Bu protokol önemlidir, çünkü dondurulmuş doku kullanımı birden fazla doku değerlendirilirken lojistiği kolaylaştırır, analiz için uzak bir laboratuvara numune transferine izin verir ve bir dokuyu aylarca analiz etme kararının ertelenmesini sağlar. Bu tekniğin en büyük avantajı, dondurulmuş küp dokusunun nekropsi de kuyruklu yıldız testinde eğitilmiş personel gerektirmemesi ve numune manipülasyonu sırasında ortaya çıkan teknik hatalar ve mekanik DNA hasarı için fırsatı en aza indirmesidir. Bu teknik, klinik öncesi ilaç geliştirme, çevreye giren kimyasalların güvenlik değerlendirmesi ve gıda katkı maddeleri uygulamasına sahiptir.
Dondurulmuş dokular, kuyruklu yıldız testinde genotoksik potansiyeli, DNA onarımı, kemoterapi veya radyasyonun neden olduğu DNA hasarına karşı koruyucu etkiler ve çevresel biyo-izleme için kullanılabilir. İdeal olarak, deneyler bir sonraki hayvandan alınan organlar işleme için kullanılabilir hale gelmeden önce dondurucu adıma her doku örneğinin işlenmesine izin vermek için tasarlanmalıdır. Dondurulmuş dokular, genotoksik potansiyeli, DNA onarımı, kemoterapi veya radyasyonun neden olduğu DNA hasarına karşı koruyucu etkiler ve çevresel biyo-izleme için kuyruklu yıldız testinde dava edilebilir.
Teknik eğitmen Carole Bobbitt ve araştırmacı toksikoloji laboratuvar yöneticisi Eileen Gilas bugün prosectors olarak hizmet verecek. Araştırma görevlisi Lincoln Martin ve histoloji teknisyeni Amelie Ladesseur örnek işleme sergileyecekler. Bu prosedürü başlatmak için, herhangi bir bağlı bağlı doku kaldırmak, organlar, ve enkaz ilgi bir organdan.
Hemen kalıntı kan ve enkaz kaldırmak için soğuk, taze hazırlanmış kıyma çözeltisi yaklaşık yedi mililitre içeren orta büyüklükte tartmak teknede şiddetle organ swish. Başka bir temiz tartma tekne doku batık tutmak ve daha fazla işleme kadar buz üzerinde tutmak için yeterli soğuk kıyma solüsyonu içeren için organ aktarın. Karaciğer için, sol lob beş milimetre uzunlamasına bir bölümünü kesti ve yavaşça soğuk kıyma çözeltisi yaklaşık yedi mililitre swish.
Daha sonra temiz bir orta boy tartmak tekne içine doku şerit yerleştirin soğuk kıyma çözeltisi yaklaşık yedi mililitre içeren ve daha fazla işlemeye hazır olana kadar buz üzerinde korumak. Karaciğerin bir bölümünü çıkarın ve bir gömme kaset içine yerleştirin. Gelecekteki histopatoloji değerlendirmesi için laboratuvar standart prosedürlerine göre sabitleme, budama ve parafin katıştırma işlemlerini gerçekleştirin.
Duodenum için, mideye duodenum proksimal 10 milimetrelik bir kısmını kesti. Duodenumun bir ucuna 21 ila 25 gauge iğne yerleştirin ve herhangi bir enkaz ve bakteri kaldırmak için soğuk kıyma çözeltisi bir mililitre ile floş. Duodenumu ters çevirin, bir mililitre kıyma çözeltisi ile tekrar temizle ve iğneyi atın.
Duodenumu açın ve yaklaşık yedi mililitre kıyma çözeltisinde durulayın. Daha sonra duodenumu tekrar durulayın ve daha fazla işlemeye hazır olana kadar buz üzerinde kıyma çözeltisinde saklayın. Daha önce karaciğer için açıklandığı gibi gelecekteki histopatoloji değerlendirmesi için kalan duodenumun bir kısmını kesin ve onarın.
Beyin için, ilk iki yarımküreye beyin bölmek için yararlı olabilir, bir yarımküre olası histopatoloji için kaydedilmiş olan. İlgi beyin bölgeleri incelemek, sonra yavaşça durulayın, ve daha fazla işlemeye hazır olana kadar kıyma çözeltisi buz üzerinde korumak, karaciğer ve duodenum için daha önce açıklandığı gibi. Mide için, kaldırmak ve önmide atın.
Glandüler mideyi kesin ve yaklaşık yedi mililitre soğuk kıyma tamponu içeren orta boy bir tartı teknesinde swishing tarafından gıda ücretsiz yıkayın. Daha önce açıklandığı gibi olası histopatoloji değerlendirmesi için fiksasyon için duodenuma beş milimetrelik salgı bezi mide proksimal şeridi çıkarın. Kalan mideyi yaklaşık yedi mililitre soğuk kıyma tamponu içeren orta boy bir tartı teknesine yerleştirin ve 15 ila 30 dakika boyunca buz üzerinde kuluçkaya yatırın.
Bundan sonra, parafin temiz bir parça mide aktarın ve hafifçe enkaz kaldırmak için en az iki kez yüzey epitel kazımak için bir neşter bıçak veya plastik hücre kazıyıcı kullanın. Forceps ile mide mukozası almak ve soğuk kıyma tampon bir mililitre ile durulamak için bir pipet kullanın. Durulanan mide dokusunu temiz bir yüzeye veya tabağa aktarın ve soğuk kıyma solüsyonu ekleyin.
Hücreleri serbest bırakmak için mide epitelini 4-5 kez dikkatlice kazımak için neşter bıçağının veya plastik bir hücre kazıyıcının arkasını kullanın. Daha sonra, serbest bırakılan hücreleri içeren kıyma çözeltisi toplamak için bir pipet kullanın ve buz üzerinde bir mikrosantrifüj tüpü ne aktarın. Doku örnekleri kıyma için, karaciğer, beyin veya duodenum bir bölümünü kesmek ve soğuk kıyma çözeltisi bir mililitre içeren etiketli bir mikrosantrifüj tüp aktarın.
Numunenin soğuk kalmasını sağlarken, numunenin sonunda dağılına kadar hızlı bir şekilde kıyma yapmak için kıyma makasını kullanın. Örnek biraz bulutlu görünmelidir. Ancak, tüpün altına yerleşecek bazı parçaların kalması yaygındır.
Bu taze iken doku kullanmak için, buz üzerinde örnekleri içeren tüpler imuhafaza. Doku örneklerini dondurmak için, kıyma veya toplama hemen sonra tüpün kapağını sabitleyin ve tüp sıvı nitrojen içeren bir Dewar şişesine bırakın. Doku hasat sonunda, örnek tüpleralmak için bir kepçe kullanın ve sıralamak için kuru buz üzerine yerleştirin.
Tüpleri kuru buz üzerindeki bir dondurucu kutusuna aktarın ve kutuyu eksi 80 derecede bir dondurucuda saklayın. Doku dondurulmuş küpler hazırlamak için, doku birkaç küçük parçalar kesilmiş ve tek tek bir orta ölçekli tartmak tekne veya birkaç saniye için sıvı nitrojen içeren diğer uygun gemi içine doğrudan bırakın. Parçalar tamamen donduktan sonra, dondurulmuş doku küplerini tek tek etiketli mikrosantrifüj tüplere veya kriyo-tüplere kuru buza aktarın.
Doku hasadı sonunda, tüpleri kuru buz üzerindeki bir dondurucu kutusuna aktarın ve kutuyu eksi 800 santigrat derecede bir dondurucuda saklayın. Isliç buz üzerinde muhafaza taze kıyılmış veya kazınmış doku kullanırken, hasat bir saat içinde kuyruklu yıldız slaytlar hazırlamak. Dondurulmuş kıyma veya kazınmış doku kullanırken, numuneler tamamen çözülene kadar dondurulmuş doku tüplerini oda sıcaklığında bir su banyosuna yerleştirin ve soğuk tutulmalarını sağlar.
Örnekler çözüldükten sonra tüpleri hemen buza aktarın. Küplenmiş doku için, dondurucudan küpleri içeren tüpleri alın ve slayt hazırlanına kadar kuru buzüzerinde muhafaza edin. Aliquot tüccar ın orta veya bir kıyma çözeltisi bir mililitre etiketli içine 1.7 mililitre mikrosantrifüj tüp her örnek için ve buz üzerinde korumak.
Erimeönlemek için hızla çalışma, bir oda sıcaklığında doku kıyma cihazının açık sonuna doku bir küp yerleştirin. Hızlı bir şekilde cihaza bir boyut eşleşen şırınga dalgıç eklemek daha sonra soğuk kıyma çözeltisi içeren mikrocentrifuge tüp içine yerleştirilmelidir örgü ucuna doku itmek için. Dokunun tamamen erimesini sağlamak için cihazın örgü ucunu soğuk kıyma çözeltisinde yaklaşık 5 ila 10 saniye batırın.
Hücreler örgü gözenekleri ile ekstrüzyon görülene kadar tamamen piston depress. Daha sonra pistiyi yaklaşık 2,5 santimetre yukarı çekin ve tekrar tamamen bastırın. Kıyma çözeltisi bulanık hale gelene kadar birkaç kez tekrarlayın.
Slaythazırlamak için, bir hücre süspansiyonuna nazikçe karıştırın ve 50 mikrolitreyi %0,5 düşük erime noktası içeren bir tüpe aktarın. Slaytları metin protokolünde belirtildiği şekilde hazırlayın ve puanlayın. İlk çalışmada, karaciğer erkek Sprague Dawley araç kontrol sıçanlar iki kohortbir hafta tarafından sendeledi hasat edildi.
Slaytlar taze kıyılmış doku, dondurulmuş kıyma doku ve dondurulmuş küp doku hazırlandı. OECD taze sıçan karaciğerinde yüzde kuyruk DNA'sı için önerilen üst sınır %6 olduğundan, bu sonuçlar donma yöntemlerinin doku ları değerlendirmek için iyi iş çıkarabileceğini göstermektedir. Genel olarak, yüzde kirpiyüzde kuyruk DNA paralel, dondurulmuş dokular daha fazla değişkenlik sergiledi rağmen.
İkinci çalışmada, dişi B6C3F1 farelere araç veya mutajen etil metansülfonat uygulandı. Yüzde kuyruk DNA sonuçları karaciğer dokusu küpler olarak dondurulmuş ve daha sonra doku kıyma cihazı kullanılarak işlenmiş çok taze kıyılmış doku için elde edilen sonuçlar ait olduğunu göstermektedir. Her üç yöntemle işlenen doku örneklerinde EMS kaynaklı DNA hasarında istatistiksel olarak anlamlı bir artış ölçüldü.
Üçüncü çalışmada, 90 günlük kimyasal toksisite çalışmasında dişi B6C3F1 farelerinden alınan karaciğer örnekleri analiz edildi. Dondurulmuş kıyma dokusundaki DNA hasarı tüm doz gruplarında yüksekti ve hayvan değişkenliğine kadar önemli bir hayvanvardı. Yüzde kuyruk DNA sonuçları kirpilerin yüzde kirpilerle ilişkili olduğunu gösteriyor, bu da kirpilerin bu örneklerde gözlenen yüksek DNA hasarına önemli ölçüde katkıda bulunduğunu gösteriyor.
Buna karşılık, hem DNA hasarlı ve yüzde kirpi kıyma doku örnekleri paralel olarak hazırlanmış flaş dondurulmuş küp doku çok düşüktü. Böylece, kıyma doku örneklerinde kirpi olarak kendini gösteren yüksek hasarlı hücreler biyolojik bir sürecin sonucu değildi, ancak büyük olasılıkla mekanik bozulma ile tanıtıldı, ve, ya da dondurulmadan önce kıyma işlemi sırasında doku ısınması. Bu nedenle, kıyma doku için veri güvenilmez olarak kabul edildi.
Buna karşılık, uzun süreli depolama sonra bile, dondurulmuş küp doku dan yüksek kaliteli veri elde edildi. Hasat edilen dokuları soğuk ve nemli tutmak ve numuneleri dondurmak için hızlı bir şekilde çalışmak çok önemlidir. Ayrıca, dondurulmuş küp doku homojenizasyon adımı hemen önce çözülmüş olmalıdır.
Dondurulmuş doku örnekleri oksidatif hasarı veya çapraz bağlanmayı saptamak için kuyruklu yıldız testinin modifikasyonları ve gen ekspresyonundaki değişikliklerin değerlendirilmesi gibi diğer downstream uygulamaları için uygundur. Dokuları kesmek veya kazımak için neşter bıçaklarını kullanırken ve donma işlemi sırasında sıvı nitrojeni kullanırken dikkatli olunmalıdır.
