet enjekte edilir ve iki omuz arasındaki orta hatta pelet itin. </li><li> Yara klip uygulayıcı ile kesi Seal ve anestezi kurtarma için fareler izlemek. 10 gün sonra klipleri çıkarın. Prosedür kısaca bitmiş çünkü Ek ısı gerekli değildir. </li><li> 4-OHT topak ile muamele süresi çalışmanın amacı göre optimize edilmelidir. </li></ol> LSL-mTERT için &lt;ol&gt; <li> Tamoksifen (10 mg / ml mısır yağı içinde çözülmüş) (200 ul / 25 g / gün) karın içinden iki ardışık gün enjekte edilir. </li></ol> Nöral Kök Hücre ve In Vitro Telomeraz ve reaktivasyonu 4. İzolasyonu <ol><li> Fareler, karbon dioksit ile kurban edilir ve beyinleri çıkarılır. Üretici başına ticari olarak temin nöral doku ayrışma kiti protokolü izleyin. </li><li> Vorteks fazlası Çözüm 4 için hücre kültürü ortamı, 1 ml ile çözüm 4 etiketli şişe içinde liyofilize toz yeniden süspanse edin. Bu çözelti daha sonra alikotlandı ve daha sonra kullanılmak üzere -20 ° C&#39;de saklanmalıdır. </li><li> Ön ısı kullanılmadan önce 15 dakika için 37 ° C &#39;de bir karışımı. </li><li> Çözüm 1 (50 ul) eklenmiş ve çözelti 2 (1900 ul): enzim karışımı 1 olun. Çözüm 3 (20 ul) eklenmiş ve çözelti 4 (10 ul): enzim karışımı 2 olun. </li><li> 400 mg doku ve vorteks için 1.950 ul enzim karışımı 1 hazırlayın. 37 ° C&#39;de karışım önceden ısıtmakKullanımdan önce 15 dakika. </li><li> 1-gün fare beyinleri çıkarıp, ve koku ampuller ve beyincik kaldırarak forebrains tutun. 4 ° C ve çıkartılması da mağaza çünkü soğuk kültür ortamı, 1 ml ön beyin dokuları tutun. 1 saat içinde nöral doku işlemek için emin olun. </li><li> Sindirim başına 400 mg sınırı aşıldı olmadığından emin olmak için doku ağırlığı belirlemek. 35 mm çaplı Petri kabı kapağının üzerine beyin yerleştirin ve bir neşter kullanılarak beyin ezmek. </li><li> HBSS 1 ml ekleyin, 1 ml pipet kullanarak (a / Ca / Mg o) ve arka bir 15 ml tüp içine pipetle parçalar. HBSS ile durulayın (ağırlık / Ca / Mg o). Santrifüj, oda sıcaklığında 2 dakika boyunca 300 x g &#39;de ve dikkatli bir şekilde süpernatan aspire. </li><li> Önceden ısıtılmış enzim karışımı 1 1950 ul (Solutions 1 ve 2) başına en fazla 400 mg doku ekleyin. Çevirici ya da tüpü her 5 dakika çalkalanarak karıştırılması, 37 ° C&#39;de 15 dakika boyunca, 15 ml bir tüp içinde inkübe edin. </li><li> 20 &amp; # ekleyerek doku örneği başına 30 ul enzim karışımı 2 hazırlayın956; Çözüm 4. 10 ul Çözüm 3 bundan sonra, örnek ilave edin. Karıştırmak için hafifçe ters çevirin. Vorteks etmeyin. </li><li> Mekanik yavaş yukarı ve aşağı pipetleme 10 kez ile geniş uçlu, yangın cilalı Pasteur pipeti kullanarak doku ayırmak. Hava kabarcıkları oluşturan kaçının. </li><li> Tüpü her 3 dakikada bir ters çevirme, 10 dakika boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edilir. </li><li> Adımı 4.11 tekrarlayın ve dokular 200 mg daha büyük ise 4,12 adım. </li><li> 50 ml tüp yerleştirilen 70 mikron hücre süzgecinden, hücre süspansiyonu uygulayın. Hücre süzgecinden 10 ml PBS uygulanır. Oda sıcaklığında 20 dakika boyunca 300 g&#39;da hücre süzgeç ve santrifüj hücre süspansiyonu atın. Aspire tamamen süpernatanlarına. </li><li> Daha fazla uygulamalar için gerekli hacme kök hücre ortamı ile hücrelerin yeniden süspanse. </li><li> , LSL-mTERT NSC&#39;lerde telomeraz aktive iki gün için 100 mcM 4-OHT hücreleri tedavi için. 100 mcM 4 ile kültür ortamında hücreleri tutmak, mTERT-ER NSC&#39;lerde telomeraz etkinleştirmek için-OHT. </li></ol> 5. Telomer BALIK <ol><li> Kültürlenmiş hücrelerden metafaz kromozom hazırlayın. </li><li> FFPE (formalin içerisinde tespit edilmiş parafine gömülmüş) doku kesitleri ksilen içinde deparaffinize ve her biri 5 dakika (% 100,% 90,% 70,% 50 etanol) ve 5 dakika boyunca PBS ile etanol serileri içinde rehidre için. </li><li> Metanol sonrası düzeltme: asetik asit (3: 1) 1-2 saat karıştırıldı. 5 dakika her biri (% 70,% 90,% 100 etanol), ve kuru hava soğuk etanol serisi içinde dehidre olmaktadır. 5 dakika boyunca 37 ° C&#39;de 1x PBS içinde yıkanır. </li><li> 2 dakika için 37 ° C &#39;de% 4 formaldehit içinde kromozom denatüre. Soğuk etanol serileri içinde her biri 5 dakika (% 70,% 90,% 100 etanol), ve kuru hava kurutmak. </li><li> Her slayt PNA melezleme karışımı 12-25 ul uygulayın. (Hibridizasyon karışımı:% 70 formamid, 0.06x SSC,% 0.2 BSA, 0.5 ng / ml tRNA, 0.5 ng / | il telomer veya sentromer problar) </li><li> Kauçuk çimento ile kapak kayma mühür. 4 m, 80 ° C&#39;de post-doğasını kromozom preparatlarıyla ve doku kesitleriiçinde. Oda sıcaklığında melezleşme veya nemli bir oda içinde, 2-4 saat boyunca 37 ° C. </li><li> Yıkama tamponu, 2 x 15 dakika oda sıcaklığında yıkanır. (Yıkama tamponu:% 70 formamid, 0.06x SSC, pH 7.2). PBST ile, oda sıcaklığında, 3 x 5 dakika yıkanır. Mikroskopik inceleme için DAPI veya uzak-kırmızı floresan ile Counter-leke slaytlar. </li></ol>

<ol>
	<li>Bass, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+sequencing+of+colorectal+adenocarcinomas+identifies+a+recurrent+VTI1A-TCF7L2+fusion.">Genomic sequencing of colorectal adenocarcinomas identifies a recurrent VTI1A-TCF7L2 fusion.</a> Nat Genet. 43, 964-968 (2011).</li><li>Beroukhim, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+landscape+of+somatic+copy-number+alteration+across+human+cancers.">The landscape of somatic copy-number alteration across human cancers.</a> Nature. 463, 899-905 (2010).</li><li>Blasco, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomere+shortening+and+tumor+formation+by+mouse+cells+lacking+telomerase+RNA.">Telomere shortening and tumor formation by mouse cells lacking telomerase RNA.</a> Cell. 91, 25-34 (1997).</li><li>Lee, H. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Essential+role+of+mouse+telomerase+in+highly+proliferative+organs.">Essential role of mouse telomerase in highly proliferative organs.</a> Nature. 392, 569-574 (1998).</li><li>Rossi, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deficiencies+in+DNA+damage+repair+limit+the+function+of+haematopoietic+stem+cells+with+age.">Deficiencies in DNA damage repair limit the function of haematopoietic stem cells with age.</a> Nature. 447, 725-729 (2007).</li><li>Wong, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomere+dysfunction+and+Atm+deficiency+compromises+organ+homeostasis+and+accelerates+ageing.">Telomere dysfunction and Atm deficiency compromises organ homeostasis and accelerates ageing.</a> Nature. 421, 643-648 (2003).</li><li>Rudolph, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Longevity,+stress+response,+and+cancer+in+aging+telomerase-deficient+mice.">Longevity, stress response, and cancer in aging telomerase-deficient mice.</a> Cell. 96, 701-712 (1999).</li><li>Wong, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomere+dysfunction+impairs+DNA+repair+and+enhances+sensitivity+to+ionizing+radiation.">Telomere dysfunction impairs DNA repair and enhances sensitivity to ionizing radiation.</a> Nat Genet. 26, 85-88 (2000).</li><li>Ferron, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomere+shortening+and+chromosomal+instability+abrogates+proliferation+of+adult+but+not+embryonic+neural+stem+cells.">Telomere shortening and chromosomal instability abrogates proliferation of adult but not embryonic neural stem cells.</a> Development. 131, 4059-4070 (2004).</li><li>Savage, S. A., Alter, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dyskeratosis+congenita.">Dyskeratosis congenita.</a> Hematol Oncol Clin North Am. 23, 215-231 (2009).</li><li>Armanios, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Syndromes+of+telomere+shortening.">Syndromes of telomere shortening.</a> Annu Rev Genomics Hum Genet. 10, 45-61 (2009).</li><li>Vulliamy, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RNA+component+of+telomerase+is+mutated+in+autosomal+dominant+dyskeratosis+congenita.">The RNA component of telomerase is mutated in autosomal dominant dyskeratosis congenita.</a> Nature. 413, 432-435 (2001).</li><li>Harley, C. B., Harley, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomerase,+checkpoints+and+cancer.">Telomerase, checkpoints and cancer.</a> Cancer surveys. 29, 263-284 (1997).</li><li>Karlseder, J., Broccoli, D., Dai, Y., Hardy, S., de Lange, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p53-+and+ATM-dependent+apoptosis+induced+by+telomeres+lacking+TRF2.">p53- and ATM-dependent apoptosis induced by telomeres lacking TRF2.</a> Science (New York, N.Y.). 283, 1321-1325 (1999).</li><li>Steensel, B., Smogorzewska, A., de Lange, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRF2+protects+human+telomeres+from+end-to-end+fusions.">TRF2 protects human telomeres from end-to-end fusions.</a> Cell. 92, 401-413 (1998).</li><li>Chin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p53+deficiency+rescues+the+adverse+effects+of+telomere+loss+and+cooperates+with+telomere+dysfunction+to+accelerate+carcinogenesis.">p53 deficiency rescues the adverse effects of telomere loss and cooperates with telomere dysfunction to accelerate carcinogenesis.</a> Cell. 97, 527-538 (1999).</li><li>Artandi, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomere+dysfunction+promotes+non-reciprocal+translocations+and+epithelial+cancers+in+mice.">Telomere dysfunction promotes non-reciprocal translocations and epithelial cancers in mice.</a> Nature. 406, 641-645 (2000).</li><li>Rudolph, K. L., Millard, M., Bosenberg, M. W., DePinho, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomere+dysfunction+and+evolution+of+intestinal+carcinoma+in+mice+and+humans.">Telomere dysfunction and evolution of intestinal carcinoma in mice and humans.</a> Nat Genet. 28, 155-159 (2001).</li><li>Greenberg, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short+dysfunctional+telomeres+impair+tumorigenesis+in+the+INK4a(delta2/3)+cancer-prone+mouse.">Short dysfunctional telomeres impair tumorigenesis in the INK4a(delta2/3) cancer-prone mouse.</a> Cell. 97, 515-525 (1999).</li><li>Jaskelioff, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomerase+reactivation+reverses+tissue+degeneration+in+aged+telomerase-deficient+mice.">Telomerase reactivation reverses tissue degeneration in aged telomerase-deficient mice.</a> Nature. 469, 102-106 (2011).</li><li>Hu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antitelomerase+therapy+provokes+ALT+and+mitochondrial+adaptive+mechanisms+in+cancer.">Antitelomerase therapy provokes ALT and mitochondrial adaptive mechanisms in cancer.</a> Cell. 148, 651-663 (2012).</li><li>Ding, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomerase+reactivation+following+telomere+dysfunction+yields+murine+prostate+tumors+with+bone+metastases.">Telomerase reactivation following telomere dysfunction yields murine prostate tumors with bone metastases.</a> Cell. 148, 896-907 (2012).</li><li>Nagy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Manipulating the mouse embryo : a laboratory manual. , (2003).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Burada, iki uyarılabilir kemirgen telomeraz allelleri ve nasıl in vivo ve in vitro telomeraz etkinleştirmek için bir rapor oluşturma. mTERT-ER etkinliğini yeniden aktive edilmesi için kritik bir adım tamoksifen sürekli konsantrasyonunu tutmak, bu yüzden Amerika&#39;nın Yenilikçi Araştırma tarafından üretilen 4-OHT zaman salınımlı pelet kullanmayı tercih. Peletler 60 gün boyunca 1 ng / ml arasında bir sabit durum kan seviyesinde 4OHT serbest tutun. Bir önceki çalışmada, bu strateji ile telomeraz aktivitesini aktive böyle kök hücre bitkinlik, G4 mTERT ER / ER telomer disfonksiyon ile uyarıldığında birden fazla organda doku yaralanması yanıtları ve organ yetmezliği düşüklüğü gibi dejeneratif fenotipleri iyileştirmek mümkün olduğunu gösterdi farenin 20. Yaşlanma telomeraz işlevi çalışmak dışında, bu iki uyarılabilir telomeraz alelleri de kanseri çalışma için de kullanılabilir. Önceki çalışmalarda aldıBu alel avantajı genomları şekillendirme ve T-hücresi timik lenfoma 21 ve prostat kanseri 22 biyolojisini etkileyen telomer yıpratma ve telomeraz reaktivasyonu rolünü araştırmak için. Bu iki çalışma gösterdi ki geç nesil G4 Atm telomer disfonksiyon - / - mTERT ER / ER ve G4 PB-Cre4 PTEN L / L p53 L / L LSL-mTERT L / L fareler için erken mutajenik olayların satın körüklüyor bir mekanizma sağlar Tümör başlatma, henüz tam malign tümörlerin ilerlemesini önler. Telomeraz telomer bozukluğu kaynaklı genomik istikrarsızlık, DNA hasarı kontrol noktaları ve yaygın kromozomal istikrarsızlık bağlamında yeniden zaman böyle prostat kanseri 21 kemik metastazı ve Thymi beyin infiltrasyonu gibi yeni biyolojik özelliklere sahip malign tümörlerin tam ilerlemesini sağlıyordu, bastırıldıc lenfoma 21. Benzer durum daha önce de kolon kanseri ve pankreas kanseri (Dr. Haoqiang Ying Adam Boutin Ronald DePinho kişisel iletişim) dahil olmak üzere diğer kanser türlerinde gözlemlenmiştir. TERS-ER proteini kolayca hayvan tamoksifen veya araç ile muamele edilmiş olmasına bağlı olarak devletler ile kapatılabilir edilebildiği için, mTERT ER alel tarafından üretilen tümör modelleri, anti-telomeraz tedavi test etmek için kullanılabilir. Bir önceki çalışmada, tümörler G4 Atm oluşturulan - / - mTERT ER / ER hayvanlar 4-OHT serbest bırakıldı; telomeraz tükenmesi üzerine, tümörler sonunda nedeniyle telomer disfonksiyonu kaynaklı kontrol noktaları 21 iadesi için küçüldü. Bununla birlikte, yanıt olarak direnç kazanmış bazı tümör Telomerlerin (ALT) mekanizmasının bir alternatif uzatılması etkinleştirerek sönme telomeraz için. Bu ALT + dirençli tümörlerin daha fazla karakterizasyonu bu t gösterdihey mitokondriyal sentezi ve oksidatif savunma PGC-1β bir ana regülatörü olmak üzere mitokondriyal biyoloji ve oksidatif savunma katılan genlerin anormal transkripsiyonunu var. Telomeraz + tümör hücreleri 21 nispeten sağlam kalır tutmak ise PGC-1β veya SOD2 (oksidatif savunma başka bir regülatör) demonte anlamlı ALT + tümör hücrelerini ortadan kaldırır. Bu iki knock-in alel bir sınırlama da telomeraz genin doğal odağı çünkü onlar sadece endojen düzeyde telomeraz reaktivasyonunu gelemez olduğunu. Çok insan kanserlerinde telomeraz aslında çok daha yüksek bir seviyede sentezlenmektedir. Telomeraz düzeyini artırmak için, düşünülebilecek bir modifikasyonu Rosa26 lokusuna PGK (fosfogliserat kinaz) promotörü gibi daha güçlü bir promotör ile mTERT ER yapı sokmaktır. Sonuç olarak, bu iki yeni uyarılabilir kemirgen telomeraz allelleri görülmemiş Genet sağlamakIC araçları, özellikle, önceden elde edilen telomer fonksiyon bozukluklarının neden olduğu genomik instabilite arka altında, yaşlanma ve doku homeostazında gibi tümör ilerlemesinde telomeraz fonksiyonlarını incelemek. mTERT ER alel, diğer tümör eğilimli fare modellerine geçen anti-telomeraz tedavi incelemek için kullanılabilir.

Telomeraz telomer korunmasından sorumlu bir enzimdir. Bunlar bütünlüğünü korumak kromozomların uçlarında tekrar eden diziler bulunmaktadır. telomeraz holoenzimin iç kısım bileşenleri, bir ters transkriptaz, katalitik alt birimi (TERT) ve 1,2 tekrar telomerik eklenmesi için bir şablon olarak hizmet eder, bir RNA alt ünitesi (TERC) &#39;dir. Genellikle farklılaşmış somatik hücrelerde engellenir birlikte, telomeraz sağlam aktivite sergiler ve germ hücreleri, kanser hücrelerinin önemli bir rol oynamaktadır ve kök hücreleri. mTERC ve mTERT knockout farelerde kök hücreleri ve kanser hem de telomeraz fonksiyonlarını incelemek için in vivo model sistemlerinde de büyük sağlar. mTERC ve mTERT fareler (G1) farelerde 3 telomerlerin uzun rezerv nedeniyle herhangi bir belirgin fenotipleri yoktu nakavt. Bununla birlikte, seri son nesil (G5-G6) mTERC ve mTERT fareleri birleştiği sonuçlandısonunda ilerici telomerlerin erozyon ve yüksek çoğalma dokuların 4 ciddi dejenerasyon yarattı. Geç nesil (G5-G6) mTERC - / - fareler nedeniyle testis ve germ hücre tükenmesi apoptoz yüksek oranlarda kısırdır. G5-G6 mTERC - / - farelerde de bağlı doku kök / progenitör hücre bölümlerinde 4 apoptoz ve kusurlu kendini yenileme yeteneği yüksek oranlarda kemik iliği, bağırsak ve deri gibi son derece proliferatif dokularda dejeneratif fenotipleri sergilerler. Geç nesil kemik iliği hematopoetik kök hücre mTERC - / - fareler çoğalma potansiyeli sergileyen kaybı, tehlikeye kendini yenileme özelliği, geliştirilmiş apoptoz ve fonksiyonel olarak tükenme 5,6. - / - Farelerde 7,8 Benzer şekilde, bağırsak kript giderek artan apoptotik cisimler G1-G6 mTERC her bir ardışık üretimi gözlendi. TO işlevsiz telomerlerin zararlı etkilerini ciddi geç nesil (G4-G5) engelli edildi vitro yetişkin nöral kök hücrelerin çoğalmasında ve in vivo nöron hem beri yüksek ciro dokulara sınırlı olması mTERC görünmüyor - / - farelerde 9 . Kök hücrelerin telomeraz rolü daha bazı açılardan 10,11 yaşlanma erken benzer bir nadir insan genetik bozukluk Diskeratosis konjenitanın (DKC), bulgular tarafından desteklenmektedir. DKC dyskerin, çekirdek telomeraz alt birimini, ve diğer dyskerin bağlı proteinler 12 şifreleyen TERC, TERT mutasyonlar ve gen neden olur. Ortalama olarak, DKC hastalarında telomer yaştaki kontrollerin daha kısa 99% vardır. hastalığın önemli morbidite hematopoietik kök hücrelerin kusurlu bakım neden olduğu aplastik anemi, kaynaklanmaktadır. Örneğin oral lökoplaki, tırnak distrofisi, zihinsel retardati gibi hastalık diğer yönleritestis atrofi ve akciğer komplikasyonları, tüm telomeraz nakavt farelerin geç nesil doku kök hücreleri ve progenitör hücreler 10, bu yakın anlaşma bulguların fonksiyonlarını engelli öneririz. DKC hastalar miyelodisplastik sendrom eğilimli ve malign mukozal neoplazmlar bir artış prevalansı. Bu nedenle, insan hastalarda telomeraz eksikliği geç nesil telomeraz nakavt farelerde gözlenen kök hücre fonksiyonları ve tümör yatkınlık kusurları tartışıldı. Kısa telomerlerin ve yüksek telomeraz aktivitesi kanseri özellikleridir. Normal veya premalign hücreler bölmek gibi, DNA çift sarmallı-tatili (DSBs) 13 provoke benzer telomerlerin ve hücresel kontrol noktalarının aktivasyonu nihai erozyon düşük ya da hiç telomeraz aktivitesi sonuçları. Klasik DSBs gibi, telomer bozukluk, yaşlanma ve / veya apoptosi gibi hücresel tepkileri, p53 uyardığı gösterilmiştir ve ilişkilendirilmiştir14,15 s. P53 mutasyon inaktive üzerine, hücre bisiklet ve hücre sağkalım translokasyonları ve bölgesel büyütmesi ve silmeler 16,17 ile karakterize bir yanlısı kanserojen mutator mekanizma sağlar telomer disfonksiyonu olan hücrelerde geliştirilmiştir. Aynı zamanda, telomer disfonksiyonu (hatta p53 boş hücreler) ilişkili yaygın kromozomal instabilite devam Bu tür kanserlerin tam habis ilerlemesi sınırlamak gibi görünmektedir. Örneğin, geç nesil G4-G5 mTERC - / - Ink4a / Arf - / - fareler nedeniyle telomer yıpratma Ink4a / Arf boş fareler ile karşılaştırıldığında önemli ölçüde azaltılmış lenfoma insidansı gösterdi. Başka bir çalışmada ise, G4 mTERT daha gelişmiş adenomatöz lezyonlar - / - APC dk fareler büyük ölçüde nedeniyle önemli bir büyüme yakalanması ve apoptoz 18,19 APC dk fareler ile karşılaştırıldığında bastırıldı.telomer genomik istikrarsızlık disfonksiyonu-uyardığını gözlem tümör ilerlemesi telomeraz aktivasyonu kanser hücre canlılığı ve / veya nötralize p53-bağımlı-bağımsız denetim noktası ya mekanizmaları ile uyumlu bir seviyeye genomik istikrarsızlık bastırılması kısmen malign ilerlemesini sağlayacak olabileceği spekülasyonları ister engeller. Telomeraz reaktivasyonu durdurmak ve hatta kök hücrelerin yaşlanma ters ve telomeraz reaktivasyon genomik istikrarsızlık fonunda tümörogenez teşvik edip edemeyecekleri incelemek amacıyla, iki uyarılabilir kemirgen telomeraz allelleri oluşturdu. İlki 4-hidroksitamoksifen olan (4-OHT) -inducible TERS-Östrojen Reseptör (mTERT-ER) füzyon knock-alel. 4-OHT yokluğunda, mTERT-ER (amacına mTERT ER / ER) için homozigot fareler, telomeraz aktivitesi eksikliği ve geleneksel mTERT veya m ile aynı sitogenetik ve hücre fenotipleri sürdürmekTERC nakavt modeli. 4-OHT yapılan uygulamadan sonra, ters-ER proteini aktivitesi doğal TERT proteini 20, 21 denk düzeylerde geri yüklenebilir. İkinci alel yeni bir uyarılabilir TERS knock-bir intronik loxp-Durdurucu-loxP kaseti içeren alel (LSL- olan mTERT); LSL eksizyonu Cre-aracılı üzerine, mTERT endojen ifade kontrol mekanizmaları 22 altında yeniden ifade edilir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Leica AM6000 Micromanipulation Kit</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Per quote</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica DMI6000 B inverted microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Per quote</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neomycin</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>21810031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>isoflurane vaporizer</td>
			<td>Veterinary Anesthesia Systems</td>
			<td>911103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>isoflurane</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>1005796</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ketamine-xylazine mixture</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>K113-10ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-OHT powder</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H7904-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tamoxfien</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T5648-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-OHT pellet</td>
			<td>Innovative Research of America</td>
			<td>Custermized</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Trochar (10 Gauge)</td>
			<td>Innovative Research of America</td>
			<td>MP-182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>wound clip applier</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>01-804</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>clip</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>01-804-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neural Tissue Dissociation Kit</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-092-628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>14025092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>xylene</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>X3P-1GAL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>methanol</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>A-433S4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>acetic acid</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>A38-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethanol</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>22-032-104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>formamide</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>F84-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PNA telomere probe</td>
			<td>Panagene</td>
			<td>F1001-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PNA centromere probe</td>
			<td>Panagene</td>
			<td>F3003-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20X SSC</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>BP1325-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2153-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tRNA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R5636-1ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>BP337-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rubber cement</td>
			<td>Walmart</td>
			<td>Elmer&#39;s</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

utilizing murine inducible telomerase alleles in the studies of tissue degeneration/regeneration and cancer

Telomer yaşlanma sırasında doku dejenerasyonu neden köklü sürücüler genom bütünlüğü ve ilişkili DNA hasarı sinyalizasyon ve kontrol noktası tepkilerin kaybı olan disfonksiyonu kaynaklı. Insidans oranları büyük ölçüde yaş arttıkça kanser, kısa telomer uzunlukları ve yüksek telomeraz aktivitesi ile karakterize edilir. Yaşlanma ve kanser telomer disfonksiyonu ve telomeraz reaktivasyonu rollerini incelemek için, protokol, iki kemirgen uyarılabilir telomeraz oluşturmak nasıl gösterir knock-allelleri 4-hidroksitamoksifen (4-OHT) -inducible TERS-Östrojen Reseptör (mTERT-ER) ve Lox -Stopper-Lox TERS (LSL-mTERT). protokol telomer disfonksiyonu neden ve in vivo mTERT-ER ve LSL-mTERT farelerde telomeraz aktivitesini yeniden etkinleştirmek için prosedürleri açıklar. Örnek veri telomeraz aktivitesinin yeniden aktive telomer işlev bozukluğunun neden olduğu doku dejeneratif fenotipleri iyileştirebilir göstermektedir. Ord içindeer tümörijenez üzerindeki telomeraz reaktivasyonu etkisini belirlemek için, biz prostat oluşturulan tümör modeli G4 PB-Cre4 PTEN L / L p53 L / L LSL-mTERT L / L ve timus T-hücreli lenfoma modeli G4 Atm - / - mTERT ER / ER . temsili veriler büyük ölçüde tümörogenez artırabilirsiniz telomer disfonksiyonu tarafından uyarılan genomik istikrarsızlık fon bu telomeraz reaktivasyonu göstermektedir. protokol aynı zamanda nöral kök hücreler mTERT-ER ve LSL-mTERT farelerinden (NSC&#39;lerde) izole ve in vitro NSC&#39;lerde telomeraz aktivitesini sokmak için kullanılan prosedürleri açıklamaktadır. temsili veriler telomeraz reaktivasyonu in vitro kendini yenileme yeteneği ve nörogenezi geliştirmek olduğunu göstermektedir. Son olarak, protokol, her iki fare FFPE üzerine telomer FISH (floresan in situ hibridizasyon) gerçekleştirmek için prosedürleri açıklar (Formalin Sabit ve parafınfin Gömülü), beyin dokuları ve kültür hücrelerinin metafaz kromozomları.

stratejiler sıçangil mTERT-ER oluşturmak ve LSL-mTERT knock-allelleri Şekil 1A ve 1 B &#39;de tanımlanmıştır. Spesifik olarak, bir loxP - üç Stoper - Yeni - LoxP fragmanı LSL-mTERT bir alel yaratmak için, ekson 1 ve mTERT lokusunun ekson 2 arasına yerleştirilmiştir. MTERT ER bir alel yaratmak için, mTERT gen ile çerçeve içinde ERT2-LBD nüfuz alanıyla Biz gösterdi ekson 1 N-ucuna yerleştirilmiş olduğu telomeraz geçici 4, 4-OHT peletleri ile muamele edilerek telomer disfonksiyon farelerde yeniden zaman hafta, dejeneratif fenotip birden beyin (Şekil 2A) gibi organ ve testisler (Şekil 2B) &#39;de düzeltilebilir olabilir. Geç kuşak G4 LSL-mTERT ve G4 mTERT in vitro olarak kültürlenen hücrelerde telomeraz aktive etkisini belirlemek amacıyla, izole nöral kök hücreler (NSC&#39;lerde)-ER fareler. Biz telomeraz telomer işlevsiz NSC&#39;lerde yeniden ne zaman, NSC&#39;lerde kendini yenileme yeteneği büyük ölçüde de anlamlı (Şekil 3B) geliştirilmiş oldu (Şekil 3A) artmış, ve in vitro nöron olduğunu gösterdi. Telomer disfonksiyon bağlamında ur gelişimi üzerindeki etkileri telomeraz aktive etkisini belirlemek amacıyla, üretilen PB-Cre4 PTEN L / L, p53 L / L LSL-mTERT L / L (prostat tümör modeli) ve ATM - / - mTERT ER / ER (timik T-hücreli lenfoma modeli) geç nesil kohortlara. Telomeraz 8 haftalık (Şekil 4B) süreyle, enjeksiyon (Şekil 4A) ya da 4-OHT peletler ile bu farelerde tamoksifen tarafından yeniden zaman, tümör oluşumu büyük ölçüde iki prostat tümör modeli (Şekil 4A) ve timus T-hücreli lenfoma modeli olarak geliştirilmiştir ( <strong&gt; Şekil 4B). Son olarak, biz FFPE fare beyin dokularında telomer FISH gerçekleştirme protokolleri (Şekil 5) ve metafaz kromozomları (Şekil 5, ek) bildirdi. <img alt="Şekil 1," src="/files/ftp_upload/52599/52599fig1.jpg" /> Şekil 1: (A) mTERT-ER knock-strateji. Hedefleme vektörü televizyon; AWT vahşi tip alel; KI, knock-in alel; LA, sol kol; RA, sağ kol; E1, ekson 1 &#39;dir; E2, ekson 2; neo pgk neomisin dirençli gen promotör-tahrikli; ER, tadil edilmiş östrojen reseptörü (ERT2) ligandı bağlanma alanı; DT, dyphteria A toksin gen. (B) LSL-mTERT knock-strateji. Hedefleme vektörü televizyon; AWT vahşi tip alel; KI, knock-in alel; LA, sol kol; RA, sağ kol; E1, ekson 1 &#39;dir; E2, ekson 2; neo pgk neomisin dirençli gen promotör-tahrikli; DURDURUCU, üç tekrarlanan transkripsiyon bitiş dizileri; DT, dyphteria A toksin gen. <pfo class = &quot;jove_content&quot;: keep-together.within sayfa = &quot;always&quot;&gt; <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/52599/52599fig2.jpg" /> Şekil 2: Temsilcisi veri telomeraz reaktivasyonu göstermek için organların dejeneratif fenotipleri iyileştiren beyin Temsilcisi görüntüleri (solda). ve testisler (sağ) plasebo ya da 4 hafta boyunca 4-OHT ile tedavi G0 ve G4 mTERT-ER farelerin. Ölçek çubukları 50 um göstermektedir. Yeniden baskı 20 izniyle. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52599/52599fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/52599/52599fig3.jpg" /> Şekil 3:. Temsilci veri telomeraz reaktivasyonu göstermek için kendini yenileme ve in vitro nöral kök hücrelerin nörogenezi artırır (A) nöral kök hücre Temsilcisi görüntüleriG4 LSL-mTERT izole s (üst panel) ve G4 mTERT ER (alt panel), araç ya da 4-OHT ile muamele kök hücre ortamında yetiştirilmesi. (B), farklılaşma ortamında kültürlendi G4 mTERT-ER izole nöral kök hücrelerinin in vitro nöron (Tuj1 +) ve Örnek görüntü (% 1 FBS), araç ya da 4-OHT ile işlemden geçirildi. Ölçek çubukları 100 mikron göstermektedir. <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/52599/52599fig4.jpg" /> Şekil 4:. Telomeraz yeniden aktivasyonunu gösteren Örnek veri genomik instabilite fonunda tümörogenez artırır, (A) / l, p53 L / L LSL-mTERT G0 PB-Cre4 PTEN L kesilmiş prostat tümörlerinin Örnek görüntüleri +/- G4 PB- Cre4 PTEN L / L, p53 L / L LSL-mTERT- / -, Ve G4 PB-Cre4 PTEN L / L, p53 L / L LSL-mTERT L / L tamoksifen ile işlemden geçirildi. 22 izniyle yeniden yazdırın. (B), G0 ATM kesilerek timus T-hücresi lenfomaları temsili görüntüleri - / - mTERT + / ER, G4 Atm - / - mTERT ER / ER araç ile muamele edilmiş ve G4 Atm - / - mTERT ER / ER 4- ile işlemden geçirildi 8 hafta boyunca OHT. Ölçek çubukları 1 cm göstermektedir. <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/52599/52599fig5.jpg" /> Şekil 5: FFPE fare beyin dokusu ve metafaz (içerlek) üzerine telomerik ve sentromerik FISH Temsilcisi görüntüleri. Kırmızı, yeşil telomer boyama gösterir, DNA gösterir, ve mavi ce gösterirntromere lekelenmesi. Ölçek çubukları 1 mm göstermektedir.

Watch this Scientific Journal Video about Utilizing Murine Inducible Telomerase Alleles in the Studies of Tissue Degeneration/Regeneration and Cancer at JoVE.com

Utilizing Murine Inducible Telomerase Alleles in the Studies of Tissue Degeneration/Regeneration and Cancer

Telomere and telomerase play essential roles in ageing and tumorigenesis. The goal of this protocol is to show how to generate two murine inducible telomerase knock-in alleles and how to utilize them in the studies of tissue degeneration/regeneration and cancer.

Doku Dejenerasyonu / Yenilenme ve Kanser Araştırmaları Murin İndüklenebilir Telomeraz allelleri kullanılması

Telomere dysfunction-induced loss of genome integrity and its associated DNA damage signaling and checkpoint responses are well-established drivers that ...

utilizing-murine-inducible-telomerase-alleles-studies-tissue

Research

JoVE Journal

Medicine

9.9K Görüntüleme.  UT MD Anderson Cancer Center. Telomere and telomerase play essential roles in ageing and tumorigenesis. The goal of this protocol is to show how to generate two murine inducible telomerase knock-in alleles and how to utilize them in the studies of tissue degeneration/regeneration and cancer. 

Video: Utilizing Murine Inducible Telomerase Alleles in the Studies of Tissue Degeneration/Regeneration and Cancer

A Method for Murine Islet Isolation and Subcapsular Kidney Transplantation

Since the early pioneering work of Ballinger and Reckard demonstrating that transplantation of islets of Langerhans into diabetic rodents could normalize their blood glucose levels, islet transplantation has been proposed to be a potential treatment for type 1 diabetes 1,2. More recently, advances in human islet transplantation have further strengthened this view 1,3. However, two major limitations prevent islet transplantation from being a widespread clinical reality: (a) the requirement for large numbers of islets per patient, which severely reduces the number of potential recipients, and (b) the need for heavy immunosuppression, which significantly affects the pediatric population of patients due to their vulnerability to long-term immunosuppression. Strategies that can overcome these limitations have the potential to enhance the therapeutic utility of islet transplantation.
Islet transplantation under the mouse kidney capsule is a widely accepted model to investigate various strategies to improve islet transplantation. This experiment requires the isolation of high quality islets and implantation of islets to the diabetic recipients. Both procedures require surgical steps that can be better demonstrated by video than by text. Here, we document the detailed steps for these procedures by both video and written protocol. We also briefly discuss different transplantation models: syngeneic, allogeneic, syngeneic autoimmune, and allogeneic autoimmune.

Transplantation of isolated islets has been proposed to be a potential treatment for type 1 diabetes. Here we describe a method to isolate islets from mouse pancreata and transplant them to the subcapsular space of the kidney.

Murin Islet İzolasyon ve subkapsüler Böbrek Nakli Bir Yöntem

Since the early pioneering work of Ballinger and Reckard demonstrating that transplantation of islets of Langerhans into diabetic rodents could normalize ...

Tıp

An Orthotopic Model of Murine Bladder Cancer

In this straightforward procedure, bladder tumors are established in female C57 mice through the use of catheterization, local cauterization, and subsequent cell adhesion. After their bladders are transurethrally catheterized and drained, animals are again catheterized to permit insertion of a platinum wire into bladders without damaging the urethra or bladder. The catheters are made of Teflon to serve as an insulator for the wire, which will conduct electrical current into the bladder to create a burn injury. An electrocautery unit is used to deliver 2.5W to the exposed end of the wire, burning away extracellular layers and providing attachment sites for carcinoma cells that are delivered in suspension to the bladder through a subsequent catheterization. Cells remain in the bladder for 90 minutes, after which the catheters are removed and the bladders allowed to drain naturally. The development of tumor is monitored via ultrasound. Specific attention is paid to the catheterization technique in the accompanying video.

Bladder tumors are established in female mice in a minimally invasive fashion through catheterization, local cauterization, and subsequent adhesion of carcinoma cells to the burn sites.

Murin Mesane Kanseri bir Ortotopik Model

In this straightforward procedure, bladder tumors are established in female C57 mice through the use of catheterization, local cauterization, and ...

Immunohistochemical Staining of B7-H1 (PD-L1) on Paraffin-embedded Slides of Pancreatic Adenocarcinoma Tissue

B7-H1/PD-L1, a member of the B7 family of immune-regulatory cell-surface proteins, plays an important role in the negative regulation of cell-mediated immune responses through its interaction with its receptor, programmed death-1 (PD-1) 1,2. Overexpression of B7-H1 by tumor cells has been noted in a number of human cancers, including melanoma, glioblastoma, and carcinomas of the lung, breast, colon, ovary, and renal cells, and has been shown to impair anti-tumor T-cell immunity3-8.
Recently, B7-H1 expression by pancreatic adenocarcinoma tissues has been identified as a potential prognostic marker9,10. Additionally, blockade of B7-H1 in a mouse model of pancreatic cancer has been shown to produce an anti-tumor response11. These data suggest the importance of B7-H1 as a potential therapeutic target. Anti-B7-H1 blockade antibodies are therefore being tested in clinical trials for multiple human solid tumors including melanoma and cancers of lung, colon, kidney, stomach and pancreas12.
In order to eventually be able to identify the patients who will benefit from B7-H1 targeting therapies, it is critical to investigate the correlation between expression and localization of B7-H1 and patient response to treatment with B7-H1 blockade antibodies. Examining the expression of B7-H1 in human pancreatic adenocarcinoma tissues through immunohistochemistry will give a better understanding of how this co-inhibitory signaling molecule contributes to the suppression of antitumor immunity in the tumor's microenvironment. The anti-B7-H1 monoclonal antibody (clone 5H1) developed by Chen and coworkers has been shown to produce reliable staining results in cryosections of multiple types of human neoplastic tissues4,8, but staining on paraffin-embedded slides had been a challenge until recently13-18. We have developed the B7-H1 staining protocol for paraffin-embedded slides of pancreatic adenocarcinoma tissues. The B7-H1 staining protocol described here produces consistent membranous and cytoplasmic staining of B7-H1 with little background.

Immunohistochemical Staining of B7-H1 PD-L1 on Paraffin-embedded Slides of Pancreatic Adenocarcinoma Tissue

B7-H1 (PD-L1) and its binding to PD-1 provide a major tumor-induced immunosuppressive signal in the tumor&#x2019;s microenvironment. An immunohistochemical staining technique to characterize the expression and localization of B7-H1 in pancreatic adenocarcinoma is described here.

Pankreas Adenokarsinom Doku B7-H1 immünohistokimyasal boyanma (PD-L1) parafin Slaytlar

B7-H1/PD-L1, a member  of the B7 family of immune-regulatory cell-surface proteins, plays an important  role in the negative regulation of cell-mediated ...

A Preclinical Murine Model of Hepatic Metastases

Numerous murine models have been developed to study human cancers and advance the understanding of cancer treatment and development. Here, a preclinical, murine pancreatic tumor model of hepatic metastases via a hemispleen injection of syngeneic murine pancreatic tumor cells is described. This model mimics many of the clinical conditions in patients with metastatic disease to the liver. Mice consistently develop metastases in the liver allowing for investigation of the metastatic process, experimental therapy testing, and tumor immunology research.

A preclinical, murine model of hepatic metastases performed via a hemispleen injection technique.

Karaciğer metastazları Klinik öncesi fare modeli

Numerous murine models have been developed to study human cancers and advance the understanding of cancer treatment and development. Here, a preclinical, ...

An In Vitro Dormancy Model of Estrogen-sensitive Breast Cancer in the Bone Marrow: A Tool for Molecular Mechanism Studies and Hypothesis Generation

The study of breast cancer dormancy in the bone marrow is an exceptionally difficult undertaking due to the complexity of the interactions of dormant cells with their microenvironment, their rarity and the overwhelming excess of hematopoietic cells. Towards this end, we developed an in vitro 2D clonogenic model of dormancy of estrogen-sensitive breast cancer cells in the bone marrow. The model consists of a few key elements necessary for dormancy. These include 1) the use of estrogen sensitive breast cancer cells, which are the type likely to remain dormant for extended periods, 2) incubation of cells at clonogenic density, where the structural interaction of each cell is primarily with the substratum, 3) fibronectin, a key structural element of the marrow and 4) FGF-2, a growth factor abundantly synthesized by bone marrow stromal cells and heavily deposited in the extracellular matrix. Cells incubated with FGF-2 form dormant clones after 6 days, which consist of 12 or less cells that have a distinct flat appearance, are significantly larger and more spread out than growing cells and have large cytoplasm to nucleus ratios. In contrast, cells incubated without FGF-2 form primarily growing colonies consisting of >30 relatively small cells. Perturbations of the system with antibodies, inhibitors, peptides or nucleic acids on day 3 after incubation can significantly affect various phenotypic and molecular aspects of the dormant cells at 6 days and can be used to assess the roles of membrane-localized or intracellular molecules, factors or signaling pathways on the dormant state or survival of dormant cells. While recognizing the in vitro nature of the assay, it can function as a highly useful tool to glean significant information about the molecular mechanisms necessary for establishment and survival of dormant cells. This data can be used to generate hypotheses to be tested in vivo models.

An In Vitro Dormancy Model of Estrogen-sensitive Breast Cancer in the Bone Marrow: A Tool for Molecular Mechanism Studies and Hypothesis Generation

We developed an in vitro model of dormancy in the bone marrow for estrogen-sensitive breast cancer cells. The goal of this protocol is to demonstrate use of the model for the study of the molecular and cellular biology of dormancy and for generation of hypotheses for subsequent testing in vivo.

Bir<em&gt; In Vitro</em&gt; Kemik İliği östrojen duyarlı Meme Kanseri Dormansi Model: Moleküler Mekanizması Çalışmaları ve Hipotez Üretimi için A Takım

The study of breast cancer dormancy in the bone marrow is an exceptionally difficult undertaking due to the complexity of the interactions of dormant ...

The bm12 Inducible Model of Systemic Lupus Erythematosus (SLE) in C57BL/6 Mice

Systemic lupus erythematosus (SLE) is an autoimmune disease with diverse clinical and immunological manifestations. Several spontaneous and inducible animal models mirror common components of human disease, including the bm12 transfer model. Upon transfer of bm12 splenocytes or purified CD4 T cells, C57BL/6 mice rapidly develop large frequencies of T follicular helper cells (Tfh), germinal center (GC) B cells, and plasma cells followed by high levels of circulating anti-nuclear antibodies. Since this model utilizes mice on a pure C57BL/6 background, researchers can quickly and easily study disease progression in transgenic or knockout mouse strains in a relatively short period of time. Here we describe protocols for the induction of the model and the quantitation Tfh, GC B cells, and plasma cells by multi-color flow cytometry. Importantly, these protocols can also be used to characterize disease in most mouse models of SLE and identify Tfh, GC B cells, and plasma cells in other disease models.

The bm12 Inducible Model of Systemic Lupus Erythematosus SLE in C57BL/6 Mice

The transfer of bm12 lymphocytes into a C57BL/6 recipient is an established model of systemic lupus erythematosus. Here we describe how to initiate disease using this model and how to characterize T follicular helper cells, germinal center B cells and plasma cells by flow cytometry.

C57BL / 6 FARELERDE SLE bm12 İndüklenebilir Modeli (SLE)

Systemic lupus erythematosus (SLE) is an autoimmune disease with diverse clinical and immunological manifestations. Several spontaneous and inducible ...

Pre-clinical Orthotopic Murine Model of Human Prostate Cancer

To study the multifaceted biology of prostate cancer, pre-clinical in vivo models offer a range of options to uncover critical biological information about this disease. The human orthotopic prostate cancer xenograft mouse model provides a useful alternative approach for understanding the specific interactions between genetically and molecularly altered tumor cells, their organ microenvironment, and for evaluation of efficacy of therapeutic regimens. This is a well characterized model designed to study the molecular events of primary tumor development and it recapitulates the early events in the metastatic cascade prior to embolism and entry of tumor cells into the circulation. Thus it allows elucidation of molecular mechanisms underlying the initial phase of metastatic disease. In addition, this model can annotate drug targets of clinical relevance and is a valuable tool to study prostate cancer progression. In this manuscript we describe a detailed procedure to establish a human orthotopic prostate cancer xenograft mouse model.

Prostate cancer is the second most common cause of cancer-related deaths in the United States. An orthotopic cancer model provides a useful approach to understand the biology of prostate cancer and to evaluate the efficacy of therapeutic regimens. This protocol describes detailed steps necessary to establish an orthotopic prostate cancer mouse model.

İnsan Prostat Kanseri klinik öncesi Ortotopik murin modeli

To study the multifaceted biology of prostate cancer, pre-clinical in vivo models offer a range of options to uncover critical biological information ...

Analyzing Beneficial Effects of Nutritional Supplements on Intestinal Epithelial Barrier Functions During Experimental Colitis

Inflammatory bowel diseases (IBD), including Crohn&#39;s disease and ulcerative colitis, are chronic relapsing disorders of the intestines. They cause severe problems, such as abdominal cramping, bloody diarrhea, and weight loss, in affected individuals. Unfortunately, there is no cure yet, and treatments only aim to alleviate symptoms. Current treatments include anti-inflammatory and immunosuppressive drugs that may cause severe side effects. This warrants the search for alternative treatment options, such as nutritional supplements, that do not cause side effects. Before their application in clinical studies, such compounds must be rigorously tested for effectiveness and security in animal models. A reliable experimental model is the dextran sulfate sodium (DSS) colitis model in mice, which reproduces many of the clinical signs of ulcerative colitis in humans. We recently applied this model to test the beneficial effects of a nutritional supplement containing vitamins C and E, L-arginine, and &#969;3-polyunsaturated fatty acids (PUFA). We analyzed various disease parameters and found that this supplement was able to ameliorate edema formation, tissue damage, leukocyte infiltration, oxidative stress, and the production of pro-inflammatory cytokines, leading to an overall improvement in the disease activity index. In this article, we explain in detail the correct application of nutritional supplements using the DSS colitis model in C57Bl/6 mice, as well as how disease parameters such as histology, oxidative stress, and inflammation are assessed. Analyzing the beneficial effects of different diet supplements may then eventually open new avenues for the development of alternative treatment strategies that alleviate IBD symptoms and/or that prolong the phases of remission without causing severe side effects.

Current treatments of inflammatory bowel diseases (IBD) aim at alleviating disease symptoms but may cause severe side effects. Thus, alternative strategies are being investigated in animal colitis models. Here, we explain how the beneficial effects of diet supplements on clinical IBD signs are analyzed in such a colitis model.

Deneysel Kolit sırasında Bağırsak epitel Bariyer Fonksiyonları Üzerine Ek Beslenme Faydalı Etkileri Analizi

Inflammatory bowel diseases (IBD), including Crohn&#39;s disease and ulcerative colitis, are chronic relapsing disorders of the intestines. They cause ...

Generating a Murine Orthotopic Metastatic Breast Cancer Model and Performing Murine Radical Mastectomy

In vivo mouse models to assess breast cancer progression are essential for cancer research, including preclinical drug developments. However, the majority of the practical and technical details are commonly omitted in published manuscripts which, therefore, makes it challenging to reproduce the models, particularly when it involves surgical techniques. Bioluminescence technology allows for the evaluation of small amounts of cancer cells even when a tumor is not palpable. Utilizing luciferase-expressing cancer cells, we establish a breast cancer orthotopic inoculation technique with a high tumorigenesis rate. Lung metastasis is assessed utilizing an ex vivo technique. We, then, establish a mastectomy model with a low local recurrence rate to assess the metastatic tumor burden. Herein, we describe, in detail, the surgical techniques of orthotopic implantation and mastectomy for breast cancer with a high tumorigenesis rate and low local recurrence rates, respectively, to improve breast cancer model efficiency.

We introduce a murine orthotopic breast cancer model and radical mastectomy model with bioluminescence technology to quantify the tumor burden to mimic human breast cancer progression.

Fare Orthotopic metastatik meme kanseri Model oluşturma ve fare radikal mastektomi gerçekleştirme

In vivo mouse models to assess breast cancer progression are essential for cancer research, including preclinical drug developments. However, the majority ...

Immunofluorescence Labelling of Human and Murine Neutrophil Extracellular Traps in Paraffin-Embedded Tissue

Neutrophil granulocytes, also called polymorphonuclear leukocytes (PMN) due to their lobulated nucleus, are the most abundant type of leukocytes. They mature in the bone marrow and are released into the peripheral blood, where they circulate for about 6&#8722;8 h; however, in tissue, they can survive for days. By diapedesis through the endothelium, they leave the blood stream, enter tissues, and migrate towards the site of an infection following chemotactic gradients.&#160;Neutrophils can combat invading microorganisms by phagocytosis,&#160;degranulation, and generation of neutrophil extracellular traps (NETs). This protocol will help to detect NETs in paraffin-embedded tissue. NETs are the result of a process called NETosis, which leads to the release of nuclear, granular, and cytoplasmic components either from living (vital NETosis) or dying (suicidal NETosis) neutrophils. In vitro, NETs form cloud-like structures, which occupy a space several times larger than that of the cells from which they descended. The backbone of NETs is chromatin, to which a selection of proteins and peptides originating from granules and cytoplasm are bound. Thereby, a high local concentration of toxic compounds is maintained so that NETs can capture and inactivate a variety of pathogens including bacteria, fungi, viruses, and parasites, while diffusion of the highly active NET components leading to damage in neighboring tissue is limited. Nevertheless, in recent years it has become apparent that NETs, if generated in abundance or cleared insufficiently, do have pathological potential ranging from autoimmune diseases to cancer. Thus, detection of NETs in tissue samples may have diagnostic significance, and the detection of NETs in diseased tissue can influence the treatment of patients. Since paraffin-embedded tissue samples are the standard specimen used for pathological analysis, it was sought to establish a protocol for fluorescent staining of NET components in paraffin-embedded tissue using commercially available antibodies.

Neutrophil extracellular traps (NETs) are three-dimensional structures generated by stimulated neutrophil granulocytes. It has become clear in recent years that NETs are involved in a wide variety of diseases. Detection of NETs in tissue may have diagnostic relevance, so standardized protocols for labelling NET components are required.

Parafin-Gömülü Dokuda İnsan ve Mürin Nötrofil Ekstrasellüler Tuzaklarının İmmünofloresan Etiketlemesi

Neutrophil granulocytes, also called polymorphonuclear leukocytes (PMN) due to their lobulated nucleus, are the most abundant type of leukocytes. They ...