Biz mali oksidatif stres üzerinde araştırma desteklemek için, Triesen Liechtenstein, LHW Stiftung teşekkür etmek istiyorum.

Basel Üniversitesi&#39;nde gerçekleştirilen comet ile ilgili çalışmalar, Göz Hastalıkları Anabilim Dalı Basel Yerel Etik Kurulu tarafından kabul edildi Reaktifler 1. Hazırlık <ol><li> Dulbecco Fosfat Tamponlu Salin (PBS) (Ca ++, Mg ++ serbest) PBS (1 L paket) ve ortam dH 2 O 990 ml ekleyerek çözeltisi hazırlayın. 7.4&#39;e pH ayarlayın. Oda sıcaklığında saklayın. </li><li> Yokedici çözelti hazırlayın: 1000 mi dH 2 O içinde 2.5 M NaCl (146.1 g), 100 mM EDTA (37.2 g) ve 10 mM Trizma bazı (1.2 g) ekleyin hazırlamak için </li><li> 1500 mi dH 2 O 10 M NaOH, 30 ml ve 7.5 ml arasında 0.2M EDTA, QS ekleyerek elektroforez tamponu (300 mM NaOH / 1 mM EDTA) hazırlayın ve iyice karıştırın. toplam hacim jel kutu kapasitesine bağlıdır. Önceki&gt; 13 olan bir pH sağlamak için tampon pH ölçümü, kullanımı. </li><li> 0.4 M Tris ihtiva eden nötralizasyon tamponu hazırlayın (&amp; # konsantre edildi, (48.5 g ~ 800 mi dH 2, O, pH&#39;ı 7.5&#39;e ayarlamak üzere eklenmiştir)62; dH 2 O ile 10 M HCI) 1,000 ml Oda sıcaklığında çözelti saklayın. </li><li> Boyama çözüm hazırlayın. Etidyum bromür (EtBr; 10x stok, 20 ug / ml), oda sıcaklığında 50 mi dH 2 O ve mağaza EtBr 10 mg ekleyin. 1x Stok - 9 ml dH 2 O ile 1 ml karıştırın DİKKATLİ! Bilinen bir kanserojen olarak yeterli önlem ile EtBr tutun. </li></ol> Lökosit 2. izolasyonu <ol><li> Venöz ponksiyon ile heparin gibi bir anti-pıhtılaştırıcı, insan kan örnekleri (20 mi) elde edilir. </li><li> Böyle Histopaque bir yoğunluk gradyan hücre ayırıcı kullanılarak lenfositleri ayırın. <ol><li> 600 ul hücre ayırıcı sıvı üzerinde 1 PBS veya (FBS&#39;siz) RPMI oranı ve katmanın: Kısaca, 1 kan sulandırmak. </li><li> 4 ° C&#39;de 20 dakika boyunca santrifüje 1800 x g. PBS / RPMI 3-5 ml &#39;Buffy&#39; kat aspire ve lenfositler pelet 10 dakika boyunca 300 x g&#39;de santrifüj edilir. </li><li> (Sadece PBS arasındaki sınır yukarıdan RPMI lenfositleri AlBir pipet kullanarak) ve hücre ayırıcı sıvı. Plazma ve her bir tüp hücre ayırıcı sıvı katman arasındaki ara lökosit bantları çıkarın ve bir 50 ml tüp içine toplar. </li></ol></li><li> Soğuk Dulbecco Modifiye Edilmiş Eagle Ortamı (DMEM) ile 50 ml toplam hacmi getirmek. 10 dakika boyunca 300 x g&#39;de hücre süspansiyonu DMEM ile üç kez yıkayın. </li><li> Bir hemositometre kullanılarak hücrelerin toplam sayıları sayın. PBS hücrelerin askıya alma ve 10 7 hücre / tüp mikrosantrifüj tüpler içine veya or. </li><li> Pipet 5 ml&#39;lik bir plastik tek bir tüp içine hücre 0.4 ml. 40 ° C de 1.2 ml% 1 düşük jelleşme sıcaklıklı agaroz ekleyin. Karıştırın ve hızlı bir şekilde ve bir önceden kaplanmış sürgünün agaroz kaplı yüzey üzerine hücre süspansiyonu 1.2 ml pipetleyin. Kabarcıklar üreten kaçının. </li><li> Agaroz, yaklaşık 2 dakika boyunca jel izin verin. Jelleşme için kullanılan zaman ve sıcaklık ile tutarlı olun ve bu agaroz tamamen lizis çözeltisi içinde daldırarak önce ayarlanmış olduğundan emin olun. S tamamen sonraet, ~ 4 ° C&#39;de çözüm parçalama içine daldırın. </li></ol> 3. Lizis ve elektroforez NOT: açıklanan prosedür pH&gt; 13 alkali koşullar altında elektroforez içindir. <ol><li> ~ 4 ° C&#39;de en az 2 saat sonra, yavaşça parçalama Çözüm slaytları çıkarın. Yer mümkün olduğunca birbirine onları yakın kayma, bir ucu yakınında yatay jel kutusunun yan yana slaytlar. </li><li> Sıvı seviyesi tamamen slaytlar (agaroz üzerinde kabarcıkları önlemek) kapsar kadar taze yapılmış pH&gt; 13 elektroforez tamponu ile tampon rezervuarları doldurun. </li><li> 20 dakika DNA çözülmesi ve aside karşı duyarlı bir hasar ekspresyonuna izin vermek için kızağı alkalin tampon içinde bekletin. </li><li> 25 volt (~ 0.75 V / cm) güç kaynağı açın ve yükseltilmesi veya tampon seviyesini düşürerek 300 miliamper akım ayarlayın. 30 dakika boyunca slaytlar Electrophorese. </li><li> Gücü kapatın. Yavaşça tamponu ve p slaytlar asansörbir drenaj tepsisine dantel. Bilge kaplamaz nötralizasyon Tampon slaytlar bırakın. Slaytlar en az 5 dakika bekletin. Slaytlar boşaltın ve iki kez daha tekrarlayın. </li><li> 80 ul 1x Etidyum Bromür (EtBr) ile slaytlar Leke ve 5 dakika bekletin ve daha sonra fazla leke çıkarmak için soğuk distile su daldırma. Ardından slayt üzerinde bir lamel yerleştirin ve hemen saklayın. Mağaza kuru koşullarda oda sıcaklığında bir ay boyunca kayar. Not: Diğer DNA lekeleri (örneğin, SYBR yeşili) de kullanılabilir. Dikkat! En boyalar mutajenik olduğu gibi koruyucu eldiven giyin. </li></ol> DNA Breaks 4. sayısallaştırılması <ol><li> DNA hasarını görselleştirmek için, 40X objektif floresan mikroskop altında EtBr lekeli DNA slayt gözlemleyin. </li><li> DNA göçünü uzunluğu ve göç DNA (Şekil 1A) yüzdesinin ölçülmesiyle hücrelerinde nicel DNA hasarını değerlendirmek. Bagaj an ve Zeytin-Mome DNA hasarını (Şekil 1B) ölçmeknt. Kuyruk Moment ve Zeytin -Moment tanımları önceden 8-10 verilmiştir. NOT: Bizim tecrübelerimize göre bu parametrelerden biri tarafından sopa yeter. Hücreler mikroskop lamı ve fotoğraflar hücreleri üzerinde tarar otomatik bir araç ayarlayarak fotoğraflandı. DNA kırılmalarının Niceleme görüntü analiz yazılım paketleri tarafından yapılabilir. Özel hücrelerin görüntü yakalama ve DNA hasarı ölçmek için yapılan birkaç farklı yazılım paketleri vardır. Biz deney boyunca aynı yazılım paketini kullanmanızı öneririz. laboratuvar teknisyeni sağlam hücre veya kuyrukluyıldız bilgisayarda atılır tanımlayan ve üzerinde fare ile tıklar. kuyrukluyıldız veya sağlam hücre sonra otomatik puanlanır. </li></ol>

<ol>
	<li>Ostling, O., Johanson, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microelectrophoretic+study+of+radiation-induced+DNA+damages+in+individual+mammalian+cells.">Microelectrophoretic study of radiation-induced DNA damages in individual mammalian cells.</a> Biochem Biophys Res Commun. 123 (1), 291-298 (1984).</li><li>Phillips, J. L., Singh, N. P., Lai, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electromagnetic+fields+and+DNA+damage.">Electromagnetic fields and DNA damage.</a> Pathophysiology. 16 (2-3), 79-88 (2009).</li><li>Dhawan, A., Bajpayee, M., Parmar, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comet+assay:+a+reliable+tool+for+the+assessment+of+DNA+damage+in+different+models.">Comet assay: a reliable tool for the assessment of DNA damage in different models.</a> Cell Biol Toxicol. 25 (1), 5-32 (2009).</li><li>Aiub, C. A., Pinto, L. F., Felzenszwalb, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA-repair+genes+and+vitamin+E+in+the+prevention+of+N-nitrosodiethylamine+mutagenicity.">DNA-repair genes and vitamin E in the prevention of N-nitrosodiethylamine mutagenicity.</a> Cell Biol Toxicol. 25 (4), 393-402 (2009).</li><li>Bartsch, H., Nair, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+inflammation+and+oxidative+stress+in+the+genesis+and+perpetuation+of+cancer:+role+of+lipid+peroxidation,+DNA+damage,+and+repair.">Chronic inflammation and oxidative stress in the genesis and perpetuation of cancer: role of lipid peroxidation, DNA damage, and repair.</a> Langenbecks Arch Surg. 391 (5), 499-510 (2006).</li><li>Martin, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+damage+and+repair:+relevance+to+mechanisms+of+neurodegeneration.">DNA damage and repair: relevance to mechanisms of neurodegeneration.</a> J Neuropathol Exp Neurol. 67 (5), 377-387 (2008).</li><li>Choy, C. K., Benzie, I. F., Cho, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UV-mediated+DNA+strand+breaks+in+corneal+epithelial+cells+assessed+using+the+comet+assay+procedure.">UV-mediated DNA strand breaks in corneal epithelial cells assessed using the comet assay procedure.</a> Photochem Photobiol. 81 (3), 493-497 (2005).</li><li>Mozaffarieh, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comet+assay+analysis+of+single-stranded+DNA+breaks+in+circulating+leukocytes+of+glaucoma+patients.">Comet assay analysis of single-stranded DNA breaks in circulating leukocytes of glaucoma patients.</a> Mol Vis. 14, 1584-1588 (2008).</li><li>Mozaffarieh, M., Konieczka, K., Hauenstein, D., Schoetzau, A., Flammer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Half+a+pack+of+cigarettes+a+day+more+than+doubles+DNA+breaks+in+circulating+leukocytes.">Half a pack of cigarettes a day more than doubles DNA breaks in circulating leukocytes.</a> Tob Induc Dis. 8 (14), (2010).</li><li>Mozaffarieh, M., Schotzau, A., Josifova, T., Flammer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+ranibizumab+versus+photodynamic+therapy+on+DNA+damage+in+patients+with+exudative+macular+degeneration.">The effect of ranibizumab versus photodynamic therapy on DNA damage in patients with exudative macular degeneration.</a> Mol Vis. 15, 1194-1199 (2009).</li><li>Pertynska-Marczewska, M., Merhi, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+of+Advanced+Glycation+End+Products+With+Cardiovascular+Disease+in+Menopausal+Women.">Relationship of Advanced Glycation End Products With Cardiovascular Disease in Menopausal Women.</a> Reprod Sci. , (2014).</li><li>Singh, N. P., McCoy, M. T., Tice, R. R., Schneider, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+technique+for+quantitation+of+low+levels+of+DNA+damage+in+individual+cells).">A simple technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells).</a> Exp Cell Res. 175, 184-191 (1988).</li><li>Gaiv&#227;o, I., Sierra, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+comet+assay:+insights,+uses,+and+future+perspectives.">Drosophila comet assay: insights, uses, and future perspectives.</a> Front Genet. 5, 304 (2014).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+damage+in+lens+epithelial+cells+and+peripheral+lymphocytes+from+age-related+cataract+patients.">DNA damage in lens epithelial cells and peripheral lymphocytes from age-related cataract patients.</a> Ophthalmic Res. 51 (3), 124-128 (2014).</li><li>Huet, S. A., Vasseur, L., Camus, S., Chesn&#233;, C., Fessard, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Performance+of+comet+and+micronucleus+assays+in+metabolic+competent+HepaRG+cells+to+predict+in+vivo+genotoxicity.">Performance of comet and micronucleus assays in metabolic competent HepaRG cells to predict in vivo genotoxicity.</a> Toxicol Sci. 138 (2), 300-309 (2014).</li><li>Danson, S., Ranson, M., Denneny, O., Cummings, J., Ward, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+the+comet-X+assay+as+a+pharmacodynamic+assay+for+measuring+DNA+cross-linking+produced+by+the+novel+anticancer+agent+RH1+during+a+phase+I+clinical+trial.">Validation of the comet-X assay as a pharmacodynamic assay for measuring DNA cross-linking produced by the novel anticancer agent RH1 during a phase I clinical trial.</a> Cancer chemotherapy and pharmacology. 60, 851-861 (2007).</li><li>Moller, P., Moller, L., Godschalk, R. W., Jones, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+and+reduction+of+comet+assay+variation+in+relation+to+DNA+damage:+studies+from+the+European+Comet+Assay+Validation+Group.">Assessment and reduction of comet assay variation in relation to DNA damage: studies from the European Comet Assay Validation Group.</a> Mutagenesis. 25, 109-111 (2010).</li><li>Chan, S. W., Chevalier, S., Aprikian, A., Chen, J. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+quantification+of+mitochondrial+DNA+damage+and+copy+number+in+circulating+blood:+a+sensitive+approach+to+systemic+oxidative+stress.">Simultaneous quantification of mitochondrial DNA damage and copy number in circulating blood: a sensitive approach to systemic oxidative stress.</a> BioMed Res Int. , 157-547 (2013).</li><li>Sanchez-Quesada, J. L., Perez, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modified+lipoproteins+as+biomarkers+of+cardiovascular+risk+in+diabetes+mellitus.">Modified lipoproteins as biomarkers of cardiovascular risk in diabetes mellitus.</a> Endocrinol Nutr. 60, 518-528 (2013).</li><li>Gandhi, G., Kaur, G., Nisar, U. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-sectional+case+control+study+on+genetic+damage+in+individuals+residing+in+the+vicinity+of+a+mobile+phone+base+station.">Cross-sectional case control study on genetic damage in individuals residing in the vicinity of a mobile phone base station.</a> Electromagn Biol Med. 9, 1-11 (2014).</li><li>Cabarkapa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+effect+of+dry+olive+leaf+extract+in+adrenaline+induced+DNA+damage+evaluated+using+in+vitro+comet+assay+with+human+peripheral+leukocytes.">Protective effect of dry olive leaf extract in adrenaline induced DNA damage evaluated using in vitro comet assay with human peripheral leukocytes.</a> Toxicol In Vitro. 28 (3), 451-456 (2014).</li></ol>

İsveçli bilim adamları Östling ve Johanson hücrelerinde 1 DNA hasarını ölçmek için kuyruklu yıldız tahlil kullanmak için kendi alanında ilk edildi. Nötr koşulların iki bilim adamı kullanılan, ancak, sadece, çift sarmallı DNA kırılmalarının saptanmasına olanak. Singh ve ark., Daha sonra, çift ve tek dallı DNA kırılmaları değerlendirmek ve aside karşı duyarlı bir sitesi 12 tespit olabilir hassas bir sürümü üretilen alkalin koşullar altında kullanım için tahlil, adapte edilmiştir. Ilk gelişimi için, deney farklı hücre tipleri 13-15 DNA hasarı türleri değerlendirmek için uygun hale getirmek için çeşitli aşamalarda modifiye edilmiştir. Tüm teknikler ile olduğu gibi, teknik ayrıntılara titiz dikkat doğru sonuçlar elde etmek için 16 önemlidir. Bizim deneyime dayalı, en iyi sonuçlar elde edilir, eğer her metodolojik adım gelen ölçümü-bir uzman laboratuvar techn tarafından kuyrukluyıldız gerçekleştirilen çözüm hazırlığıicians. taze ve doğru bir şekilde hazırlanmış medya, yeterli pipet teknikleri, tam zamanlama ve taze hazırlanmış lökositlerin (daha önce sonuç bölümünde belirtildiği gibi) kullanım kullanımı doğru sonuçlar elde etmek için 17 lizis ve jel elektroforezi için sırayla gereklidir. Bu tahlilde tüm bireysel adımlar güvenilir sonuçlar elde etmek için aynı derecede önemlidir. Genel iyi sonuçlarda 16 elde edilir kuyrukluyıldız ölçümü kadar çözüm hazırlık her metodolojik adım uzman laboratuvar technicians.Important tarafından yapılırsa görünüyor taze ve doğru hazırlanmış medya kullanımı yeterli pipet teknikleri, tam zamanlama ve zaten sonuç bölümünde tahlil 17 yeterli sonuçlar elde etmek lizis ve jel elektroforezi için taze hazırlanmış lökositlerin kullanımı olarak anılacaktır. Diğer metodolojiler yapmak gibi, kuyruklu yıldız tahlil tekniği onun Deniz Ken vardırTages ve sakıncaları. Hassas bir yöntemle olmak, tahlil DNA kırılmaları artırmak ve böylece sonuçlarını etkileyebilecek olan faktörler (örneğin, UV ışık) savunmasızdır. Araştırılmaktadır olan hariç, oksidatif stres geliştirmek her faktör, kaçınılmalıdır. Stresörler oksidatif stres lökositlerin değil, aynı zamanda tüm diğer kan ortamlar ve lenfositlerin değil sadece seviyesini artırabilir. Daha önce belirtildiği gibi oksidatif stres 18,19 ölçme birçok farklı ve daha doğrudan yolları vardır. kuyruklu deney belli avantajlara sahiptir, birçok yöntemlerden biridir. Bunlar, nispeten düşük maliyetli, (&lt;10,000 hücre) gerekli hücrelerin az sayıda hasta başına gereken kan dolayısıyla küçük numuneler, hücreleri (yaklaşık olarak 3 gün) DNA hasarına ölçmek için gereken zaman göreceli olarak kısa bir süre, duyarlılık içerir ve farklı hücre tipleri de eşek DNA hasarı olan yaygın uygulanabilirliği. Biz bu deneyimi vardı çünkü Geçmişte biz lökositler ile çalışmayı tercihhücre tipi ve planlanan belirli bir çalışma için de geçerlidir. Kuyruklu tahlilin diğer bir avantajı, farklı türde ve DNA hasarının düzeylerini tespit etmek için kullanılabilir ve böylece bu tür DNA onarım çalışmaları, takviye çalışmalarda ya da genotoksisite çalışmaları gibi oksidatif stres yanında çalışmalar çeşitli alanlarda uygulanabilir olmasıdır. Oksidatif stres artık birden fazla hastalığın patogenezinde kritik bir rol oynuyor olarak kabul edilmektedir. kuyruklu yıldız tahlil metodu, oksidatif stres 18,19 ölçme birçok yollardan biri ise, nispeten basit, çok yönlü ve ucuz. Hakim olduğunda, bu yöntem, oksidatif stres rol 8-10,20,21 oynadığı tüm tıp alanlarında kullanılabilir.

Comet tahlil ilk İsveçli bilim adamları Östling ve Johanson 1 tarafından geliştirilmiştir. DNA, negatif yüklü bir moleküldür. Elektroforez sırasında, küçük hasarlı DNA fragmanları daha hızlı bir pozitif yüklü anot 2 doğru okuyun. DNA fragmanları küçük, anoda doğru daha hızlı göç sağlam, hasarsız DNA ve hasar görmüş DNA fragmanlarının 3 oluşan bir &quot;kuyruk&quot; oluşan &quot;kafa&quot; ile, tipik bir &quot;kuyruklu yıldız&quot; oluşturulur. Hasarlı DNA 5 oldukça dengeli DNA kırıkları nesil tutmak vücutta 4 farklı mekanizmalarla, tarafından tamir edilebilir. Ancak, denge DNA kırılmalarının lehine ise, sonları birikebilir ve sonuçta bir hastalığın gelişimine katkıda bulunacaktır. Bizim DNA belirli bir zamanda 6 yaklaşık 0,000165% hasar uğrar. Tek şeritli DNA sonları DNA çift iki sarmal birinde bir arıza bakınızDNA çift sarmal her iki ip kolları hasar gördüğünde, çift iplikçikli DNA kırılmaları kaynaklanır ise. Bu tür bir hücre yaşı, sigara dumanı, çeşitli ilaç ve oksidatif stres 7-9 olarak belirli bir zamanda DNA kırılmalarının miktarını arttırmak çeşitli faktörler vardır. Geliştirilmiş DNA kırılmalarının giden tüm faktörler sabit tutulduğu, daha sonra kuyruklu testin vasıtasıyla DNA kırılmalarının miktar oksidatif stres iyi dolaylı bir parametredir. comet yöntemi Oftalmoloji dahil tıpta giderek günümüzde kullanılmaktadır. Bunun bir nedeni, oksidatif stres daha bir yöntem, dolaylı miktarlarının saptanması için oksidatif stres ile çeşitli hastalıklar 8-11 ve kuyruklu testin bir patogenetik mekanizması olarak kabul olmasıdır.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<colgroup>
		<col span="2" />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dimethylsulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Qualigens</td>
			<td>(CPW59)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disodium EDTA</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>(RM1370)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium Bromide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>(E-8751)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histopaque</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>(1077-1)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS) (Ca++, Mg++ free)</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>(TS1006)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td>Ranbaxy Rankem</td>
			<td>(S0160)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide (NaOH)</td>
			<td>BDH-Merck</td>
			<td>(89021)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>(RM 845)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma Base</td>
			<td>Spectrochem</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Materials required for gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Melting Agarose (NMA)</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>(RM273)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Melting Point Agarose (LMPA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>(A9414)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol - Qualigens</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips (No. 1, 24 x 60 mm)</td>
			<td>Blue Star</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge Tubes</td>
			<td>Tarsons</td>
			<td>(500010)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipettor and Tips</td>
			<td>Tarsons</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slides, Conventional / Micro gel electrophoresis (MGE) slides</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

comet assay as an indirect measure of systemic oxidative stress

Oksijen olmadan yaşayamam yüksek ökaryotik organizmalar; Henüz, paradoksal olarak, oksijen onlara zararlı olabilir. farklı pi * Anti-yapıştırma yörüngelerde bulunan iki eşleşmemiş elektrona sahip olduğundan oksijen molekülü kimyasal nispeten atıl olduğunu. Bu iki elektron kendi eksenleri etrafında aynı yönde, yani paralel bir dönüş vardır. Oksijen molekülü değil, çok reaktif olmasının nedeni budur. Oksijen aktivasyonu iki farklı mekanizma ile ortaya çıkabilir; ya bir zaman (tek değerli azaltma) az bir elektronun yoluyla azaltma yoluyla, ya da yeterli enerji emilimi sayesinde eşleşmemiş elektronların birinin dönüşünü ters. Bu reaktif oksidatif türlerinin (ROS) üretimine yol açar. İnsan vücudu fizyolojik halde ROS ortadan kaldırır olan bir dizi yol vardır. ROS üretim onarım kapasitesi, oksidatif stres sonuçları ve zararları farklı moleküller aşarsa. Oksidatif stres beni olabilen birçok farklı yöntem vardırasured. Bu yazıda ayrıca DNA kırıkları ölçümünü sağlayan &quot;kuyruklu tahlil&quot; olarak bilinen hücre jel elektroforezi adlı yöntemlerden biri üzerinde duruluyor. Oksidatif stres dışında DNA hasarına yol açabildiği bilinmektedir tüm faktörler sabit tutulduğu takdirde, kuyruklu tahlili ile ölçülen, DNA hasar miktarı oksidatif stres iyi bir parametredir. prensibi basittir ve DNA molekülleri negatif yüklü gerçeği dayanır. Sağlam bir DNA molekülü bu elektroforez sırasında göç etmez böyle büyük bir boyutu vardır. DNA tatili, ancak, anoda doğru elektrik alanında hareket küçük parçalar halinde mevcut sonuç eğer. Daha küçük fragmanlar hızlı göç ederler. Fragmanları farklı boyutlara sahip olarak elektroforez nihai sonucu belirgin bir çizgi, ancak daha ziyade bir kuyruklu şekline sahip bir sürekli değildir. Sistem hücresinde DNA kırıkları ortaya çıkan &quot;kuyrukluyıldız&quot; ve böylece bir ölçümü sağlar.

Kuyruklu testin yöntemi tekrarlanabilir sonuçlar vermektedir rağmen, çeşitli faktörlere göre etkilenebilir. Böyle bir faktör, lökositlerin önceden liziz ve jel elektroforez ya da bu aşama taze hazırlanmış lökositler üzerinde gerçekleştirilir olup dondurularak olsun ya da değildir. Gösterir Şekil 2 bu lökositler liziz ve jel elektroforezi p-DNA önce dondurularak saklandı, Grup 2 sonları parçalama ve jel -electrophoresis taze hazırlanmış hücreleri üzerinde yapıldığını Grup 1 daha anlamlı olarak daha yüksek idi. Tahlil da dolaylı olarak sistemik oksidatif stresi değerlendirmek için de kullanılabilir. Tablo 1 sigara içen ve sağlıklı kişilerde bagaj an ve zeytin an için tanımlayıcı istatistikleri gösterir. veri daha fazla günlük sigara yarım paket sigara dolaşan lökositlerin 9 ssDNA sonları iki katına çıktığını ortaya koymaktadır. <img alt="Şekil 1A" src= &quot;/ Files / ftp_upload / 52763 / 52763fig1A.jpg&quot; /&gt; <img alt="Şekil 1B" src="/files/ftp_upload/52763/52763fig1B.jpg" /> Şekil 1. (A) kuyrukluyıldız tahlil analizleri sırasında kullanılan mikroskop yansıtır. (B) Δ parlak baş ve kuyruk (daha küçük DNA fragmanlarını hasarlı) ile tipik bir &quot;kuyruklu&quot; anlatıyor. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52763/52763fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/52763/52763fig2.jpg" /> Lökositler taze hazırlanmış lökositler lizis ve jel elektroforez önce kullanıldığı zaman daha (Grup 2) dondurularak zaman Şekil 2. ssDNA sonları anlamlı derecede yüksekti. <imgalt = &quot;Tablo 1&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 52763 / 52763table1.jpg&quot; /&gt; Tablo 1. Sigara içenler ssDNA&#39;nın iki katından daha fazla sayıda sağlıklı sigara içmeyen eşleştirilmiş yaş ve cinsiyete göre tatili vardı.

Watch this Scientific Journal Video about Comet Assay as an Indirect Measure of Systemic Oxidative Stress at JoVE.com

Comet Assay as an Indirect Measure of Systemic Oxidative Stress

Comet tahlil farklı faktörler tarafından uyarılan DNA kırılmaları, ölçer. DNA hasarına yol açan (oksidatif stres hariç) tüm faktörler sabit tutulması durumunda, DNA hasar miktarı oksidatif strese iyi bir dolaylı bir parametredir. Bu protokolün amacı, oksidatif stresin dolaylı ölçümü için kuyruklu yıldız tahlil kullanmaktır.

Sistemik Oksidatif Stresin bir Dolaylı Tedbir olarak Comet Assay

Higher eukaryotic organisms cannot live without oxygen; yet, paradoxically, oxygen can be harmful to them. The oxygen molecule is chemically relatively ...

comet-assay-as-an-indirect-measure-of-systemic-oxidative-stress

Research

JoVE Journal

Biology

29.2K Görüntüleme.  University of Basel.  Comet tahlil farklı faktörler tarafından uyarılan DNA kırılmaları, ölçer. DNA hasarına yol açan (oksidatif stres hariç) tüm faktörler sabit tutulması durumunda, DNA hasar miktarı oksidatif strese iyi bir dolaylı bir parametredir. Bu protokolün amacı, oksidatif stresin dolaylı ölçümü için kuyruklu yıldız tahlil kullanmaktır. 

Video: Comet Assay as an Indirect Measure of Systemic Oxidative Stress

A Behavioral Assay to Measure Responsiveness of Zebrafish to Changes in Light Intensities 

The optokinetic reflex (OKR) is a basic visual reflex exhibited by most vertebrates and plays an important role in stabilizing the eye relative to the visual scene. However, the OKR requires that an animal detect moving stripes and it is possible that fish that fail to exhibit an OKR may not be completely blind. One zebrafish mutant, the no optokinetic response c (nrc) has no OKR under any light conditions tested and was reported to be completely blind. Previously, we have shown that OFF-ganglion cell activity can be recorded in these mutants. To determine whether mutant fish with no OKR such as the nrc mutant can detect simple light increments and decrements we developed the visual motor behavioral assay (VMR). In this assay, single zebrafish larvae are placed in each well of a 96-well plate allowing the simultaneous monitoring of larvae using an automated video-tracking system. The locomotor responses of each larva to 30 minutes light ON and 30 minutes light OFF were recorded and quantified. WT fish have a brief spike of motor activity upon lights ON, known as the startle response, followed by return to lower-than baseline activity, called a freeze. WT fish also sharply increase their locomotor activity immediately following lights OFF and only gradually (over several minutes) return to baseline locomotor activity. The nrc mutants respond similarly to light OFF as WT fish, but exhibit a slight reduction in their average activity as compared to WT fish. Motor activity in response to light ON in nrc mutants is delayed and sluggish. There is a slow rise time of the nrc mutant response to light ON as compared to WT light ON response. The results indicate that nrc fish are not completely blind. Because teleosts can detect light through non-retinal tissues, we confirmed that the immediate behavioral responses to light-intensity changes require intact eyes by using the chokh (chk) mutants, which completely lack eyes from the earliest stages of development. In our VMR assay, the chk mutants exhibit no startle response to either light ON or OFF, showing that the lateral eyes mediate this behavior. The VMR assay described here complements the well-established OKR assay, which does not test the ability of zebrafish larvae to respond to changes in light intensities. Additionally, the automation of the VMR assay lends itself to high-throughput screening for defects in light-intensity driven visual responses.

A Behavioral Assay to Measure Responsiveness of Zebrafish to Changes in Light Intensities

We developed the Visual-Motor Response to quantitate the motor output of larval zebrafish in response to light increments and decrements. We also examined zebrafish vision mutants, including the no optokinetic response (nrc) mutants, which were thought to be completely blind when tested by another vision assay, the optokinetic reflex.

Işık Parlaklıkları değişiklikler Zebra balığı, Duyarlılık Tedbir Davranış Testi

The optokinetic reflex (OKR) is a basic visual reflex exhibited by most vertebrates and plays an important role in stabilizing the eye relative to the ...

Biyoloji

Homemade Site Directed Mutagenesis of Whole Plasmids

Site directed mutagenesis of whole plasmids is a simple way to create slightly different variations of an original plasmid. With this method the cloned target gene can be altered by substitution, deletion or insertion of a few bases directly into a plasmid. It works by simply amplifying the whole plasmid, in a non PCR-based thermocycling reaction. During the reaction mutagenic primers, carrying the desired mutation, are integrated into the newly synthesized plasmid. In this video tutorial we demonstrate an easy and cost effective way to introduce base substitutions into a plasmid. The protocol works with standard reagents and is independent from commercial kits, which often are very expensive. Applying this protocol can reduce the total cost of a reaction to an eighth of what it costs using some of the commercial kits. In this video we also comment on critical steps during the process and give detailed instructions on how to design the mutagenic primers.

Site directed mutagenesis of whole plasmids is a simple way to create slightly different variations of an original plasmid. Here we demonstrate an easy and cost effective way to introduce base substitutions into a plasmid using standard reagents.

Tüm Plazmidler Homemade Sitesi Yönetmen Mutagenez

Site directed mutagenesis of whole plasmids is a simple way to create slightly different variations of an original plasmid. With this method the cloned ...

Application of an In vitro DNA Protection Assay to Visualize Stress Mediation Properties of the Dps Protein

Oxidative stress is an unavoidable byproduct of aerobic life. Molecular oxygen is essential for terrestrial metabolism, but it also takes part in many damaging reactions within living organisms. The combination of aerobic metabolism and iron, which is another vital compound for life, is enough to produce radicals through Fenton chemistry and degrade cellular components. DNA degradation is arguably the most damaging process involving intracellular radicals, as DNA repair is far from trivial. The assay presented in this article offers a quantitative technique to measure and visualize the effect of molecules and enzymes on radical-mediated DNA damage.
The DNA protection assay is a simple, quick, and robust tool for the in vitro characterization of the protective properties of proteins or chemicals. It involves exposing DNA to a damaging oxidative reaction and adding varying concentrations of the compound of interest. The reduction or increase of DNA damage as a function of compound concentration is then visualized using gel electrophoresis. In this article we demonstrate the technique of the DNA protection assay by measuring the protective properties of the DNA-binding protein from starved cells (Dps). Dps is a mini-ferritin that is utilized by more than 300 bacterial species to powerfully combat environmental stressors. Here we present the Dps purification protocol and the optimized assay conditions for evaluating DNA protection by Dps.

Application of an In vitro DNA Protection Assay to Visualize Stress Mediation Properties of the Dps Protein

The DNA-binding protein from starved cells (Dps) plays a crucial role in combating bacterial stress. This article discusses the purification of E. coli Dps and the protocol for an in vitro assay demonstrating Dps-mediated protection of DNA from degradation by reactive oxygen species.

Bir uygulama<em&gt; In vitro</emDPS Protein Stres Arabuluculuk Özellikleri gözünüzde canlandırın için&gt; DNA Koruma Testi

Oxidative stress is an unavoidable byproduct of  aerobic life.  Molecular oxygen is  essential for terrestrial metabolism, but it also takes part in many ...

Analysis of Oxidative Stress in Zebrafish Embryos

High levels of reactive oxygen species (ROS) may cause a change of cellular redox state towards oxidative stress condition. This situation causes oxidation of molecules (lipid, DNA, protein) and leads to cell death. Oxidative stress also impacts the progression of several pathological conditions such as diabetes, retinopathies, neurodegeneration, and cancer. Thus, it is important to define tools to investigate oxidative stress conditions not only at the level of single cells but also in the context of whole organisms. Here, we consider the zebrafish embryo as a useful in vivo system to perform such studies and present a protocol to measure in vivo oxidative stress. Taking advantage of fluorescent ROS probes and zebrafish transgenic fluorescent lines, we develop two different methods to measure oxidative stress in vivo: i) a &#8220;whole embryo ROS-detection method&#8221; for qualitative measurement of oxidative stress and ii) a &#8220;single-cell&#160;ROS detection method&#8221; for quantitative measurements of oxidative stress. Herein, we demonstrate the efficacy of these procedures by increasing oxidative stress in tissues by oxidant agents and physiological or genetic methods. This protocol is amenable for forward genetic screens and it will help address cause-effect relationships of ROS in animal models of oxidative stress-related pathologies such as neurological disorders and cancer.

Here we report a protocol to measure oxidative stress in living zebrafish embryos. This procedure allows reactive oxygen species (ROS) detection in both whole embryo tissues and single-cell populations. This protocol will accomplish both qualitative and quantitative analyses.

Zebra balığı Embriyolar Oksidatif Stres Analizi

High levels of reactive oxygen species (ROS) may cause a change of cellular redox state towards oxidative stress condition. This situation causes ...

Method for the Assessment of Effects of a Range of Wavelengths and Intensities of Red/near-infrared Light Therapy on Oxidative Stress In Vitro

Red/near-infrared light therapy (R/NIR-LT), delivered by laser or light emitting diode (LED), improves functional and morphological outcomes in a range of central nervous system injuries in vivo, possibly by reducing oxidative stress. However, effects of R/NIR-LT on oxidative stress have been shown to vary depending on wavelength or intensity of irradiation. Studies comparing treatment parameters are lacking, due to absence of commercially available devices that deliver multiple wavelengths or intensities, suitable for high through-put in vitro optimization studies. This protocol describes a technique for delivery of light at a range of wavelengths and intensities to optimize therapeutic doses required for a given injury model. We hypothesized that a method of delivering light, in which wavelength and intensity parameters could easily be altered, could facilitate determination of an optimal dose of R/NIR-LT for reducing reactive oxygen species (ROS) in vitro.
Non-coherent Xenon light was filtered through narrow-band interference filters to deliver varying wavelengths (center wavelengths of 440, 550, 670 and 810nm) and fluences (8.5 x 10-3 to 3.8 x 10-1 J/cm2) of light to cultured cells. Light output from the apparatus was calibrated to emit therapeutically relevant, equal quantal doses of light at each wavelength. Reactive species were detected in glutamate stressed cells treated with the light, using DCFH-DA and H2O2 sensitive fluorescent dyes.&#160;
We successfully delivered light at a range of physiologically and therapeutically relevant wavelengths and intensities, to cultured cells exposed to glutamate as a model of CNS injury. While the fluences of R/NIR-LT used in the current study did not exert an effect on ROS generated by the cultured cells, the method of light delivery is applicable to other systems including isolated mitochondria or more physiologically relevant organotypic slice culture models, and could be used to assess effects on a range of outcome measures of oxidative metabolism.

Method for the Assessment of Effects of a Range of Wavelengths and Intensities of Red/near-infrared Light Therapy on Oxidative Stress In Vitro

Non-coherent Xenon light was passed through narrow-band interference and neutral density filters to deliver light of varying wavelength and intensity to cultured cells. This protocol was used to assess the effects of red/near-infrared light therapy on production of reactive species in vitro: no effects were observed using the tested parameters.

Dalga boyundaki ve Oksidatif Stres Kırmızı / yakın-kızılötesi ışık Terapisi şiddetler bir Range Etkilerinin Değerlendirilmesi için Yöntemi<em&gt; İn Vitro</em

Red/near-infrared light therapy (R/NIR-LT), delivered by laser or light emitting diode (LED), improves functional and morphological outcomes in a range of ...

Measuring Oxidative Stress Resistance of Caenorhabditis elegans in 96-well Microtiter Plates

Oxidative stress, which is the result of an imbalance between production and detoxification of reactive oxygen species, is a major contributor to chronic human disorders, including cardiovascular and neurodegenerative diseases, diabetes, aging, and cancer. Therefore, it is important to study oxidative stress not only in cell systems but also using whole organisms. C. elegans is an attractive model organism to study the genetics of oxidative stress signal transduction pathways, which are highly evolutionarily conserved.
Here, we provide a protocol to measure oxidative stress resistance in C. elegans in liquid. Briefly, ROS-inducing reagents such as paraquat (PQ) and H2O2 are dissolved in M9 buffer, and solutions are aliquoted in the wells of a 96 well microtiter plate. Synchronized L4/young adult C. elegans animals are transferred to the wells (5-8 animals/well) and survival is measured every hour until most worms are dead. When performing an oxidative stress resistance assay using a low concentration of stressors in plates, aging might influence the behavior of animals upon oxidative stress, which could lead to an incorrect interpretation of the data. However, in the assay described herein, this problem is unlikely to occur since only L4/young adult animals are being used. Moreover, this protocol is inexpensive and results are obtained in one day, which renders this technique attractive for genetic screens. Overall, this will help to understand oxidative stress signal transduction pathways, which could be translated into better characterization of oxidative stress-associated human disorders.

Measuring Oxidative Stress Resistance of Caenorhabditis elegans in 96-well Microtiter Plates

C. elegans is an attractive model organism to study signal transduction pathways involved in oxidative stress resistance. Here we provide a protocol to measure oxidative stress resistance of C. elegans animals in liquid phase, using several oxidizing agents in 96 well plates.

Oksidatif Stres Direnci Ölçüm<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; 96 oyuklu mikrotiter plakalarında

Oxidative stress, which is the result of an imbalance between production and detoxification of reactive oxygen species, is a major contributor to chronic ...

Indirect Immunofluorescence on Frozen Sections of Mouse Mammary Gland

Indirect immunofluorescence is used to detect and locate proteins of interest in a tissue. The protocol presented here describes a complete and simple method for the immune detection of proteins, the mouse lactating mammary gland being taken as an example. A protocol for the preparation of the tissue samples, especially concerning the dissection of mouse mammary gland, tissue fixation and frozen tissue sectioning, are detailed. A standard protocol to perform indirect immunofluorescence, including an optional antigen retrieval step, is also presented. The observation of the labeled tissue sections as well as image acquisition and post-treatments are also stated. This procedure gives a full overview, from the collection of animal tissue to the cellular localization of a protein. Although this general method can be applied to other tissue samples, it should be adapted to each tissue/primary antibody couple studied.

The indirect immunofluorescence protocol described in this article allows the detection and the localization of proteins in the mouse mammary gland. A complete method is given to prepare mammary gland samples, to perform immunohistochemistry, to image the tissue sections by fluorescence microscopy, and to reconstruct images.

Fare Meme Bezinin Dondurulmuş Bölümler Dolaylı İmmünofloresan

Indirect immunofluorescence is used to detect and locate proteins of interest in a tissue. The protocol presented here describes a complete and simple ...

In Vitro Assay to Measure Phosphatidylethanolamine Methyltransferase Activity

Phosphatidylethanolamine methyltransferases are biosynthetic enzymes that catalyze the transfer of one or more methyl group(s) from S-adenosyl-L-methionine onto phosphatidylethanolamine, monomethyl-phosphatidylethanolamine, or dimethyl-phosphatidylethanolamine to give either monomethyl-phosphatidylethanolamine, dimethyl-phosphatidylethanolamine or phosphatidylcholine. These enzymes are ubiquitous in animal cells, fungi, and are also found in approximately 10% of bacteria. They fulfill various important functions in cell physiology beyond their direct role in lipid metabolism such as in insulin resistance, diabetes, atherosclerosis, cell growth, or virulence. The present manuscript reports on a simple cell-free enzymatic assay that measures the transfer of tritiated methyl group(s) from S-[Methyl-3H]adenosyl-L-methionine onto phosphatidylethanolamine using whole cell extracts as an enzyme source. The resulting methylated forms of phosphatidylethanolamine are hydrophobic and thus, can be separated from water soluble S-[Methyl-3H]adenosyl-L-methionine by organic extraction. This assay can potentially be applied to any other cell types and used to test inhibitors/drugs specific to a phosphatidylethanolamine methyltransferase of interest without the need to purify the enzyme.

In Vitro Assay to Measure Phosphatidylethanolamine Methyltransferase Activity

The present report describes an in vitro enzymatic assay to measure phosphatidylethanolamine methyltransferase activity using Leishmania cell extracts. This assay is based on the transfer of a radioactive methyl group from S-[Methyl-3H]adenosyl-L-methionine onto endogenous phosphatidylethanolamine.

Vitro Tahlil Fosfatidiletanolamin Metiltransferaz Aktivite Tedbir

Phosphatidylethanolamine methyltransferases are biosynthetic enzymes that catalyze the transfer of one or more methyl group(s) from ...

In Vivo Alkaline Comet Assay and Enzyme-modified Alkaline Comet Assay for Measuring DNA Strand Breaks and Oxidative DNA Damage in Rat Liver

Unrepaired DNA damage can lead to genetic instability, which in turn may enhance cancer development. Therefore, identifying potential DNA damaging agents is important for protecting public health. The in vivo alkaline comet assay, which detects DNA damage as strand breaks, is especially relevant for assessing the genotoxic hazards of xenobiotics, as its responses reflect the in vivo absorption, tissue distribution, metabolism and excretion (ADME) of chemicals, as well as DNA repair process. Compared to other in vivo DNA damage assays, the assay is rapid, sensitive, visual and inexpensive, and, by converting oxidative DNA damage into strand breaks using specific repair enzymes, the assay can measure oxidative DNA damage in an efficient and relatively artifact-free manner. Measurement of DNA damage with the comet assay can be performed using both acute and subchronic toxicology study designs, and by integrating the comet assay with other toxicological assessments, the assay addresses animal welfare requirements by making maximum use of animal resources. Another major advantage of the assays is that they only require a small amount of cells, and the cells do not have to be derived from proliferating cell populations. The assays also can be performed with a variety of human samples obtained from clinically or occupationally exposed individuals.

In Vivo Alkaline Comet Assay and Enzyme-modified Alkaline Comet Assay for Measuring DNA Strand Breaks and Oxidative DNA Damage in Rat Liver

The alkaline comet assay measures DNA strand breaks in eukaryotic cells. By adding an Endonuclease III or human 8-oxoguanine-DNA-N-glycosylase digestion step, the assay can efficiently detect oxidative DNA damage. We describe methods for using these assays to detect DNA damage in rat liver.

Sıçan Karaciğer DNA Strand Breaks ve Oksidatif DNA Hasar Ölçüm Vivo Alkali Comet Assay ve Enzim-modifiye Alkali Comet Tahlili

Unrepaired DNA damage can lead to genetic instability, which in turn may enhance cancer development. Therefore, identifying potential DNA damaging agents ...

Methods to Classify Cytoplasmic Foci as Mammalian Stress Granules

Cells are often challenged by sudden environmental changes. Stress Granules (SGs), cytoplasmic ribonucleoprotein complexes that form in cells exposed to stress conditions, are implicated in various aspects of cell metabolism and survival. SGs modulate cellular signaling pathways, post-transcriptional gene expression, and stress response programs. The formation of these mRNA-containing granules is directly connected to cellular translation. SG assembly is triggered by inhibited translation initiation, and SG disassembly is promoted by translation activation or by inhibited translation elongation. This relationship is further highlighted by SG composition. Core SG components are stalled translation pre-initiation complexes, mRNA, and selected RNA-binding Proteins (RBPs). The purpose of SG assembly is to conserve cellular energy by sequestering translationally stalled housekeeping mRNAs, allowing for the enhanced translation of stress-responsive proteins. In addition to the core constituents, such as stalled translation preinitiation complexes, SGs contain a plethora of other proteins and signaling molecules. Defects in SG formation can impair cellular adaptation to stress and can thus promote cell death. SGs and similar RNA-containing granules have been linked to a number of human diseases, including neurodegenerative disorders and cancer, leading to the recent interest in classifying and defining RNA granule subtypes. This protocol describes assays to characterize and quantify mammalian SGs.

Stress Granules (SGs) are nonmembranous cytoplasmic structures that form in cells exposed to a variety of stresses. SGs contain mRNAs, RNA-binding proteins, small ribosomal subunits, translation-related factors, and various cell signaling proteins. This protocol describes a workflow that uses several experimental approaches to detect, characterize, and quantify bona fide SGs.

Sitoplazmik Odakları Memeli Stres Granülleri Olarak Sınıflandırma Yöntemleri

Cells are often challenged by sudden environmental changes. Stress Granules (SGs), cytoplasmic ribonucleoprotein complexes that form in cells exposed to ...