Name: utilizing murine inducible telomerase alleles in the studies of tissue degeneration/regeneration and cancer
Uploaded: 2015-04-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 34 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Utilizing Murine Inducible Telomerase Alleles in the Studies of Tissue Degeneration/Regeneration and Cancer at JoVE.com

J.H. is supported by NIH K99/R00 Pathway to Independence Award (5K99CA172700) and NCI Brain Cancer SPORE Career Development Award (2P50CA127001).

NOT: Bu protokol tüm adımlar UT MD Anderson Kanser Merkezi tarafından onaylanmıştır. MTERT-ER, alel 1 Üretimi <ol><li> Knock-tanıtılması ERT2-LBD (Ligant Bağlama Alanı) üst ve (intron 2 boyunca ekson 1) mTERT genomik sekans ile çerçeve içinde bir Lox ihtiva eden hedefleme vektörü - fare ES hücreleri içine Füme fragmanı (Şekil 1A) - pgk - neo elektroporasyon ile. </li><li> Kültür 6-10 gün neomisin ES hücreleri. Neomisin dirençli klonlar almak ve 48 gözlü levhalar genleşir. Bir ticari kit kullanılarak genomik DNA ayıklayın ve vuruş-in alel güney lekesi ile onaylayın. </li><li> Ters bir mikroskop altında C57BL içine mikromanipulasyon kiti ile / 6 blastosistler% 95&#39;in üzerinde, normal kromozom iki ES hatları enjekte. Vekil annelerin 23 rahim içine blastosistler implante. C57BL / 6 fe yüksek dereceli erkek Khimaira&#39;da (% 70-90) Mateerkek. </li><li> Güney blot heterozigot mTERT-ERneo hayvanların genotiplendirmesi onaylayın. </li><li> NeoR kaseti silmek için heterozigot mTERT-ERneo hayvanlar ve EIIa-Cre hayvanları Mate. Homozigosite oluşturmak için en az üç kez ve daha fazla arası bir cins heterozigot mTERT ER hayvanlar için, C57BL / 6 hayvan için heterozigot hayvanlar Mate. </li></ol> LSL-mTERT alel 2. Üretim <ol><li> Knock-bir loxP ihtiva eden hedefleme vektörü sunulması - üç Tapa - Yeni - LoxP fragmanını ve elektroporasyon 23, fare ES hücreleri içerisine (ekson 1 ve intron 2, Şekil 1B arasında) mTERT genomik sekans. </li><li> Kültür 6-10 gün neomisin ES hücreleri. Neomisin dirençli klonlar almak ve 48 gözlü levhalar genleşir. Bir ticari kit kullanılarak genomik DNA ayıklayın ve güney blot 23 ile vuruş-in alel onaylayın. </li><li> Injeters bir mikroskop altında bir mikromanipulasyon kiti ile C57BL / 6 blastosist içine% 95 normal karyotipli ct iki ES hatları. Vekil annelerin 23 rahim içine blastosistler implante. C57BL / 6 kadın yüksek dereceli erkek Khimaira&#39;da (% 70-90) Mate. </li><li> Güney blot heterozigot LSL-mTERT hayvanların genotiplendirmesi onaylayın. </li><li> En az üç kez, C57BL / 6 hayvan için heterozigot hayvanlar Mate ve ayrıca arası cins heterozigot LSL-mTERT hayvanlar homozigosite üretir. </li></ol> In vivo mTERT-ER ve LSL-mTERT Farelerde Telomeraz 3. Yeniden MTERT-ER <ol><li> Enjeksiyondan önce tüm cerrahi aletler sterilize. </li><li> % 50 (h / h), oksijen /% 50 (hac / hac): diazot monoksit gazı karışım içinde izofluran odası (indüksiyon için% 4, muhafaza edilmesi için% 2) ile fareler anestezi. Ya da bir ketamin-ksilizin karışımı ile farelerin (100 m uyutmakg / kg vücut ağırlığı, + 10 mg / kg vücut ağırlığı). </li><li> Derin anestezi ulaşıldıktan sonra, indüksiyon odasından anestezi hayvan kaldırmak ve izofluran odasının (% 2) bağlı tüp içinde kendi kafa tutmak. </li><li> Hayvan derinden anestezi sağlamak için farelerin ayak pedleri sıkıştırın. Kurumasını gözleri önlemek için her iki göze merhem koy. Povidon-iyot çözeltisi ile farelerin arkasını silin. </li><li> Arka cilt altında hassas trokar (10 G) ile yavaş salan 4-OHT pelet enjekte edilir ve iki omuz arasındaki orta hatta pelet itin. </li><li> Yara klip uygulayıcı ile kesi Seal ve anestezi kurtarma için fareler izlemek. 10 gün sonra klipleri çıkarın. Prosedür kısaca bitmiş çünkü Ek ısı gerekli değildir. </li><li> 4-OHT topak ile muamele süresi çalışmanın amacı göre optimize edilmelidir. </li></ol> LSL-mTERT için &lt;ol&gt; <li> Tamoksifen (10 mg / ml mısır yağı içinde çözülmüş) (200 ul / 25 g / gün) karın içinden iki ardışık gün enjekte edilir. </li></ol> Nöral Kök Hücre ve In Vitro Telomeraz ve reaktivasyonu 4. İzolasyonu <ol><li> Fareler, karbon dioksit ile kurban edilir ve beyinleri çıkarılır. Üretici başına ticari olarak temin nöral doku ayrışma kiti protokolü izleyin. </li><li> Vorteks fazlası Çözüm 4 için hücre kültürü ortamı, 1 ml ile çözüm 4 etiketli şişe içinde liyofilize toz yeniden süspanse edin. Bu çözelti daha sonra alikotlandı ve daha sonra kullanılmak üzere -20 ° C&#39;de saklanmalıdır. </li><li> Ön ısı kullanılmadan önce 15 dakika için 37 ° C &#39;de bir karışımı. </li><li> Çözüm 1 (50 ul) eklenmiş ve çözelti 2 (1900 ul): enzim karışımı 1 olun. Çözüm 3 (20 ul) eklenmiş ve çözelti 4 (10 ul): enzim karışımı 2 olun. </li><li> 400 mg doku ve vorteks için 1.950 ul enzim karışımı 1 hazırlayın. 37 ° C&#39;de karışım önceden ısıtmakKullanımdan önce 15 dakika. </li><li> 1-gün fare beyinleri çıkarıp, ve koku ampuller ve beyincik kaldırarak forebrains tutun. 4 ° C ve çıkartılması da mağaza çünkü soğuk kültür ortamı, 1 ml ön beyin dokuları tutun. 1 saat içinde nöral doku işlemek için emin olun. </li><li> Sindirim başına 400 mg sınırı aşıldı olmadığından emin olmak için doku ağırlığı belirlemek. 35 mm çaplı Petri kabı kapağının üzerine beyin yerleştirin ve bir neşter kullanılarak beyin ezmek. </li><li> HBSS 1 ml ekleyin, 1 ml pipet kullanarak (a / Ca / Mg o) ve arka bir 15 ml tüp içine pipetle parçalar. HBSS ile durulayın (ağırlık / Ca / Mg o). Santrifüj, oda sıcaklığında 2 dakika boyunca 300 x g &#39;de ve dikkatli bir şekilde süpernatan aspire. </li><li> Önceden ısıtılmış enzim karışımı 1 1950 ul (Solutions 1 ve 2) başına en fazla 400 mg doku ekleyin. Çevirici ya da tüpü her 5 dakika çalkalanarak karıştırılması, 37 ° C&#39;de 15 dakika boyunca, 15 ml bir tüp içinde inkübe edin. </li><li> 20 &amp; # ekleyerek doku örneği başına 30 ul enzim karışımı 2 hazırlayın956; Çözüm 4. 10 ul Çözüm 3 bundan sonra, örnek ilave edin. Karıştırmak için hafifçe ters çevirin. Vorteks etmeyin. </li><li> Mekanik yavaş yukarı ve aşağı pipetleme 10 kez ile geniş uçlu, yangın cilalı Pasteur pipeti kullanarak doku ayırmak. Hava kabarcıkları oluşturan kaçının. </li><li> Tüpü her 3 dakikada bir ters çevirme, 10 dakika boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edilir. </li><li> Adımı 4.11 tekrarlayın ve dokular 200 mg daha büyük ise 4,12 adım. </li><li> 50 ml tüp yerleştirilen 70 mikron hücre süzgecinden, hücre süspansiyonu uygulayın. Hücre süzgecinden 10 ml PBS uygulanır. Oda sıcaklığında 20 dakika boyunca 300 g&#39;da hücre süzgeç ve santrifüj hücre süspansiyonu atın. Aspire tamamen süpernatanlarına. </li><li> Daha fazla uygulamalar için gerekli hacme kök hücre ortamı ile hücrelerin yeniden süspanse. </li><li> , LSL-mTERT NSC&#39;lerde telomeraz aktive iki gün için 100 mcM 4-OHT hücreleri tedavi için. 100 mcM 4 ile kültür ortamında hücreleri tutmak, mTERT-ER NSC&#39;lerde telomeraz etkinleştirmek için-OHT. </li></ol> 5. Telomer BALIK <ol><li> Kültürlenmiş hücrelerden metafaz kromozom hazırlayın. </li><li> FFPE (formalin içerisinde tespit edilmiş parafine gömülmüş) doku kesitleri ksilen içinde deparaffinize ve her biri 5 dakika (% 100,% 90,% 70,% 50 etanol) ve 5 dakika boyunca PBS ile etanol serileri içinde rehidre için. </li><li> Metanol sonrası düzeltme: asetik asit (3: 1) 1-2 saat karıştırıldı. 5 dakika her biri (% 70,% 90,% 100 etanol), ve kuru hava soğuk etanol serisi içinde dehidre olmaktadır. 5 dakika boyunca 37 ° C&#39;de 1x PBS içinde yıkanır. </li><li> 2 dakika için 37 ° C &#39;de% 4 formaldehit içinde kromozom denatüre. Soğuk etanol serileri içinde her biri 5 dakika (% 70,% 90,% 100 etanol), ve kuru hava kurutmak. </li><li> Her slayt PNA melezleme karışımı 12-25 ul uygulayın. (Hibridizasyon karışımı:% 70 formamid, 0.06x SSC,% 0.2 BSA, 0.5 ng / ml tRNA, 0.5 ng / | il telomer veya sentromer problar) </li><li> Kauçuk çimento ile kapak kayma mühür. 4 m, 80 ° C&#39;de post-doğasını kromozom preparatlarıyla ve doku kesitleriiçinde. Oda sıcaklığında melezleşme veya nemli bir oda içinde, 2-4 saat boyunca 37 ° C. </li><li> Yıkama tamponu, 2 x 15 dakika oda sıcaklığında yıkanır. (Yıkama tamponu:% 70 formamid, 0.06x SSC, pH 7.2). PBST ile, oda sıcaklığında, 3 x 5 dakika yıkanır. Mikroskopik inceleme için DAPI veya uzak-kırmızı floresan ile Counter-leke slaytlar. </li></ol>

<ol>
	<li>Bass, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+sequencing+of+colorectal+adenocarcinomas+identifies+a+recurrent+VTI1A-TCF7L2+fusion.">Genomic sequencing of colorectal adenocarcinomas identifies a recurrent VTI1A-TCF7L2 fusion.</a> Nat Genet. 43, 964-968 (2011).</li><li>Beroukhim, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+landscape+of+somatic+copy-number+alteration+across+human+cancers.">The landscape of somatic copy-number alteration across human cancers.</a> Nature. 463, 899-905 (2010).</li><li>Blasco, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomere+shortening+and+tumor+formation+by+mouse+cells+lacking+telomerase+RNA.">Telomere shortening and tumor formation by mouse cells lacking telomerase RNA.</a> Cell. 91, 25-34 (1997).</li><li>Lee, H. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Essential+role+of+mouse+telomerase+in+highly+proliferative+organs.">Essential role of mouse telomerase in highly proliferative organs.</a> Nature. 392, 569-574 (1998).</li><li>Rossi, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deficiencies+in+DNA+damage+repair+limit+the+function+of+haematopoietic+stem+cells+with+age.">Deficiencies in DNA damage repair limit the function of haematopoietic stem cells with age.</a> Nature. 447, 725-729 (2007).</li><li>Wong, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomere+dysfunction+and+Atm+deficiency+compromises+organ+homeostasis+and+accelerates+ageing.">Telomere dysfunction and Atm deficiency compromises organ homeostasis and accelerates ageing.</a> Nature. 421, 643-648 (2003).</li><li>Rudolph, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Longevity,+stress+response,+and+cancer+in+aging+telomerase-deficient+mice.">Longevity, stress response, and cancer in aging telomerase-deficient mice.</a> Cell. 96, 701-712 (1999).</li><li>Wong, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomere+dysfunction+impairs+DNA+repair+and+enhances+sensitivity+to+ionizing+radiation.">Telomere dysfunction impairs DNA repair and enhances sensitivity to ionizing radiation.</a> Nat Genet. 26, 85-88 (2000).</li><li>Ferron, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomere+shortening+and+chromosomal+instability+abrogates+proliferation+of+adult+but+not+embryonic+neural+stem+cells.">Telomere shortening and chromosomal instability abrogates proliferation of adult but not embryonic neural stem cells.</a> Development. 131, 4059-4070 (2004).</li><li>Savage, S. A., Alter, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dyskeratosis+congenita.">Dyskeratosis congenita.</a> Hematol Oncol Clin North Am. 23, 215-231 (2009).</li><li>Armanios, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Syndromes+of+telomere+shortening.">Syndromes of telomere shortening.</a> Annu Rev Genomics Hum Genet. 10, 45-61 (2009).</li><li>Vulliamy, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RNA+component+of+telomerase+is+mutated+in+autosomal+dominant+dyskeratosis+congenita.">The RNA component of telomerase is mutated in autosomal dominant dyskeratosis congenita.</a> Nature. 413, 432-435 (2001).</li><li>Harley, C. B., Harley, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomerase,+checkpoints+and+cancer.">Telomerase, checkpoints and cancer.</a> Cancer surveys. 29, 263-284 (1997).</li><li>Karlseder, J., Broccoli, D., Dai, Y., Hardy, S., de Lange, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p53-+and+ATM-dependent+apoptosis+induced+by+telomeres+lacking+TRF2.">p53- and ATM-dependent apoptosis induced by telomeres lacking TRF2.</a> Science (New York, N.Y.). 283, 1321-1325 (1999).</li><li>Steensel, B., Smogorzewska, A., de Lange, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRF2+protects+human+telomeres+from+end-to-end+fusions.">TRF2 protects human telomeres from end-to-end fusions.</a> Cell. 92, 401-413 (1998).</li><li>Chin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p53+deficiency+rescues+the+adverse+effects+of+telomere+loss+and+cooperates+with+telomere+dysfunction+to+accelerate+carcinogenesis.">p53 deficiency rescues the adverse effects of telomere loss and cooperates with telomere dysfunction to accelerate carcinogenesis.</a> Cell. 97, 527-538 (1999).</li><li>Artandi, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomere+dysfunction+promotes+non-reciprocal+translocations+and+epithelial+cancers+in+mice.">Telomere dysfunction promotes non-reciprocal translocations and epithelial cancers in mice.</a> Nature. 406, 641-645 (2000).</li><li>Rudolph, K. L., Millard, M., Bosenberg, M. W., DePinho, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomere+dysfunction+and+evolution+of+intestinal+carcinoma+in+mice+and+humans.">Telomere dysfunction and evolution of intestinal carcinoma in mice and humans.</a> Nat Genet. 28, 155-159 (2001).</li><li>Greenberg, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short+dysfunctional+telomeres+impair+tumorigenesis+in+the+INK4a(delta2/3)+cancer-prone+mouse.">Short dysfunctional telomeres impair tumorigenesis in the INK4a(delta2/3) cancer-prone mouse.</a> Cell. 97, 515-525 (1999).</li><li>Jaskelioff, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomerase+reactivation+reverses+tissue+degeneration+in+aged+telomerase-deficient+mice.">Telomerase reactivation reverses tissue degeneration in aged telomerase-deficient mice.</a> Nature. 469, 102-106 (2011).</li><li>Hu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antitelomerase+therapy+provokes+ALT+and+mitochondrial+adaptive+mechanisms+in+cancer.">Antitelomerase therapy provokes ALT and mitochondrial adaptive mechanisms in cancer.</a> Cell. 148, 651-663 (2012).</li><li>Ding, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomerase+reactivation+following+telomere+dysfunction+yields+murine+prostate+tumors+with+bone+metastases.">Telomerase reactivation following telomere dysfunction yields murine prostate tumors with bone metastases.</a> Cell. 148, 896-907 (2012).</li><li>Nagy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Manipulating the mouse embryo : a laboratory manual. , (2003).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Burada, iki uyarılabilir kemirgen telomeraz allelleri ve nasıl in vivo ve in vitro telomeraz etkinleştirmek için bir rapor oluşturma. mTERT-ER etkinliğini yeniden aktive edilmesi için kritik bir adım tamoksifen sürekli konsantrasyonunu tutmak, bu yüzden Amerika&#39;nın Yenilikçi Araştırma tarafından üretilen 4-OHT zaman salınımlı pelet kullanmayı tercih. Peletler 60 gün boyunca 1 ng / ml arasında bir sabit durum kan seviyesinde 4OHT serbest tutun. Bir önceki çalışmada, bu strateji ile telomeraz aktivitesini aktive böyle kök hücre bitkinlik, G4 mTERT ER / ER telomer disfonksiyon ile uyarıldığında birden fazla organda doku yaralanması yanıtları ve organ yetmezliği düşüklüğü gibi dejeneratif fenotipleri iyileştirmek mümkün olduğunu gösterdi farenin 20. Yaşlanma telomeraz işlevi çalışmak dışında, bu iki uyarılabilir telomeraz alelleri de kanseri çalışma için de kullanılabilir. Önceki çalışmalarda aldıBu alel avantajı genomları şekillendirme ve T-hücresi timik lenfoma 21 ve prostat kanseri 22 biyolojisini etkileyen telomer yıpratma ve telomeraz reaktivasyonu rolünü araştırmak için. Bu iki çalışma gösterdi ki geç nesil G4 Atm telomer disfonksiyon - / - mTERT ER / ER ve G4 PB-Cre4 PTEN L / L p53 L / L LSL-mTERT L / L fareler için erken mutajenik olayların satın körüklüyor bir mekanizma sağlar Tümör başlatma, henüz tam malign tümörlerin ilerlemesini önler. Telomeraz telomer bozukluğu kaynaklı genomik istikrarsızlık, DNA hasarı kontrol noktaları ve yaygın kromozomal istikrarsızlık bağlamında yeniden zaman böyle prostat kanseri 21 kemik metastazı ve Thymi beyin infiltrasyonu gibi yeni biyolojik özelliklere sahip malign tümörlerin tam ilerlemesini sağlıyordu, bastırıldıc lenfoma 21. Benzer durum daha önce de kolon kanseri ve pankreas kanseri (Dr. Haoqiang Ying Adam Boutin Ronald DePinho kişisel iletişim) dahil olmak üzere diğer kanser türlerinde gözlemlenmiştir. TERS-ER proteini kolayca hayvan tamoksifen veya araç ile muamele edilmiş olmasına bağlı olarak devletler ile kapatılabilir edilebildiği için, mTERT ER alel tarafından üretilen tümör modelleri, anti-telomeraz tedavi test etmek için kullanılabilir. Bir önceki çalışmada, tümörler G4 Atm oluşturulan - / - mTERT ER / ER hayvanlar 4-OHT serbest bırakıldı; telomeraz tükenmesi üzerine, tümörler sonunda nedeniyle telomer disfonksiyonu kaynaklı kontrol noktaları 21 iadesi için küçüldü. Bununla birlikte, yanıt olarak direnç kazanmış bazı tümör Telomerlerin (ALT) mekanizmasının bir alternatif uzatılması etkinleştirerek sönme telomeraz için. Bu ALT + dirençli tümörlerin daha fazla karakterizasyonu bu t gösterdihey mitokondriyal sentezi ve oksidatif savunma PGC-1β bir ana regülatörü olmak üzere mitokondriyal biyoloji ve oksidatif savunma katılan genlerin anormal transkripsiyonunu var. Telomeraz + tümör hücreleri 21 nispeten sağlam kalır tutmak ise PGC-1β veya SOD2 (oksidatif savunma başka bir regülatör) demonte anlamlı ALT + tümör hücrelerini ortadan kaldırır. Bu iki knock-in alel bir sınırlama da telomeraz genin doğal odağı çünkü onlar sadece endojen düzeyde telomeraz reaktivasyonunu gelemez olduğunu. Çok insan kanserlerinde telomeraz aslında çok daha yüksek bir seviyede sentezlenmektedir. Telomeraz düzeyini artırmak için, düşünülebilecek bir modifikasyonu Rosa26 lokusuna PGK (fosfogliserat kinaz) promotörü gibi daha güçlü bir promotör ile mTERT ER yapı sokmaktır. Sonuç olarak, bu iki yeni uyarılabilir kemirgen telomeraz allelleri görülmemiş Genet sağlamakIC araçları, özellikle, önceden elde edilen telomer fonksiyon bozukluklarının neden olduğu genomik instabilite arka altında, yaşlanma ve doku homeostazında gibi tümör ilerlemesinde telomeraz fonksiyonlarını incelemek. mTERT ER alel, diğer tümör eğilimli fare modellerine geçen anti-telomeraz tedavi incelemek için kullanılabilir.

Telomeraz telomer korunmasından sorumlu bir enzimdir. Bunlar bütünlüğünü korumak kromozomların uçlarında tekrar eden diziler bulunmaktadır. telomeraz holoenzimin iç kısım bileşenleri, bir ters transkriptaz, katalitik alt birimi (TERT) ve 1,2 tekrar telomerik eklenmesi için bir şablon olarak hizmet eder, bir RNA alt ünitesi (TERC) &#39;dir. Genellikle farklılaşmış somatik hücrelerde engellenir birlikte, telomeraz sağlam aktivite sergiler ve germ hücreleri, kanser hücrelerinin önemli bir rol oynamaktadır ve kök hücreleri. mTERC ve mTERT knockout farelerde kök hücreleri ve kanser hem de telomeraz fonksiyonlarını incelemek için in vivo model sistemlerinde de büyük sağlar. mTERC ve mTERT fareler (G1) farelerde 3 telomerlerin uzun rezerv nedeniyle herhangi bir belirgin fenotipleri yoktu nakavt. Bununla birlikte, seri son nesil (G5-G6) mTERC ve mTERT fareleri birleştiği sonuçlandısonunda ilerici telomerlerin erozyon ve yüksek çoğalma dokuların 4 ciddi dejenerasyon yarattı. Geç nesil (G5-G6) mTERC - / - fareler nedeniyle testis ve germ hücre tükenmesi apoptoz yüksek oranlarda kısırdır. G5-G6 mTERC - / - farelerde de bağlı doku kök / progenitör hücre bölümlerinde 4 apoptoz ve kusurlu kendini yenileme yeteneği yüksek oranlarda kemik iliği, bağırsak ve deri gibi son derece proliferatif dokularda dejeneratif fenotipleri sergilerler. Geç nesil kemik iliği hematopoetik kök hücre mTERC - / - fareler çoğalma potansiyeli sergileyen kaybı, tehlikeye kendini yenileme özelliği, geliştirilmiş apoptoz ve fonksiyonel olarak tükenme 5,6. - / - Farelerde 7,8 Benzer şekilde, bağırsak kript giderek artan apoptotik cisimler G1-G6 mTERC her bir ardışık üretimi gözlendi. TO işlevsiz telomerlerin zararlı etkilerini ciddi geç nesil (G4-G5) engelli edildi vitro yetişkin nöral kök hücrelerin çoğalmasında ve in vivo nöron hem beri yüksek ciro dokulara sınırlı olması mTERC görünmüyor - / - farelerde 9 . Kök hücrelerin telomeraz rolü daha bazı açılardan 10,11 yaşlanma erken benzer bir nadir insan genetik bozukluk Diskeratosis konjenitanın (DKC), bulgular tarafından desteklenmektedir. DKC dyskerin, çekirdek telomeraz alt birimini, ve diğer dyskerin bağlı proteinler 12 şifreleyen TERC, TERT mutasyonlar ve gen neden olur. Ortalama olarak, DKC hastalarında telomer yaştaki kontrollerin daha kısa 99% vardır. hastalığın önemli morbidite hematopoietik kök hücrelerin kusurlu bakım neden olduğu aplastik anemi, kaynaklanmaktadır. Örneğin oral lökoplaki, tırnak distrofisi, zihinsel retardati gibi hastalık diğer yönleritestis atrofi ve akciğer komplikasyonları, tüm telomeraz nakavt farelerin geç nesil doku kök hücreleri ve progenitör hücreler 10, bu yakın anlaşma bulguların fonksiyonlarını engelli öneririz. DKC hastalar miyelodisplastik sendrom eğilimli ve malign mukozal neoplazmlar bir artış prevalansı. Bu nedenle, insan hastalarda telomeraz eksikliği geç nesil telomeraz nakavt farelerde gözlenen kök hücre fonksiyonları ve tümör yatkınlık kusurları tartışıldı. Kısa telomerlerin ve yüksek telomeraz aktivitesi kanseri özellikleridir. Normal veya premalign hücreler bölmek gibi, DNA çift sarmallı-tatili (DSBs) 13 provoke benzer telomerlerin ve hücresel kontrol noktalarının aktivasyonu nihai erozyon düşük ya da hiç telomeraz aktivitesi sonuçları. Klasik DSBs gibi, telomer bozukluk, yaşlanma ve / veya apoptosi gibi hücresel tepkileri, p53 uyardığı gösterilmiştir ve ilişkilendirilmiştir14,15 s. P53 mutasyon inaktive üzerine, hücre bisiklet ve hücre sağkalım translokasyonları ve bölgesel büyütmesi ve silmeler 16,17 ile karakterize bir yanlısı kanserojen mutator mekanizma sağlar telomer disfonksiyonu olan hücrelerde geliştirilmiştir. Aynı zamanda, telomer disfonksiyonu (hatta p53 boş hücreler) ilişkili yaygın kromozomal instabilite devam Bu tür kanserlerin tam habis ilerlemesi sınırlamak gibi görünmektedir. Örneğin, geç nesil G4-G5 mTERC - / - Ink4a / Arf - / - fareler nedeniyle telomer yıpratma Ink4a / Arf boş fareler ile karşılaştırıldığında önemli ölçüde azaltılmış lenfoma insidansı gösterdi. Başka bir çalışmada ise, G4 mTERT daha gelişmiş adenomatöz lezyonlar - / - APC dk fareler büyük ölçüde nedeniyle önemli bir büyüme yakalanması ve apoptoz 18,19 APC dk fareler ile karşılaştırıldığında bastırıldı.telomer genomik istikrarsızlık disfonksiyonu-uyardığını gözlem tümör ilerlemesi telomeraz aktivasyonu kanser hücre canlılığı ve / veya nötralize p53-bağımlı-bağımsız denetim noktası ya mekanizmaları ile uyumlu bir seviyeye genomik istikrarsızlık bastırılması kısmen malign ilerlemesini sağlayacak olabileceği spekülasyonları ister engeller. Telomeraz reaktivasyonu durdurmak ve hatta kök hücrelerin yaşlanma ters ve telomeraz reaktivasyon genomik istikrarsızlık fonunda tümörogenez teşvik edip edemeyecekleri incelemek amacıyla, iki uyarılabilir kemirgen telomeraz allelleri oluşturdu. İlki 4-hidroksitamoksifen olan (4-OHT) -inducible TERS-Östrojen Reseptör (mTERT-ER) füzyon knock-alel. 4-OHT yokluğunda, mTERT-ER (amacına mTERT ER / ER) için homozigot fareler, telomeraz aktivitesi eksikliği ve geleneksel mTERT veya m ile aynı sitogenetik ve hücre fenotipleri sürdürmekTERC nakavt modeli. 4-OHT yapılan uygulamadan sonra, ters-ER proteini aktivitesi doğal TERT proteini 20, 21 denk düzeylerde geri yüklenebilir. İkinci alel yeni bir uyarılabilir TERS knock-bir intronik loxp-Durdurucu-loxP kaseti içeren alel (LSL- olan mTERT); LSL eksizyonu Cre-aracılı üzerine, mTERT endojen ifade kontrol mekanizmaları 22 altında yeniden ifade edilir.

<table><tbody><tr><td>Leica AM6000 Micromanipulation Kit</td><td>Leica</td><td>Per quote</td><td></td></tr><tr><td>Leica DMI6000 B inverted microscope</td><td>Leica</td><td>Per quote</td><td></td></tr><tr><td>Neomycin</td><td>Life technologies</td><td>21810031</td><td></td></tr><tr><td>isoflurane vaporizer</td><td>Veterinary Anesthesia Systems</td><td>911103</td><td></td></tr><tr><td>isoflurane</td><td>Henry Schein</td><td>1005796</td><td></td></tr><tr><td>ketamine-xylazine mixture</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K113-10ML</td><td></td></tr><tr><td>4-OHT powder</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H7904-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Tamoxfien</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5648-1G</td><td></td></tr><tr><td>4-OHT pellet</td><td>Innovative Research of America</td><td>Custermized</td><td></td></tr><tr><td>Precision Trochar (10 Gauge)</td><td>Innovative Research of America</td><td>MP-182</td><td></td></tr><tr><td>wound clip applier</td><td>Fischer Scientific</td><td>01-804</td><td></td></tr><tr><td>clip</td><td>Fischer Scientific</td><td>01-804-5</td><td></td></tr><tr><td>Neural Tissue Dissociation Kit</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-628</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Life technologies</td><td>14025092</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Life technologies</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>xylene</td><td>Fischer Scientific</td><td>X3P-1GAL</td><td></td></tr><tr><td>methanol</td><td>Fischer Scientific</td><td>A-433S4</td><td></td></tr><tr><td>acetic acid</td><td>Fischer Scientific</td><td>A38-500</td><td></td></tr><tr><td>ethanol</td><td>Fischer Scientific</td><td>22-032-104</td><td></td></tr><tr><td>formamide</td><td>Fischer Scientific</td><td>F84-1</td><td></td></tr><tr><td>PNA telomere probe</td><td>Panagene</td><td>F1001-5</td><td></td></tr><tr><td>PNA centromere probe</td><td>Panagene</td><td>F3003-5</td><td></td></tr><tr><td>20X SSC</td><td>Fischer Scientific</td><td>BP1325-4</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2153-10G</td><td></td></tr><tr><td>tRNA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R5636-1ML</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Fischer Scientific</td><td>BP337-100</td><td></td></tr><tr><td>rubber cement</td><td>Walmart</td><td>Elmer&#039;s</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td></td></tr></tbody></table>

utilizing murine inducible telomerase alleles in the studies of tissue degeneration/regeneration and cancer

Telomer yaşlanma sırasında doku dejenerasyonu neden köklü sürücüler genom bütünlüğü ve ilişkili DNA hasarı sinyalizasyon ve kontrol noktası tepkilerin kaybı olan disfonksiyonu kaynaklı. Insidans oranları büyük ölçüde yaş arttıkça kanser, kısa telomer uzunlukları ve yüksek telomeraz aktivitesi ile karakterize edilir. Yaşlanma ve kanser telomer disfonksiyonu ve telomeraz reaktivasyonu rollerini incelemek için, protokol, iki kemirgen uyarılabilir telomeraz oluşturmak nasıl gösterir knock-allelleri 4-hidroksitamoksifen (4-OHT) -inducible TERS-Östrojen Reseptör (mTERT-ER) ve Lox -Stopper-Lox TERS (LSL-mTERT). protokol telomer disfonksiyonu neden ve in vivo mTERT-ER ve LSL-mTERT farelerde telomeraz aktivitesini yeniden etkinleştirmek için prosedürleri açıklar. Örnek veri telomeraz aktivitesinin yeniden aktive telomer işlev bozukluğunun neden olduğu doku dejeneratif fenotipleri iyileştirebilir göstermektedir. Ord içindeer tümörijenez üzerindeki telomeraz reaktivasyonu etkisini belirlemek için, biz prostat oluşturulan tümör modeli G4 PB-Cre4 PTEN L / L p53 L / L LSL-mTERT L / L ve timus T-hücreli lenfoma modeli G4 Atm - / - mTERT ER / ER . temsili veriler büyük ölçüde tümörogenez artırabilirsiniz telomer disfonksiyonu tarafından uyarılan genomik istikrarsızlık fon bu telomeraz reaktivasyonu göstermektedir. protokol aynı zamanda nöral kök hücreler mTERT-ER ve LSL-mTERT farelerinden (NSC&#39;lerde) izole ve in vitro NSC&#39;lerde telomeraz aktivitesini sokmak için kullanılan prosedürleri açıklamaktadır. temsili veriler telomeraz reaktivasyonu in vitro kendini yenileme yeteneği ve nörogenezi geliştirmek olduğunu göstermektedir. Son olarak, protokol, her iki fare FFPE üzerine telomer FISH (floresan in situ hibridizasyon) gerçekleştirmek için prosedürleri açıklar (Formalin Sabit ve parafınfin Gömülü), beyin dokuları ve kültür hücrelerinin metafaz kromozomları.

stratejiler sıçangil mTERT-ER oluşturmak ve LSL-mTERT knock-allelleri Şekil 1A ve 1 B &#39;de tanımlanmıştır. Spesifik olarak, bir loxP - üç Stoper - Yeni - LoxP fragmanı LSL-mTERT bir alel yaratmak için, ekson 1 ve mTERT lokusunun ekson 2 arasına yerleştirilmiştir. MTERT ER bir alel yaratmak için, mTERT gen ile çerçeve içinde ERT2-LBD nüfuz alanıyla Biz gösterdi ekson 1 N-ucuna yerleştirilmiş olduğu telomeraz geçici 4, 4-OHT peletleri ile muamele edilerek telomer disfonksiyon farelerde yeniden zaman hafta, dejeneratif fenotip birden beyin (Şekil 2A) gibi organ ve testisler (Şekil 2B) &#39;de düzeltilebilir olabilir. Geç kuşak G4 LSL-mTERT ve G4 mTERT in vitro olarak kültürlenen hücrelerde telomeraz aktive etkisini belirlemek amacıyla, izole nöral kök hücreler (NSC&#39;lerde)-ER fareler. Biz telomeraz telomer işlevsiz NSC&#39;lerde yeniden ne zaman, NSC&#39;lerde kendini yenileme yeteneği büyük ölçüde de anlamlı (Şekil 3B) geliştirilmiş oldu (Şekil 3A) artmış, ve in vitro nöron olduğunu gösterdi. Telomer disfonksiyon bağlamında ur gelişimi üzerindeki etkileri telomeraz aktive etkisini belirlemek amacıyla, üretilen PB-Cre4 PTEN L / L, p53 L / L LSL-mTERT L / L (prostat tümör modeli) ve ATM - / - mTERT ER / ER (timik T-hücreli lenfoma modeli) geç nesil kohortlara. Telomeraz 8 haftalık (Şekil 4B) süreyle, enjeksiyon (Şekil 4A) ya da 4-OHT peletler ile bu farelerde tamoksifen tarafından yeniden zaman, tümör oluşumu büyük ölçüde iki prostat tümör modeli (Şekil 4A) ve timus T-hücreli lenfoma modeli olarak geliştirilmiştir ( <strong&gt; Şekil 4B). Son olarak, biz FFPE fare beyin dokularında telomer FISH gerçekleştirme protokolleri (Şekil 5) ve metafaz kromozomları (Şekil 5, ek) bildirdi. <img alt="Şekil 1," src="/files/ftp_upload/52599/52599fig1.jpg" /> Şekil 1: (A) mTERT-ER knock-strateji. Hedefleme vektörü televizyon; AWT vahşi tip alel; KI, knock-in alel; LA, sol kol; RA, sağ kol; E1, ekson 1 &#39;dir; E2, ekson 2; neo pgk neomisin dirençli gen promotör-tahrikli; ER, tadil edilmiş östrojen reseptörü (ERT2) ligandı bağlanma alanı; DT, dyphteria A toksin gen. (B) LSL-mTERT knock-strateji. Hedefleme vektörü televizyon; AWT vahşi tip alel; KI, knock-in alel; LA, sol kol; RA, sağ kol; E1, ekson 1 &#39;dir; E2, ekson 2; neo pgk neomisin dirençli gen promotör-tahrikli; DURDURUCU, üç tekrarlanan transkripsiyon bitiş dizileri; DT, dyphteria A toksin gen. <pfo class = &quot;jove_content&quot;: keep-together.within sayfa = &quot;always&quot;&gt; <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/52599/52599fig2.jpg" /> Şekil 2: Temsilcisi veri telomeraz reaktivasyonu göstermek için organların dejeneratif fenotipleri iyileştiren beyin Temsilcisi görüntüleri (solda). ve testisler (sağ) plasebo ya da 4 hafta boyunca 4-OHT ile tedavi G0 ve G4 mTERT-ER farelerin. Ölçek çubukları 50 um göstermektedir. Yeniden baskı 20 izniyle. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52599/52599fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/52599/52599fig3.jpg" /> Şekil 3:. Temsilci veri telomeraz reaktivasyonu göstermek için kendini yenileme ve in vitro nöral kök hücrelerin nörogenezi artırır (A) nöral kök hücre Temsilcisi görüntüleriG4 LSL-mTERT izole s (üst panel) ve G4 mTERT ER (alt panel), araç ya da 4-OHT ile muamele kök hücre ortamında yetiştirilmesi. (B), farklılaşma ortamında kültürlendi G4 mTERT-ER izole nöral kök hücrelerinin in vitro nöron (Tuj1 +) ve Örnek görüntü (% 1 FBS), araç ya da 4-OHT ile işlemden geçirildi. Ölçek çubukları 100 mikron göstermektedir. <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/52599/52599fig4.jpg" /> Şekil 4:. Telomeraz yeniden aktivasyonunu gösteren Örnek veri genomik instabilite fonunda tümörogenez artırır, (A) / l, p53 L / L LSL-mTERT G0 PB-Cre4 PTEN L kesilmiş prostat tümörlerinin Örnek görüntüleri +/- G4 PB- Cre4 PTEN L / L, p53 L / L LSL-mTERT- / -, Ve G4 PB-Cre4 PTEN L / L, p53 L / L LSL-mTERT L / L tamoksifen ile işlemden geçirildi. 22 izniyle yeniden yazdırın. (B), G0 ATM kesilerek timus T-hücresi lenfomaları temsili görüntüleri - / - mTERT + / ER, G4 Atm - / - mTERT ER / ER araç ile muamele edilmiş ve G4 Atm - / - mTERT ER / ER 4- ile işlemden geçirildi 8 hafta boyunca OHT. Ölçek çubukları 1 cm göstermektedir. <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/52599/52599fig5.jpg" /> Şekil 5: FFPE fare beyin dokusu ve metafaz (içerlek) üzerine telomerik ve sentromerik FISH Temsilcisi görüntüleri. Kırmızı, yeşil telomer boyama gösterir, DNA gösterir, ve mavi ce gösterirntromere lekelenmesi. Ölçek çubukları 1 mm göstermektedir.

Watch this Scientific Journal Video about Utilizing Murine Inducible Telomerase Alleles in the Studies of Tissue Degeneration/Regeneration and Cancer at JoVE.com

Utilizing Murine Inducible Telomerase Alleles in the Studies of Tissue Degeneration/Regeneration and Cancer

Telomere and telomerase play essential roles in ageing and tumorigenesis. The goal of this protocol is to show how to generate two murine inducible telomerase knock-in alleles and how to utilize them in the studies of tissue degeneration/regeneration and cancer.

Doku Dejenerasyonu / Yenilenme ve Kanser Araştırmaları Murin İndüklenebilir Telomeraz allelleri kullanılması

Telomere dysfunction-induced loss of genome integrity and its associated DNA damage signaling and checkpoint responses are well-established drivers that ...

utilizing-murine-inducible-telomerase-alleles-studies-tissue

Research

JoVE Journal

Medicine

10.2K Görüntüleme.  UT MD Anderson Cancer Center. Telomere and telomerase play essential roles in ageing and tumorigenesis. The goal of this protocol is to show how to generate two murine inducible telomerase knock-in alleles and how to utilize them in the studies of tissue degeneration/regeneration and cancer. 

Video: Utilizing Murine Inducible Telomerase Alleles in the Studies of Tissue Degeneration/Regeneration and Cancer

Identification and Characterization of Metastatic Factors by Gene Transfer into the Novel RIP-Tag; RIP-tva Murine Model

Metastatic cancer accounts for 90% of deaths in patients with solid tumors. There is an urgent need to better understand the drivers of cancer metastasis and to identify novel therapeutic targets. To investigate molecular events that drive the progression from primary cancer to metastasis, we have developed a bitransgenic mouse model, RIP-Tag; RIP-tva. In this mouse model, the rat insulin promoter (RIP) drives the expression of the SV40 T antigen (Tag) and the receptor for subgroup A avian leukosis virus (tva) in pancreatic &#946; cells. The mice develop pancreatic neuroendocrine tumors with 100% penetrance through well-defined stages that are similar to human tumorigenesis, with stages including hyperplasia, angiogenesis, adenoma, and invasive carcinoma. Because RIP-Tag; RIP-tva mice do not develop metastatic disease, genetic alterations that promote metastasis can be identified easily. Somatic gene transfer into tva-expressing, proliferating pancreatic &#946; premalignant lesions is achieved through intracardiac injection of avian retroviruses harboring the desired genetic alteration. A titer of &#62;1 x 108 infectious units per ml is considered appropriate for in vivo infection. In addition, avian retroviruses can infect cell lines derived from tumors in RIP-Tag; RIP-tva mice with high efficiency. The cell lines can also be used to characterize the metastatic factors. Here we demonstrate how to utilize this mouse model and cell lines to assess the functions of candidate genes in tumor metastasis.

Identification and Characterization of Metastatic Factors by Gene Transfer into the Novel RIP-Tag; RIP-tva Murine Model

We present a protocol to demonstrate a novel somatic gene transfer system utilizing RIP-Tag; RIP-tva mouse model to study the function of genes in metastasis. The avian retroviruses are delivered intracardiacally to ensure gene transfer into pre-malignant, noninvasive lesions of pancreatic &#946; cells in adult mice.

Kimlik ve metastatik faktörler gen transferi ile karakterizasyonu roman RIP-etiketinin içine; RIP-tva fare modeli

Metastatic cancer accounts for 90% of deaths in patients with solid tumors. There is an urgent need to better understand the drivers of cancer metastasis ...

Kanser Araştırmaları

Generation of Cancer Cell Clones to Visualize Telomeric Repeat-containing RNA TERRA Expressed from a Single Telomere in Living Cells

Telomeres are transcribed, giving rise to telomeric repeat-containing long noncoding RNAs (TERRA), which have been proposed to play important roles in telomere biology, including heterochromatin formation and telomere length homeostasis. Recent findings revealed that TERRA molecules also interact with internal chromosomal regions to regulate gene expression in mouse embryonic stem (ES) cells. In line with this evidence, RNA fluorescence in situ hybridization (RNA-FISH) analyses have shown that only a subset of TERRA transcripts localize at chromosome ends. A better understanding of the dynamics of TERRA molecules will help define their function and mechanisms of action. Here, we describe a method to label and visualize single-telomere TERRA transcripts in cancer cells using the MS2-GFP system. To this aim, we present a protocol to generate stable clones, using the AGS human stomach cancer cell line, containing MS2 sequences integrated at a single subtelomere. Transcription of TERRA from the MS2-tagged telomere results in the expression of MS2-tagged TERRA molecules that are visualized by live-cell fluorescence microscopy upon co-expression of a MS2 RNA-binding protein fused to GFP (MS2-GFP). This approach enables researchers to study the dynamics of single-telomere TERRA molecules in cancer cells, and it can be applied to other cell lines.

Here, we present a protocol to generate cancer cell clones containing a MS2 sequence tag at a single subtelomere. This approach, relying on the MS2-GFP system, enables visualization of the endogenous transcripts of telomeric repeat-containing RNA (TERRA) expressed from a single telomere in living cells.

Canlı hücreler içinde tek bir telomer üzerinden ifade Telomeric tekrar içeren RNA TERRA görselleştirmek için kanser hücre klonlar nesil

Telomeres are transcribed, giving rise to telomeric repeat-containing long noncoding RNAs (TERRA), which have been proposed to play important roles in ...

Genetik

DNA Vector-based RNA Interference to Study Gene Function in Cancer

RNA interference (RNAi) inhibits gene expression by specifically degrading target mRNAs. Since the discovery of double-stranded small interference RNA (siRNA) in gene silencing1, RNAi has become a powerful research tool in gene function studies. Compared to genetic deletion, RNAi-mediated gene silencing possesses many advantages, such as the ease with which it is carried out and its suitability to most cell lines. Multiple studies have demonstrated the applications of RNAi technology in cancer research. In particular, the development of the DNA vector-based technology to produce small hairpin RNA (shRNA) driven by the U6 or H1 promoter has made long term and inducible gene silencing possible2,3. Its use in combination with genetically engineered viral vectors, such as lentivirus, facilitates high efficiencies of shRNA delivery and/or integration into genomic DNA for stable shRNA expression. 
We describe a detailed procedure using the DNA vector-based RNAi technology to determine gene function, including construction of lentiviral vectors expressing shRNA, lentivirus production and cell infection, and functional studies using a mouse xenograft model. 
Various strategies have been reported in generating shRNA constructs. The protocol described here employing PCR amplification and a 3-fragment ligation can be used to directly and efficiently generate shRNA-containing lentiviral constructs without leaving any extra nucleotide adjacent to a shRNA coding sequence. Since the shRNA-expression cassettes created by this strategy can be cut out by restriction enzymes, they can be easily moved to other vectors with different fluorescent or antibiotic markers. Most commercial transfection reagents can be used in lentivirus production. However, in this report, we provide an economic method using calcium phosphate precipitation that can achieve over 90% transfection efficiency in 293T cells. Compared to constitutive shRNA expression vectors, an inducible shRNA system is particularly suitable to knocking down a gene essential to cell proliferation. We demonstrate the gene silencing of Yin Yang 1 (YY1), a potential oncogene in breast cancer4,5, by a Tet-On inducible shRNA system and its effects on tumor formation. Research using lentivirus requires review and approval of a biosafety protocol by the Biosafety Committee of a researcher's institution. Research using animal models requires review and approval of an animal protocol by the Animal Care and Use Committee (ACUC) of a researcher's institution.

RNA interference (RNAi) possesses many advantages over gene knockout and has been broadly used as a tool in gene functional studies. The invention of DNA vector-based RNAi technology has made long term and inducible gene knockdown possible, and also increased the feasibility of gene silencing in vivo.

Kanser gen Fonksiyon Eğitim için DNA vektör tabanlı RNA Girişim

RNA interference (RNAi) inhibits gene expression by specifically degrading target mRNAs. Since the discovery of double-stranded small interference RNA ...

Tıp

Spatial and Temporal Control of Murine Melanoma Initiation from Mutant Melanocyte Stem Cells

Cutaneous melanoma is well known as the most aggressive skin cancer. Although the risk factors and major genetic alterations continue to be documented with increasing depth, the incidence rate of cutaneous melanoma has shown a rapid and continuous increase during recent decades. In order to find effective preventative methods, it is important to understand the early steps of melanoma initiation in the skin. Previous data has demonstrated that follicular melanocyte stem cells (MCSCs) in the adult skin tissues can act as melanoma cells of origin when expressing oncogenic mutations and genetic alterations. Tumorigenesis arising from melanoma-prone MCSCs can be induced when MCSCs transition from a quiescent to active state. This transition in melanoma-prone MCSCs can be promoted by the modulation of either hair follicle stem cells&#39; activity state or through extrinsic environmental factors such as ultraviolet-B (UV-B). These factors can be artificially manipulated in the laboratory by chemical depilation, which causes transition of hair follicle stem cells and MCSCs from a quiescent to active state, and by UV-B exposure using a benchtop light. These methods provide successful spatial and temporal control of cutaneous melanoma initiation in the murine dorsal skin. Therefore, these in vivo model systems will be valuable to define the early steps of cutaneous melanoma initiation and could be used to test potential methods for tumor prevention.

The following procedure describes a method for spatial and temporal control of melanocytic tumor initiation in murine dorsal skin, using a genetically engineered mouse model. This protocol describes macroscopic as well as microscopic cutaneous melanoma initiation.

Mutant melanosit kök hücrelerinden Murine Melanoma başlangıcı uzamsal ve temporal kontrol

Cutaneous melanoma is well known as the most aggressive skin cancer. Although the risk factors and major genetic alterations continue to be documented ...

A Murine Cell Line Based Model of Chronic CDK9 Inhibition to Study Widespread Non-Genetic Transcriptional Elongation Defects (TEdeff) in Cancers

We have previously reported that a subset of cancers is defined by global transcriptional deregulations with widespread deficiencies in mRNA transcription elongation (TE)&#8212;we call such cancers as TEdeff. Notably, TEdeff cancers are characterized by spurious transcription and faulty mRNA processing in a large set of genes, such as interferon/JAK/STAT and TNF/NF-&#954;B pathways, leading to their suppression. The TEdeff subtype of tumors in renal cell carcinoma and metastatic melanoma patients significantly correlate with poor response and outcome in immunotherapy. Given the importance of investigating TEdeff cancers&#8212;as it portends a significant roadblock against immunotherapy&#8212;the goal of this protocol is to establish an in vitro TEdeff mouse model to study these widespread, non-genetic transcriptional abnormalities in cancers and gain new insights, novel uses for existing drugs, or find new strategies against such cancers. We detail the use of chronic flavopiridol mediated CDK9 inhibition to abrogate phosphorylation of serine 2 residue on the C-terminal repeat domain (CTD) of RNA polymerase II (RNA Pol II), suppressing the release of RNA Pol II into productive transcription elongation. Given that TEdeff cancers are not classified under any specific somatic mutation, a pharmacological model is advantageous, and best mimics the widespread transcriptional and epigenetic defects observed in them. The use of an optimized sublethal dose of flavopiridol is the only efficacious strategy in creating a generalizable model of non-genetic widespread disruption in transcription elongation and mRNA processing defects, closely mimicking the clinically observed TEdeff characteristics. Therefore, this model of TEdeff can be leveraged to dissect, cell-autonomous factors enabling them in resisting immune-mediated cell attack.

A Murine Cell Line Based Model of Chronic CDK9 Inhibition to Study Widespread Non-Genetic Transcriptional Elongation Defects TEdeff in Cancers

The protocol details an in vitro murine carcinoma model of non-genetic defective transcription elongation. Here, chronic inhibition of CDK9 is used to repress productive elongation of RNA Pol II along pro-inflammatory response genes to mimic and study the clinically observed TEdeff phenomenon, present in about 20% of all cancer types.

Kanserlerde Yaygın Genetik Olmayan TranskripsiyonEl Uzaması Defektlerini (TEkesinlikle)Incelemek için Kronik CDK9 İnhibisyonu Bir Murine Hücre Hattı Tabanlı Modeli

We have previously reported that a subset of cancers is defined by global transcriptional deregulations with widespread deficiencies in mRNA transcription ...

Time-lapse Imaging of Primary Preneoplastic Mammary Epithelial Cells Derived from Genetically Engineered Mouse Models of Breast Cancer

Time-lapse imaging can be used to compare behavior of cultured primary preneoplastic mammary epithelial cells derived from different genetically engineered mouse models of breast cancer. For example, time between cell divisions (cell lifetimes), apoptotic cell numbers, evolution of morphological changes, and mechanism of colony formation can be quantified and compared in cells carrying specific genetic lesions. Primary mammary epithelial cell cultures are generated from mammary glands without palpable tumor. Glands are carefully resected with clear separation from adjacent muscle, lymph nodes are removed, and single-cell suspensions of enriched mammary epithelial cells are generated by mincing mammary tissue followed by enzymatic dissociation and filtration. Single-cell suspensions are plated and placed directly under a microscope within an incubator chamber for live-cell imaging. Sixteen 650 &mu;m x 700 &mu;m fields in a 4x4 configuration from each well of a 6-well plate are imaged every 15 min for 5 days. Time-lapse images are examined directly to measure cellular behaviors that can include mechanism and frequency of cell colony formation within the first 24 hr of plating the cells (aggregation versus cell proliferation), incidence of apoptosis, and phasing of morphological changes. Single-cell tracking is used to generate cell fate maps for measurement of individual cell lifetimes and investigation of cell division patterns. Quantitative data are statistically analyzed to assess for significant differences in behavior correlated with specific genetic lesions.

Time-lapse imaging is used to assess behavior of primary preneoplastic mammary epithelial cells derived from genetically engineered mouse models of breast cancer risk to determine if there are correlations between specific behavioral parameters and distinct genetic lesions.

Birincil Preneoplastic Meme Epitel Hücrelerinin Time-lapse görüntüleme Meme Kanseri Genetik Fare Modelleri türetilen

Time-lapse  imaging can be used to compare behavior of cultured primary preneoplastic  mammary epithelial cells derived from different genetically ...

Spontaneous Murine Model of Anaplastic Thyroid Cancer

Anaplastic thyroid cancer (ATC) is a rare but lethal malignancy with a dismal prognosis. There is an urgent need for more in-depth research on the carcinogenesis and development of ATC, as well as therapeutic methods, since standard treatments are essentially depleted in ATC patients. However, low prevalence has hampered thorough clinical studies and the collection of tissue samples, so little progress has been achieved in creating effective treatments. We used genetic engineering to create a conditionally inducible ATC murine model (mATC) in a C57BL/6 background. The ATC murine model was genotyped by TPO-cre/ERT2; BrafCA/wt; Trp53ex2-10/ex2-10 and induced by intraperitoneal injection with tamoxifen. With the murine model, we investigated the tumor dynamics (tumor size ranged from 12.4 mm2 to 32.5 mm2 after 4 months of induction), survival (the median survival period was 130 days), and metastasis (lung metastases occurred in 91.6% of mice) curves and pathological features (characterized by Cd8, Foxp3, F4/80, Cd206, Ki67, and Caspase-3 immunohistochemical staining). The results indicated that spontaneous mATC possesses highly similar tumor dynamics and immunological microenvironment to human ATC tumors. In conclusion, with high similarity in pathophysiological features and unified genotypes, the mATC model resolved the shortage of clinical ATC tissue and sample heterogeneity to some extent. Therefore, it would facilitate the mechanism and translational studies of ATC and provide an approach to investigate the treatment potential of small molecular drugs and immunotherapy agents for ATC.

Here, we present a standard pipeline to obtain murine ATC tumors by spontaneous genetically engineered mouse models. Further, we present tumor dynamics and pathological information about the primary and metastasized lesions. This model will help researchers to understand tumorigenesis and facilitate drug discoveries.

Anaplastik Tiroid Kanserinin Spontan Murin Modeli

Anaplastic thyroid cancer (ATC) is a rare but lethal malignancy with a dismal prognosis. There is an urgent need for more in-depth research on the ...

Studying the Role of Alveolar Macrophages in Breast Cancer Metastasis

This paper describes the application of the syngeneic model of breast cancer (4T1) to the studies on a role of pulmonary alveolar macrophages in cancer metastasis. The 4T1 cells expressing GFP in combination with imaging and confocal microscopy are used to monitor tumor growth, track metastasizing tumor cells, and quantify the metastatic burden. These approaches are supplemented by digital histopathology that allows the automated and unbiased quantification of metastases. In this method the routinely prepared histological lung sections, which are stained with hematoxylin and eosin, are scanned and converted to the digital slides that are then analyzed by the self-trained pattern recognition software. In addition, we describe the flow cytometry approaches with the use of multiple cell surface markers to identify alveolar macrophages in the lungs. To determine impact of alveolar macrophages on metastases and antitumor immunity these cells are depleted with the clodronate-containing liposomes administrated intranasally to tumor-bearing mice. This approach leads to the specific and efficient depletion of this cell population as confirmed by flow cytometry. Tumor volumes and lung metastases are evaluated in mice depleted of alveolar macrophages, to determine the role of these cells in the metastatic progression of breast cancer.

Here we describe the model and approach to study functions of pulmonary alveolar macrophages in cancer metastasis. To demonstrate the role of these cells in metastasis, the syngeneic (4T1) model of breast cancer in conjunction with the depletion of alveolar macrophage with clodronate liposomes was used.

Meme Kanseri Metastaz alveoler makrofajlar Rolü incelenmesi

This paper describes the application of the syngeneic model of breast cancer (4T1) to the studies on a role of pulmonary alveolar macrophages in cancer ...

Dual Bioluminescence Imaging of Tumor Progression and Angiogenesis

Angiogenesis, as a crucial process of tumor progression, has become a research hotspot and target of anti-tumor therapy. However, there is no reliable model for tracing tumor progression and angiogenesis simultaneously in a visual and sensitive manner. Bioluminescence imaging displays its unique superiority in living imaging due to its advantages of high sensitivity, strong specificity, and accurate measurement. Presented here is a protocol to establish a tumor-bearing mouse model by injecting a Renilla luciferase-labeled murine breast cancer cell line 4T1 into the transgenic mouse with angiogenesis-induced Firefly luciferase expression. This mouse model provides a valuable tool to simultaneously monitor tumor progression and angiogenesis in real-time by dual bioluminescence imaging in a single mouse. This model may be widely applied in anti-tumor drug screening and oncology research.

This protocol describes the establishment of a tumor-bearing mouse model to monitor tumor progression and angiogenesis in real-time by dual bioluminescence imaging.

Tümör Ilerlemesi ve anjiyogenezinin çift Bioluminescence görüntülenmesi

Angiogenesis, as a crucial process of tumor progression, has become a research hotspot and target of anti-tumor therapy. However, there is no reliable ...

Lineage Tracing of Inducible Fluorescently-Labeled Stem Cells in the Adult Mouse Brain

A telomerase reverse transcriptase (Tert) lineage-tracing mouse line was developed to investigate the behavior and fate of adult tissue stem cells, by crossing the &#39;Tet-On&#39; system oTet-Cre mouse with a novel reverse tetracycline transactivator (rtTA) transgene linked to the Tert promoter, which we have demonstrated marks a novel population of adult brain stem cells. Here, administration of the tetracycline derivative doxycycline to mTert-rtTA::oTet-Cre mice will indelibly mark a population of cells that express a 4.4 kb fragment of the promoter region of the gene Tert. When combined the Rosa-mTmG reporter, mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG mice will express membrane tdTomato (mTomato) until doxycycline treatment induces the replacement of mTomato expression with membrane EGFP (mGFP) in cells that also express Tert. Therefore, when these triple-transgenic lineage tracing mice receive doxycycline (the &#34;pulse&#34; period during which TERT expressing cells are marked), these cells will become indelibly marked mGFP+ cells, which can be tracked for any desirable amount of time after doxycycline removal (the &#34;chase&#34; period), even if Tert expression is subsequently lost. Brains are then perfusion-fixed and processed for immunofluorescence and other downstream applications in order to interpret changes to stem cell activation, proliferation, lineage commitment, migration to various brain niches, and differentiation to mature cell types. Using this system, any rtTA mouse can be mated to oTet-Cre and a Rosa reporter to conduct doxycycline-inducible &#34;pulse-chase&#34; lineage&#160;tracing experiments using markers of stem cells.

The ability to permanently mark stem cells and their progeny with a fluorophore using an inducible transgenic lineage tracing mouse line allows for spatial and temporal analysis of activation, proliferation, migration, and/or differentiation in vivo. Lineage tracing can reveal novel information about lineage commitment, response to intervention(s), and multipotency.

Yetişkin Fare Beynindeki İndüklenebilir Floresan Etiketli Kök Hücrelerin Soy İzi

A telomerase reverse transcriptase (Tert) lineage-tracing mouse line was developed to investigate the behavior and fate of adult tissue stem cells, by ...