Name: comet assay as an indirect measure of systemic oxidative stress
Uploaded: 2015-05-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 23 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Comet Assay as an Indirect Measure of Systemic Oxidative Stress at JoVE.com

Biz mali oksidatif stres üzerinde araştırma desteklemek için, Triesen Liechtenstein, LHW Stiftung teşekkür etmek istiyorum.

Basel Üniversitesi&#39;nde gerçekleştirilen comet ile ilgili çalışmalar, Göz Hastalıkları Anabilim Dalı Basel Yerel Etik Kurulu tarafından kabul edildi Reaktifler 1. Hazırlık <ol><li> Dulbecco Fosfat Tamponlu Salin (PBS) (Ca ++, Mg ++ serbest) PBS (1 L paket) ve ortam dH 2 O 990 ml ekleyerek çözeltisi hazırlayın. 7.4&#39;e pH ayarlayın. Oda sıcaklığında saklayın. </li><li> Yokedici çözelti hazırlayın: 1000 mi dH 2 O içinde 2.5 M NaCl (146.1 g), 100 mM EDTA (37.2 g) ve 10 mM Trizma bazı (1.2 g) ekleyin hazırlamak için </li><li> 1500 mi dH 2 O 10 M NaOH, 30 ml ve 7.5 ml arasında 0.2M EDTA, QS ekleyerek elektroforez tamponu (300 mM NaOH / 1 mM EDTA) hazırlayın ve iyice karıştırın. toplam hacim jel kutu kapasitesine bağlıdır. Önceki&gt; 13 olan bir pH sağlamak için tampon pH ölçümü, kullanımı. </li><li> 0.4 M Tris ihtiva eden nötralizasyon tamponu hazırlayın (&amp; # konsantre edildi, (48.5 g ~ 800 mi dH 2, O, pH&#39;ı 7.5&#39;e ayarlamak üzere eklenmiştir)62; dH 2 O ile 10 M HCI) 1,000 ml Oda sıcaklığında çözelti saklayın. </li><li> Boyama çözüm hazırlayın. Etidyum bromür (EtBr; 10x stok, 20 ug / ml), oda sıcaklığında 50 mi dH 2 O ve mağaza EtBr 10 mg ekleyin. 1x Stok - 9 ml dH 2 O ile 1 ml karıştırın DİKKATLİ! Bilinen bir kanserojen olarak yeterli önlem ile EtBr tutun. </li></ol> Lökosit 2. izolasyonu <ol><li> Venöz ponksiyon ile heparin gibi bir anti-pıhtılaştırıcı, insan kan örnekleri (20 mi) elde edilir. </li><li> Böyle Histopaque bir yoğunluk gradyan hücre ayırıcı kullanılarak lenfositleri ayırın. <ol><li> 600 ul hücre ayırıcı sıvı üzerinde 1 PBS veya (FBS&#39;siz) RPMI oranı ve katmanın: Kısaca, 1 kan sulandırmak. </li><li> 4 ° C&#39;de 20 dakika boyunca santrifüje 1800 x g. PBS / RPMI 3-5 ml &#39;Buffy&#39; kat aspire ve lenfositler pelet 10 dakika boyunca 300 x g&#39;de santrifüj edilir. </li><li> (Sadece PBS arasındaki sınır yukarıdan RPMI lenfositleri AlBir pipet kullanarak) ve hücre ayırıcı sıvı. Plazma ve her bir tüp hücre ayırıcı sıvı katman arasındaki ara lökosit bantları çıkarın ve bir 50 ml tüp içine toplar. </li></ol></li><li> Soğuk Dulbecco Modifiye Edilmiş Eagle Ortamı (DMEM) ile 50 ml toplam hacmi getirmek. 10 dakika boyunca 300 x g&#39;de hücre süspansiyonu DMEM ile üç kez yıkayın. </li><li> Bir hemositometre kullanılarak hücrelerin toplam sayıları sayın. PBS hücrelerin askıya alma ve 10 7 hücre / tüp mikrosantrifüj tüpler içine veya or. </li><li> Pipet 5 ml&#39;lik bir plastik tek bir tüp içine hücre 0.4 ml. 40 ° C de 1.2 ml% 1 düşük jelleşme sıcaklıklı agaroz ekleyin. Karıştırın ve hızlı bir şekilde ve bir önceden kaplanmış sürgünün agaroz kaplı yüzey üzerine hücre süspansiyonu 1.2 ml pipetleyin. Kabarcıklar üreten kaçının. </li><li> Agaroz, yaklaşık 2 dakika boyunca jel izin verin. Jelleşme için kullanılan zaman ve sıcaklık ile tutarlı olun ve bu agaroz tamamen lizis çözeltisi içinde daldırarak önce ayarlanmış olduğundan emin olun. S tamamen sonraet, ~ 4 ° C&#39;de çözüm parçalama içine daldırın. </li></ol> 3. Lizis ve elektroforez NOT: açıklanan prosedür pH&gt; 13 alkali koşullar altında elektroforez içindir. <ol><li> ~ 4 ° C&#39;de en az 2 saat sonra, yavaşça parçalama Çözüm slaytları çıkarın. Yer mümkün olduğunca birbirine onları yakın kayma, bir ucu yakınında yatay jel kutusunun yan yana slaytlar. </li><li> Sıvı seviyesi tamamen slaytlar (agaroz üzerinde kabarcıkları önlemek) kapsar kadar taze yapılmış pH&gt; 13 elektroforez tamponu ile tampon rezervuarları doldurun. </li><li> 20 dakika DNA çözülmesi ve aside karşı duyarlı bir hasar ekspresyonuna izin vermek için kızağı alkalin tampon içinde bekletin. </li><li> 25 volt (~ 0.75 V / cm) güç kaynağı açın ve yükseltilmesi veya tampon seviyesini düşürerek 300 miliamper akım ayarlayın. 30 dakika boyunca slaytlar Electrophorese. </li><li> Gücü kapatın. Yavaşça tamponu ve p slaytlar asansörbir drenaj tepsisine dantel. Bilge kaplamaz nötralizasyon Tampon slaytlar bırakın. Slaytlar en az 5 dakika bekletin. Slaytlar boşaltın ve iki kez daha tekrarlayın. </li><li> 80 ul 1x Etidyum Bromür (EtBr) ile slaytlar Leke ve 5 dakika bekletin ve daha sonra fazla leke çıkarmak için soğuk distile su daldırma. Ardından slayt üzerinde bir lamel yerleştirin ve hemen saklayın. Mağaza kuru koşullarda oda sıcaklığında bir ay boyunca kayar. Not: Diğer DNA lekeleri (örneğin, SYBR yeşili) de kullanılabilir. Dikkat! En boyalar mutajenik olduğu gibi koruyucu eldiven giyin. </li></ol> DNA Breaks 4. sayısallaştırılması <ol><li> DNA hasarını görselleştirmek için, 40X objektif floresan mikroskop altında EtBr lekeli DNA slayt gözlemleyin. </li><li> DNA göçünü uzunluğu ve göç DNA (Şekil 1A) yüzdesinin ölçülmesiyle hücrelerinde nicel DNA hasarını değerlendirmek. Bagaj an ve Zeytin-Mome DNA hasarını (Şekil 1B) ölçmeknt. Kuyruk Moment ve Zeytin -Moment tanımları önceden 8-10 verilmiştir. NOT: Bizim tecrübelerimize göre bu parametrelerden biri tarafından sopa yeter. Hücreler mikroskop lamı ve fotoğraflar hücreleri üzerinde tarar otomatik bir araç ayarlayarak fotoğraflandı. DNA kırılmalarının Niceleme görüntü analiz yazılım paketleri tarafından yapılabilir. Özel hücrelerin görüntü yakalama ve DNA hasarı ölçmek için yapılan birkaç farklı yazılım paketleri vardır. Biz deney boyunca aynı yazılım paketini kullanmanızı öneririz. laboratuvar teknisyeni sağlam hücre veya kuyrukluyıldız bilgisayarda atılır tanımlayan ve üzerinde fare ile tıklar. kuyrukluyıldız veya sağlam hücre sonra otomatik puanlanır. </li></ol>

<ol>
	<li>Ostling, O., Johanson, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microelectrophoretic+study+of+radiation-induced+DNA+damages+in+individual+mammalian+cells.">Microelectrophoretic study of radiation-induced DNA damages in individual mammalian cells.</a> Biochem Biophys Res Commun. 123 (1), 291-298 (1984).</li><li>Phillips, J. L., Singh, N. P., Lai, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electromagnetic+fields+and+DNA+damage.">Electromagnetic fields and DNA damage.</a> Pathophysiology. 16 (2-3), 79-88 (2009).</li><li>Dhawan, A., Bajpayee, M., Parmar, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comet+assay:+a+reliable+tool+for+the+assessment+of+DNA+damage+in+different+models.">Comet assay: a reliable tool for the assessment of DNA damage in different models.</a> Cell Biol Toxicol. 25 (1), 5-32 (2009).</li><li>Aiub, C. A., Pinto, L. F., Felzenszwalb, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA-repair+genes+and+vitamin+E+in+the+prevention+of+N-nitrosodiethylamine+mutagenicity.">DNA-repair genes and vitamin E in the prevention of N-nitrosodiethylamine mutagenicity.</a> Cell Biol Toxicol. 25 (4), 393-402 (2009).</li><li>Bartsch, H., Nair, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+inflammation+and+oxidative+stress+in+the+genesis+and+perpetuation+of+cancer:+role+of+lipid+peroxidation,+DNA+damage,+and+repair.">Chronic inflammation and oxidative stress in the genesis and perpetuation of cancer: role of lipid peroxidation, DNA damage, and repair.</a> Langenbecks Arch Surg. 391 (5), 499-510 (2006).</li><li>Martin, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+damage+and+repair:+relevance+to+mechanisms+of+neurodegeneration.">DNA damage and repair: relevance to mechanisms of neurodegeneration.</a> J Neuropathol Exp Neurol. 67 (5), 377-387 (2008).</li><li>Choy, C. K., Benzie, I. F., Cho, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UV-mediated+DNA+strand+breaks+in+corneal+epithelial+cells+assessed+using+the+comet+assay+procedure.">UV-mediated DNA strand breaks in corneal epithelial cells assessed using the comet assay procedure.</a> Photochem Photobiol. 81 (3), 493-497 (2005).</li><li>Mozaffarieh, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comet+assay+analysis+of+single-stranded+DNA+breaks+in+circulating+leukocytes+of+glaucoma+patients.">Comet assay analysis of single-stranded DNA breaks in circulating leukocytes of glaucoma patients.</a> Mol Vis. 14, 1584-1588 (2008).</li><li>Mozaffarieh, M., Konieczka, K., Hauenstein, D., Schoetzau, A., Flammer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Half+a+pack+of+cigarettes+a+day+more+than+doubles+DNA+breaks+in+circulating+leukocytes.">Half a pack of cigarettes a day more than doubles DNA breaks in circulating leukocytes.</a> Tob Induc Dis. 8 (14), (2010).</li><li>Mozaffarieh, M., Schotzau, A., Josifova, T., Flammer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+ranibizumab+versus+photodynamic+therapy+on+DNA+damage+in+patients+with+exudative+macular+degeneration.">The effect of ranibizumab versus photodynamic therapy on DNA damage in patients with exudative macular degeneration.</a> Mol Vis. 15, 1194-1199 (2009).</li><li>Pertynska-Marczewska, M., Merhi, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+of+Advanced+Glycation+End+Products+With+Cardiovascular+Disease+in+Menopausal+Women.">Relationship of Advanced Glycation End Products With Cardiovascular Disease in Menopausal Women.</a> Reprod Sci. , (2014).</li><li>Singh, N. P., McCoy, M. T., Tice, R. R., Schneider, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+technique+for+quantitation+of+low+levels+of+DNA+damage+in+individual+cells).">A simple technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells).</a> Exp Cell Res. 175, 184-191 (1988).</li><li>Gaiv&#227;o, I., Sierra, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+comet+assay:+insights,+uses,+and+future+perspectives.">Drosophila comet assay: insights, uses, and future perspectives.</a> Front Genet. 5, 304 (2014).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+damage+in+lens+epithelial+cells+and+peripheral+lymphocytes+from+age-related+cataract+patients.">DNA damage in lens epithelial cells and peripheral lymphocytes from age-related cataract patients.</a> Ophthalmic Res. 51 (3), 124-128 (2014).</li><li>Huet, S. A., Vasseur, L., Camus, S., Chesn&#233;, C., Fessard, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Performance+of+comet+and+micronucleus+assays+in+metabolic+competent+HepaRG+cells+to+predict+in+vivo+genotoxicity.">Performance of comet and micronucleus assays in metabolic competent HepaRG cells to predict in vivo genotoxicity.</a> Toxicol Sci. 138 (2), 300-309 (2014).</li><li>Danson, S., Ranson, M., Denneny, O., Cummings, J., Ward, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+the+comet-X+assay+as+a+pharmacodynamic+assay+for+measuring+DNA+cross-linking+produced+by+the+novel+anticancer+agent+RH1+during+a+phase+I+clinical+trial.">Validation of the comet-X assay as a pharmacodynamic assay for measuring DNA cross-linking produced by the novel anticancer agent RH1 during a phase I clinical trial.</a> Cancer chemotherapy and pharmacology. 60, 851-861 (2007).</li><li>Moller, P., Moller, L., Godschalk, R. W., Jones, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+and+reduction+of+comet+assay+variation+in+relation+to+DNA+damage:+studies+from+the+European+Comet+Assay+Validation+Group.">Assessment and reduction of comet assay variation in relation to DNA damage: studies from the European Comet Assay Validation Group.</a> Mutagenesis. 25, 109-111 (2010).</li><li>Chan, S. W., Chevalier, S., Aprikian, A., Chen, J. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+quantification+of+mitochondrial+DNA+damage+and+copy+number+in+circulating+blood:+a+sensitive+approach+to+systemic+oxidative+stress.">Simultaneous quantification of mitochondrial DNA damage and copy number in circulating blood: a sensitive approach to systemic oxidative stress.</a> BioMed Res Int. , 157-547 (2013).</li><li>Sanchez-Quesada, J. L., Perez, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modified+lipoproteins+as+biomarkers+of+cardiovascular+risk+in+diabetes+mellitus.">Modified lipoproteins as biomarkers of cardiovascular risk in diabetes mellitus.</a> Endocrinol Nutr. 60, 518-528 (2013).</li><li>Gandhi, G., Kaur, G., Nisar, U. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-sectional+case+control+study+on+genetic+damage+in+individuals+residing+in+the+vicinity+of+a+mobile+phone+base+station.">Cross-sectional case control study on genetic damage in individuals residing in the vicinity of a mobile phone base station.</a> Electromagn Biol Med. 9, 1-11 (2014).</li><li>Cabarkapa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+effect+of+dry+olive+leaf+extract+in+adrenaline+induced+DNA+damage+evaluated+using+in+vitro+comet+assay+with+human+peripheral+leukocytes.">Protective effect of dry olive leaf extract in adrenaline induced DNA damage evaluated using in vitro comet assay with human peripheral leukocytes.</a> Toxicol In Vitro. 28 (3), 451-456 (2014).</li></ol>

İsveçli bilim adamları Östling ve Johanson hücrelerinde 1 DNA hasarını ölçmek için kuyruklu yıldız tahlil kullanmak için kendi alanında ilk edildi. Nötr koşulların iki bilim adamı kullanılan, ancak, sadece, çift sarmallı DNA kırılmalarının saptanmasına olanak. Singh ve ark., Daha sonra, çift ve tek dallı DNA kırılmaları değerlendirmek ve aside karşı duyarlı bir sitesi 12 tespit olabilir hassas bir sürümü üretilen alkalin koşullar altında kullanım için tahlil, adapte edilmiştir. Ilk gelişimi için, deney farklı hücre tipleri 13-15 DNA hasarı türleri değerlendirmek için uygun hale getirmek için çeşitli aşamalarda modifiye edilmiştir. Tüm teknikler ile olduğu gibi, teknik ayrıntılara titiz dikkat doğru sonuçlar elde etmek için 16 önemlidir. Bizim deneyime dayalı, en iyi sonuçlar elde edilir, eğer her metodolojik adım gelen ölçümü-bir uzman laboratuvar techn tarafından kuyrukluyıldız gerçekleştirilen çözüm hazırlığıicians. taze ve doğru bir şekilde hazırlanmış medya, yeterli pipet teknikleri, tam zamanlama ve taze hazırlanmış lökositlerin (daha önce sonuç bölümünde belirtildiği gibi) kullanım kullanımı doğru sonuçlar elde etmek için 17 lizis ve jel elektroforezi için sırayla gereklidir. Bu tahlilde tüm bireysel adımlar güvenilir sonuçlar elde etmek için aynı derecede önemlidir. Genel iyi sonuçlarda 16 elde edilir kuyrukluyıldız ölçümü kadar çözüm hazırlık her metodolojik adım uzman laboratuvar technicians.Important tarafından yapılırsa görünüyor taze ve doğru hazırlanmış medya kullanımı yeterli pipet teknikleri, tam zamanlama ve zaten sonuç bölümünde tahlil 17 yeterli sonuçlar elde etmek lizis ve jel elektroforezi için taze hazırlanmış lökositlerin kullanımı olarak anılacaktır. Diğer metodolojiler yapmak gibi, kuyruklu yıldız tahlil tekniği onun Deniz Ken vardırTages ve sakıncaları. Hassas bir yöntemle olmak, tahlil DNA kırılmaları artırmak ve böylece sonuçlarını etkileyebilecek olan faktörler (örneğin, UV ışık) savunmasızdır. Araştırılmaktadır olan hariç, oksidatif stres geliştirmek her faktör, kaçınılmalıdır. Stresörler oksidatif stres lökositlerin değil, aynı zamanda tüm diğer kan ortamlar ve lenfositlerin değil sadece seviyesini artırabilir. Daha önce belirtildiği gibi oksidatif stres 18,19 ölçme birçok farklı ve daha doğrudan yolları vardır. kuyruklu deney belli avantajlara sahiptir, birçok yöntemlerden biridir. Bunlar, nispeten düşük maliyetli, (&lt;10,000 hücre) gerekli hücrelerin az sayıda hasta başına gereken kan dolayısıyla küçük numuneler, hücreleri (yaklaşık olarak 3 gün) DNA hasarına ölçmek için gereken zaman göreceli olarak kısa bir süre, duyarlılık içerir ve farklı hücre tipleri de eşek DNA hasarı olan yaygın uygulanabilirliği. Biz bu deneyimi vardı çünkü Geçmişte biz lökositler ile çalışmayı tercihhücre tipi ve planlanan belirli bir çalışma için de geçerlidir. Kuyruklu tahlilin diğer bir avantajı, farklı türde ve DNA hasarının düzeylerini tespit etmek için kullanılabilir ve böylece bu tür DNA onarım çalışmaları, takviye çalışmalarda ya da genotoksisite çalışmaları gibi oksidatif stres yanında çalışmalar çeşitli alanlarda uygulanabilir olmasıdır. Oksidatif stres artık birden fazla hastalığın patogenezinde kritik bir rol oynuyor olarak kabul edilmektedir. kuyruklu yıldız tahlil metodu, oksidatif stres 18,19 ölçme birçok yollardan biri ise, nispeten basit, çok yönlü ve ucuz. Hakim olduğunda, bu yöntem, oksidatif stres rol 8-10,20,21 oynadığı tüm tıp alanlarında kullanılabilir.

Comet tahlil ilk İsveçli bilim adamları Östling ve Johanson 1 tarafından geliştirilmiştir. DNA, negatif yüklü bir moleküldür. Elektroforez sırasında, küçük hasarlı DNA fragmanları daha hızlı bir pozitif yüklü anot 2 doğru okuyun. DNA fragmanları küçük, anoda doğru daha hızlı göç sağlam, hasarsız DNA ve hasar görmüş DNA fragmanlarının 3 oluşan bir &quot;kuyruk&quot; oluşan &quot;kafa&quot; ile, tipik bir &quot;kuyruklu yıldız&quot; oluşturulur. Hasarlı DNA 5 oldukça dengeli DNA kırıkları nesil tutmak vücutta 4 farklı mekanizmalarla, tarafından tamir edilebilir. Ancak, denge DNA kırılmalarının lehine ise, sonları birikebilir ve sonuçta bir hastalığın gelişimine katkıda bulunacaktır. Bizim DNA belirli bir zamanda 6 yaklaşık 0,000165% hasar uğrar. Tek şeritli DNA sonları DNA çift iki sarmal birinde bir arıza bakınızDNA çift sarmal her iki ip kolları hasar gördüğünde, çift iplikçikli DNA kırılmaları kaynaklanır ise. Bu tür bir hücre yaşı, sigara dumanı, çeşitli ilaç ve oksidatif stres 7-9 olarak belirli bir zamanda DNA kırılmalarının miktarını arttırmak çeşitli faktörler vardır. Geliştirilmiş DNA kırılmalarının giden tüm faktörler sabit tutulduğu, daha sonra kuyruklu testin vasıtasıyla DNA kırılmalarının miktar oksidatif stres iyi dolaylı bir parametredir. comet yöntemi Oftalmoloji dahil tıpta giderek günümüzde kullanılmaktadır. Bunun bir nedeni, oksidatif stres daha bir yöntem, dolaylı miktarlarının saptanması için oksidatif stres ile çeşitli hastalıklar 8-11 ve kuyruklu testin bir patogenetik mekanizması olarak kabul olmasıdır.

<table><tbody><tr><td>Dimethylsulfoxide (DMSO)</td><td>Qualigens</td><td>(CPW59)</td><td></td></tr><tr><td>Disodium EDTA</td><td>HiMedia</td><td>(RM1370)</td><td></td></tr><tr><td>Ethidium Bromide</td><td>Sigma</td><td>(E-8751)</td><td></td></tr><tr><td>Histopaque</td><td>Sigma</td><td>(1077-1)</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline (PBS) (Ca++, Mg++ free)</td><td>HiMedia</td><td>(TS1006)</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Chloride (NaCl)</td><td>Ranbaxy Rankem</td><td>(S0160)</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Hydroxide (NaOH)</td><td>BDH-Merck</td><td>(89021)</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>HiMedia</td><td>(RM 845)</td><td></td></tr><tr><td>Trizma Base</td><td>Spectrochem</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Materials required for gel electrophoresis</td></tr><tr><td>Normal Melting Agarose (NMA)</td><td>HiMedia</td><td>(RM273)</td><td></td></tr><tr><td>Low Melting Point Agarose (LMPA)</td><td>Sigma</td><td>(A9414)</td><td></td></tr><tr><td>Methanol - Qualigens</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Coverslips (No. 1, 24 x 60 mm)</td><td>Blue Star</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge Tubes</td><td>Tarsons</td><td>(500010)</td><td></td></tr><tr><td>Micropipettor and Tips</td><td>Tarsons</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscope Slides, Conventional / Micro gel electrophoresis (MGE) slides</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

comet assay as an indirect measure of systemic oxidative stress

Oksijen olmadan yaşayamam yüksek ökaryotik organizmalar; Henüz, paradoksal olarak, oksijen onlara zararlı olabilir. farklı pi * Anti-yapıştırma yörüngelerde bulunan iki eşleşmemiş elektrona sahip olduğundan oksijen molekülü kimyasal nispeten atıl olduğunu. Bu iki elektron kendi eksenleri etrafında aynı yönde, yani paralel bir dönüş vardır. Oksijen molekülü değil, çok reaktif olmasının nedeni budur. Oksijen aktivasyonu iki farklı mekanizma ile ortaya çıkabilir; ya bir zaman (tek değerli azaltma) az bir elektronun yoluyla azaltma yoluyla, ya da yeterli enerji emilimi sayesinde eşleşmemiş elektronların birinin dönüşünü ters. Bu reaktif oksidatif türlerinin (ROS) üretimine yol açar. İnsan vücudu fizyolojik halde ROS ortadan kaldırır olan bir dizi yol vardır. ROS üretim onarım kapasitesi, oksidatif stres sonuçları ve zararları farklı moleküller aşarsa. Oksidatif stres beni olabilen birçok farklı yöntem vardırasured. Bu yazıda ayrıca DNA kırıkları ölçümünü sağlayan &quot;kuyruklu tahlil&quot; olarak bilinen hücre jel elektroforezi adlı yöntemlerden biri üzerinde duruluyor. Oksidatif stres dışında DNA hasarına yol açabildiği bilinmektedir tüm faktörler sabit tutulduğu takdirde, kuyruklu tahlili ile ölçülen, DNA hasar miktarı oksidatif stres iyi bir parametredir. prensibi basittir ve DNA molekülleri negatif yüklü gerçeği dayanır. Sağlam bir DNA molekülü bu elektroforez sırasında göç etmez böyle büyük bir boyutu vardır. DNA tatili, ancak, anoda doğru elektrik alanında hareket küçük parçalar halinde mevcut sonuç eğer. Daha küçük fragmanlar hızlı göç ederler. Fragmanları farklı boyutlara sahip olarak elektroforez nihai sonucu belirgin bir çizgi, ancak daha ziyade bir kuyruklu şekline sahip bir sürekli değildir. Sistem hücresinde DNA kırıkları ortaya çıkan &quot;kuyrukluyıldız&quot; ve böylece bir ölçümü sağlar.

Kuyruklu testin yöntemi tekrarlanabilir sonuçlar vermektedir rağmen, çeşitli faktörlere göre etkilenebilir. Böyle bir faktör, lökositlerin önceden liziz ve jel elektroforez ya da bu aşama taze hazırlanmış lökositler üzerinde gerçekleştirilir olup dondurularak olsun ya da değildir. Gösterir Şekil 2 bu lökositler liziz ve jel elektroforezi p-DNA önce dondurularak saklandı, Grup 2 sonları parçalama ve jel -electrophoresis taze hazırlanmış hücreleri üzerinde yapıldığını Grup 1 daha anlamlı olarak daha yüksek idi. Tahlil da dolaylı olarak sistemik oksidatif stresi değerlendirmek için de kullanılabilir. Tablo 1 sigara içen ve sağlıklı kişilerde bagaj an ve zeytin an için tanımlayıcı istatistikleri gösterir. veri daha fazla günlük sigara yarım paket sigara dolaşan lökositlerin 9 ssDNA sonları iki katına çıktığını ortaya koymaktadır. <img alt="Şekil 1A" src= &quot;/ Files / ftp_upload / 52763 / 52763fig1A.jpg&quot; /&gt; <img alt="Şekil 1B" src="/files/ftp_upload/52763/52763fig1B.jpg" /> Şekil 1. (A) kuyrukluyıldız tahlil analizleri sırasında kullanılan mikroskop yansıtır. (B) Δ parlak baş ve kuyruk (daha küçük DNA fragmanlarını hasarlı) ile tipik bir &quot;kuyruklu&quot; anlatıyor. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52763/52763fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/52763/52763fig2.jpg" /> Lökositler taze hazırlanmış lökositler lizis ve jel elektroforez önce kullanıldığı zaman daha (Grup 2) dondurularak zaman Şekil 2. ssDNA sonları anlamlı derecede yüksekti. <imgalt = &quot;Tablo 1&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 52763 / 52763table1.jpg&quot; /&gt; Tablo 1. Sigara içenler ssDNA&#39;nın iki katından daha fazla sayıda sağlıklı sigara içmeyen eşleştirilmiş yaş ve cinsiyete göre tatili vardı.

Watch this Scientific Journal Video about Comet Assay as an Indirect Measure of Systemic Oxidative Stress at JoVE.com

Comet Assay as an Indirect Measure of Systemic Oxidative Stress

Comet tahlil farklı faktörler tarafından uyarılan DNA kırılmaları, ölçer. DNA hasarına yol açan (oksidatif stres hariç) tüm faktörler sabit tutulması durumunda, DNA hasar miktarı oksidatif strese iyi bir dolaylı bir parametredir. Bu protokolün amacı, oksidatif stresin dolaylı ölçümü için kuyruklu yıldız tahlil kullanmaktır.

Sistemik Oksidatif Stresin bir Dolaylı Tedbir olarak Comet Assay

Higher eukaryotic organisms cannot live without oxygen; yet, paradoxically, oxygen can be harmful to them. The oxygen molecule is chemically relatively ...

comet-assay-as-an-indirect-measure-of-systemic-oxidative-stress

Research

JoVE Journal

Biology

29.3K Görüntüleme.  University of Basel.  Comet tahlil farklı faktörler tarafından uyarılan DNA kırılmaları, ölçer. DNA hasarına yol açan (oksidatif stres hariç) tüm faktörler sabit tutulması durumunda, DNA hasar miktarı oksidatif strese iyi bir dolaylı bir parametredir. Bu protokolün amacı, oksidatif stresin dolaylı ölçümü için kuyruklu yıldız tahlil kullanmaktır. 

Video: Comet Assay as an Indirect Measure of Systemic Oxidative Stress

Evaluating In Vitro DNA Damage Using Comet Assay

DNA damage is a common phenomenon for each cell during its lifespan, and is defined as an alteration of the chemical structure of genomic DNA. Cancer therapies, such as radio- and chemotherapy, introduce enormous amount of additional DNA damage, leading to cell cycle arrest and apoptosis to limit cancer progression. Quantitative assessment of DNA damage during experimental cancer therapy is a key step to justify the effectiveness of a genotoxic agent. In this study, we focus on a single cell electrophoresis assay, also known as the comet assay, which can quantify single and double-strand DNA breaks in vitro. The comet assay is a DNA damage quantification method that is efficient and easy to perform, and has low time/budget demands and high reproducibility. Here, we highlight the utility of the comet assay for a preclinical study by evaluating the genotoxic effect of olaparib/temozolomide combination therapy to U251 glioma cells.

Evaluating In Vitro DNA Damage Using Comet Assay

The comet assay is an efficient method to detect DNA damage including single and double-stranded DNA breaks. We describe alkaline and neutral comet assays to measure DNA damage in cancer cells to evaluate the therapeutic effect of chemotherapy.

Vitro DNA hasarı kuyruklu yıldız tahlil kullanarak değerlendirmek

DNA damage is a common phenomenon for each cell during its lifespan, and is defined as an alteration of the chemical structure of genomic DNA. Cancer ...

Kanser Araştırmaları

CometChip: A High-throughput 96-Well Platform for Measuring DNA Damage in Microarrayed Human Cells

DNA damaging agents can promote aging, disease and cancer and they are ubiquitous in the environment and produced within human cells as normal cellular metabolites. Ironically, at high doses DNA damaging agents are also used to treat cancer. The ability to quantify DNA damage responses is thus critical in the public health, pharmaceutical and clinical domains. Here, we describe a novel platform that exploits microfabrication techniques to pattern cells in a fixed microarray. The &#8216;CometChip&#8217; is based upon the well-established single cell gel electrophoresis assay (a.k.a. the comet assay), which estimates the level of DNA damage by evaluating the extent of DNA migration through a matrix in an electrical field. The type of damage measured by this assay includes abasic sites, crosslinks, and strand breaks. Instead of being randomly dispersed in agarose in the traditional assay, cells are captured into an agarose microwell array by gravity. The platform also expands from the size of a standard microscope slide to a 96-well format, enabling parallel processing. Here we describe the protocols of using the chip to evaluate DNA damage caused by known genotoxic agents and the cellular repair response followed after exposure. Through the integration of biological and engineering principles, this method potentiates robust and sensitive measurements of DNA damage in human cells and provides the necessary throughput for genotoxicity testing, drug development, epidemiological studies and clinical assays.

We describe here a platform that allows comet assay detection of DNA damage with unprecedented throughput. The device patterns mammalian cells into a microarray and enables parallel processing of 96 samples. The approach facilitates analysis of base level DNA damage, exposure-induced DNA damage and DNA repair kinetics.

CometChip: İnsan Microarrayed hücrelerde DNA hasarına ölçülmesi için bir Yüksek verim 96 Oyuklu Platformu

DNA damaging agents can promote aging, disease and cancer and they are ubiquitous in the environment and produced within human cells as normal cellular ...

Biyomühendislik

A Behavioral Assay to Measure Responsiveness of Zebrafish to Changes in Light Intensities 

The optokinetic reflex (OKR) is a basic visual reflex exhibited by most vertebrates and plays an important role in stabilizing the eye relative to the visual scene. However, the OKR requires that an animal detect moving stripes and it is possible that fish that fail to exhibit an OKR may not be completely blind. One zebrafish mutant, the no optokinetic response c (nrc) has no OKR under any light conditions tested and was reported to be completely blind. Previously, we have shown that OFF-ganglion cell activity can be recorded in these mutants. To determine whether mutant fish with no OKR such as the nrc mutant can detect simple light increments and decrements we developed the visual motor behavioral assay (VMR). In this assay, single zebrafish larvae are placed in each well of a 96-well plate allowing the simultaneous monitoring of larvae using an automated video-tracking system. The locomotor responses of each larva to 30 minutes light ON and 30 minutes light OFF were recorded and quantified. WT fish have a brief spike of motor activity upon lights ON, known as the startle response, followed by return to lower-than baseline activity, called a freeze. WT fish also sharply increase their locomotor activity immediately following lights OFF and only gradually (over several minutes) return to baseline locomotor activity. The nrc mutants respond similarly to light OFF as WT fish, but exhibit a slight reduction in their average activity as compared to WT fish. Motor activity in response to light ON in nrc mutants is delayed and sluggish. There is a slow rise time of the nrc mutant response to light ON as compared to WT light ON response. The results indicate that nrc fish are not completely blind. Because teleosts can detect light through non-retinal tissues, we confirmed that the immediate behavioral responses to light-intensity changes require intact eyes by using the chokh (chk) mutants, which completely lack eyes from the earliest stages of development. In our VMR assay, the chk mutants exhibit no startle response to either light ON or OFF, showing that the lateral eyes mediate this behavior. The VMR assay described here complements the well-established OKR assay, which does not test the ability of zebrafish larvae to respond to changes in light intensities. Additionally, the automation of the VMR assay lends itself to high-throughput screening for defects in light-intensity driven visual responses.

A Behavioral Assay to Measure Responsiveness of Zebrafish to Changes in Light Intensities

We developed the Visual-Motor Response to quantitate the motor output of larval zebrafish in response to light increments and decrements. We also examined zebrafish vision mutants, including the no optokinetic response (nrc) mutants, which were thought to be completely blind when tested by another vision assay, the optokinetic reflex.

Işık Parlaklıkları değişiklikler Zebra balığı, Duyarlılık Tedbir Davranış Testi

The optokinetic reflex (OKR) is a basic visual reflex exhibited by most vertebrates and plays an important role in stabilizing the eye relative to the ...

Biyoloji

Use of Frozen Tissue in the Comet Assay for the Evaluation of DNA Damage

The comet assay is gaining popularity as a means to assess DNA damage in cultured cells and tissues, particularly following exposure to chemicals or other environmental stressors. Use of the comet assay in regulatory testing for genotoxic potential in rodents has been driven by adoption of an Organisation for Economic Co-operation and Development (OECD) test guideline in 2014. Comet assay slides are typically prepared from fresh tissue at the time of necropsy; however, freezing tissue samples can avoid logistical challenges associated with simultaneous preparation of slides from multiple organs per animal and from many animals per study. Freezing also enables shipping samples from the exposure facility to a different laboratory for analysis, and storage of frozen tissue facilitates deferring a decision to generate DNA damage data for a given organ. The alkaline comet assay is useful for detecting exposure-related DNA double- and single-strand breaks, alkali-labile lesions, and strand breaks associated with incomplete DNA excision repair. However, DNA damage can also result from mechanical shearing or improper sample processing procedures, confounding the results of the assay. Reproducibility in collection and processing of tissue samples during necropsies may be difficult to control due to fluctuating laboratory personnel with varying levels of experience in harvesting tissues for the comet assay. Enhancing consistency through refresher training or deployment of mobile units staffed with experienced laboratory personnel is costly and may not always be feasible. To optimize consistent generation of high quality samples for comet assay analysis, a method for homogenizing flash frozen cubes of tissue using a customized tissue mincing device was evaluated. Samples prepared for the comet assay by this method compared favorably in quality to fresh and frozen tissue samples prepared by mincing during necropsy. Moreover, low baseline DNA damage was measured in cells from frozen cubes of tissue following prolonged storage.

This protocol describes several procedures for preparing high quality frozen tissue samples at the time of necropsy for use in the comet assay to assess DNA damage: 1) minced tissue, 2) scraped epithelial cells from the gastrointestinal tract, and 3) cubed tissue samples, requiring homogenization using a tissue mincing device.

DNA Hasarının Değerlendirilmesinde Kuyruklu Yıldız Testinde Donmuş Dokunun Kullanımı

The comet assay is gaining popularity as a means to assess DNA damage in cultured cells and tissues, particularly following exposure to chemicals or other ...

Genetik

Assaying DNA Damage in Hippocampal Neurons Using the Comet Assay

A number of drugs target the DNA repair pathways and induce cell kill by creating DNA damage. Thus, processes to directly measure DNA damage have been extensively evaluated. Traditional methods are time consuming, expensive, resource intensive and require replicating cells. In contrast, the comet assay, a single cell gel electrophoresis assay, is a faster, non-invasive, inexpensive, direct and sensitive measure of DNA damage and repair. All forms of DNA damage as well as DNA repair can be visualized at the single cell level using this powerful technique.
	The principle underlying the comet assay is that intact DNA is highly ordered whereas DNA damage disrupts this organization. The damaged DNA seeps into the agarose matrix and when subjected to an electric field, the negatively charged DNA migrates towards the cathode which is positively charged. The large undamaged DNA strands are not able to migrate far from the nucleus. DNA damage creates smaller DNA fragments which travel farther than the intact DNA. Comet Assay, an image analysis software, measures and compares the overall fluorescent intensity of the DNA in the nucleus with DNA that has migrated out of the nucleus. Fluorescent signal from the migrated DNA is proportional to DNA damage. Longer brighter DNA tail signifies increased DNA damage. Some of the parameters that are measured are tail moment which is a measure of both the amount of DNA and distribution of DNA in the tail, tail length and percentage of DNA in the tail. This assay allows to measure DNA repair as well since resolution of DNA damage signifies repair has taken place. The limit of sensitivity is approximately 50 strand breaks per diploid mammalian cell 1,2. Cells treated with any DNA damaging agents, such as etoposide, may be used as a positive control. Thus the comet assay is a quick and effective procedure to measure DNA damage.

The comet assay is an efficient way of detecting single- and double-strand breaks, including alkali-labile sites and DNA-DNA/DNA-protein cross-links on the DNA in all cells including hippocampal neurons. The method takes advantage of the differential migration of DNA in an electric field due to differences in amount of DNA damage.

Comet Assay kullanma Hipokampal Nöronlar DNA Hasarı assaying

A number of drugs target the DNA repair pathways and induce cell kill by creating DNA damage. Thus, processes to directly measure DNA damage have been ...

Nörobilim

Application of an In vitro DNA Protection Assay to Visualize Stress Mediation Properties of the Dps Protein

Oxidative stress is an unavoidable byproduct of aerobic life. Molecular oxygen is essential for terrestrial metabolism, but it also takes part in many damaging reactions within living organisms. The combination of aerobic metabolism and iron, which is another vital compound for life, is enough to produce radicals through Fenton chemistry and degrade cellular components. DNA degradation is arguably the most damaging process involving intracellular radicals, as DNA repair is far from trivial. The assay presented in this article offers a quantitative technique to measure and visualize the effect of molecules and enzymes on radical-mediated DNA damage.
The DNA protection assay is a simple, quick, and robust tool for the in vitro characterization of the protective properties of proteins or chemicals. It involves exposing DNA to a damaging oxidative reaction and adding varying concentrations of the compound of interest. The reduction or increase of DNA damage as a function of compound concentration is then visualized using gel electrophoresis. In this article we demonstrate the technique of the DNA protection assay by measuring the protective properties of the DNA-binding protein from starved cells (Dps). Dps is a mini-ferritin that is utilized by more than 300 bacterial species to powerfully combat environmental stressors. Here we present the Dps purification protocol and the optimized assay conditions for evaluating DNA protection by Dps.

Application of an In vitro DNA Protection Assay to Visualize Stress Mediation Properties of the Dps Protein

The DNA-binding protein from starved cells (Dps) plays a crucial role in combating bacterial stress. This article discusses the purification of E. coli Dps and the protocol for an in vitro assay demonstrating Dps-mediated protection of DNA from degradation by reactive oxygen species.

Bir uygulama<em&gt; In vitro</emDPS Protein Stres Arabuluculuk Özellikleri gözünüzde canlandırın için&gt; DNA Koruma Testi

Oxidative stress is an unavoidable byproduct of  aerobic life.  Molecular oxygen is  essential for terrestrial metabolism, but it also takes part in many ...

In Vivo Alkaline Comet Assay and Enzyme-modified Alkaline Comet Assay for Measuring DNA Strand Breaks and Oxidative DNA Damage in Rat Liver

Unrepaired DNA damage can lead to genetic instability, which in turn may enhance cancer development. Therefore, identifying potential DNA damaging agents is important for protecting public health. The in vivo alkaline comet assay, which detects DNA damage as strand breaks, is especially relevant for assessing the genotoxic hazards of xenobiotics, as its responses reflect the in vivo absorption, tissue distribution, metabolism and excretion (ADME) of chemicals, as well as DNA repair process. Compared to other in vivo DNA damage assays, the assay is rapid, sensitive, visual and inexpensive, and, by converting oxidative DNA damage into strand breaks using specific repair enzymes, the assay can measure oxidative DNA damage in an efficient and relatively artifact-free manner. Measurement of DNA damage with the comet assay can be performed using both acute and subchronic toxicology study designs, and by integrating the comet assay with other toxicological assessments, the assay addresses animal welfare requirements by making maximum use of animal resources. Another major advantage of the assays is that they only require a small amount of cells, and the cells do not have to be derived from proliferating cell populations. The assays also can be performed with a variety of human samples obtained from clinically or occupationally exposed individuals.

In Vivo Alkaline Comet Assay and Enzyme-modified Alkaline Comet Assay for Measuring DNA Strand Breaks and Oxidative DNA Damage in Rat Liver

The alkaline comet assay measures DNA strand breaks in eukaryotic cells. By adding an Endonuclease III or human 8-oxoguanine-DNA-N-glycosylase digestion step, the assay can efficiently detect oxidative DNA damage. We describe methods for using these assays to detect DNA damage in rat liver.

Sıçan Karaciğer DNA Strand Breaks ve Oksidatif DNA Hasar Ölçüm Vivo Alkali Comet Assay ve Enzim-modifiye Alkali Comet Tahlili

Unrepaired DNA damage can lead to genetic instability, which in turn may enhance cancer development. Therefore, identifying potential DNA damaging agents ...

A High-Throughput Comet Assay Approach for Assessing Cellular DNA Damage

Cells are continually exposed to agents arising from the internal and external environments, which may damage DNA. This damage can cause aberrant cell function, and therefore DNA damage may play a critical role in the development of, conceivably, all major human diseases, e.g., cancer, neurodegenerative and cardiovascular disease, and aging. Single-cell gel electrophoresis (i.e., the comet assay) is one of the most common and sensitive methods to study the formation and repair of a wide range of types of DNA damage (e.g., single- and double-strand breaks, alkali-labile sites, DNA-DNA crosslinks, and, in combination with certain repair enzymes, oxidized purines, and pyrimidines), in both in vitro and in vivo systems. However, the low sample throughput of the conventional assay and laborious sample workup are limiting factors to its widest possible application. With the "scoring" of comets increasingly automated, the limitation is now the ability to process significant numbers of comet slides. Here, a high-throughput (HTP) variant of the comet assay (HTP comet assay) has been developed, which significantly increases the number of samples analyzed, decreases assay run time, the number of individual slide manipulations, reagent requirements, and risk of physical damage to the gels. Furthermore, the footprint of the electrophoresis tank is significantly decreased due to the vertical orientation of the slides and integral cooling. Also reported here is a novel approach to chilling comet assay slides, which conveniently and efficiently facilitates the solidification of the comet gels. Here, the application of these devices to representative comet assay methods has been described. These simple innovations greatly support the use of the comet assay and its application to areas of study such as exposure biology, ecotoxicology, biomonitoring, toxicity screening/testing, together with understanding pathogenesis.

The comet assay is a popular means of detecting DNA damage. This study describes an approach to running slides in representative variants of the comet assay. This approach significantly increased the number of samples while decreasing assay run-time, the number of slide manipulations, and the risk of damage to gels.

Hücresel DNA Hasarını Değerlendirmek için Yüksek Verimli Bir Kuyruklu Yıldız Testi Yaklaşımı

Cells are continually exposed to agents arising from the internal and external environments, which may damage DNA. This damage can cause aberrant cell ...

Comet Assay for DNA Damage Detection in Cells

To begin, prepare 0.6% low melting point agarose in PBS, and place it in a water bath at 37 degrees Celsius. Labeled the frosted end of the pre-coated slides with name, date, and treatment information using a permanent marker or pencil.
Place a chilling plate on a flat bench, and insert two frozen cooling packs into the sliding drawer below the metal surface. Then, place the slides on the chilling plate to pre-chill for 1 to 2 minutes. Centrifuge and remove the supernatant from the sample tubes, and place them immediately back on ice. Resuspend the cell pellet with 200 microliters of 0.6% low melting point agarose, and mix by pipetting.
Next, add 80 microliters of agarose-containing cells onto a chilled slide, and quickly place a coverslip on the gel. Allow the gel to set on the chilling plate for 1 to 2 minutes. In the meantime, prepare 500 milliliters of working solution of lysis buffer, and pour it into the lysis dish.
After the gels have set, remove the coverslips quickly by gently holding the slide between thumb and forefinger, and sliding the coverslip off the gel. Then, place the slides inside a slide carrier, with all the black dot marks on the slides facing in the same direction. Place the slide carrier inside the lysis dish. Close the lid of the lysis dish, and put it for incubation.
Carefully remove the slide carrier from the lysis dish without disturbing the gels. Gently, place the slide carrier in a washing dish pre-loaded with ice-cold double-distilled water. Ensure that the slides are completely submerged, and leave the setup for 30 minutes.
Place a frozen cooling pack under the electrophoresis tank to maintain optimal buffer temperature. Then, add ice-cold electrophoresis working solution to the tank, and transfer the slide carrier into it. Orient the slides, such that the cell containing gels point toward the cathode.
Incubate the slides in the electrophoresis tank for 20 minutes, to allow the DNA to unwind. Then, turn on the power supply to perform electrophoresis for 20 minutes at 1.19 volts per centimeter. After the electrophoresis is complete, turn off the power supply, and remove the slide carrier from the electrophoresis tank. Allow the slide carrier to drain on tissue paper for 30 seconds.
Next, place the slide carrier into a dish containing neutralization buffer, and leave it for 20 minutes. Following this, place it in a washing dish containing ice-cold double-distilled water, and leave it for 20 minutes. After washing, remove the slide carrier from the water, and allow the slides to dry in an incubator at 37 degrees Celsius for 1 hour.
To rehydrate the slides, transfer the slide carrier to a washing dish containing ice-cold double-distilled water and leave it for 30 minutes. Then, place the slide carrier into a staining dish containing 2.5 micrograms per milliliter propidium iodide solution.
Close the lid of the staining dish, and incubate it for 20 minutes in the dark at room temperature. After incubation, transfer the slide carrier to a separate dish, and wash it with ice-cold double-distilled water for 20 minutes.
Remove the slide carrier from the dish, and dry it completely in the dark, either in a 37 degrees Celsius incubator or at room temperature. After the slides dry completely, store them in a slide box in the dark until ready for image analysis.

Hücrelerde DNA Hasarı Tespiti için Comet Deneyi

JoVE Encyclopedia of Experiments

Biyolojik Teknikler

Tahlil Teknikleri

Hücre bazlı analizler

EoE Sub Articles

Thiobarbituric Acid-Reactive Substances Assay to Assess Oxidative Stress in Human Serum

Label the glass tubes for the samples to be analyzed, then, add 100 microliters of the prepared sample to each tube. Add 200 microliters of 8.1% SDS to each sample, and gently swirl the glass tube in a circular motion to mix.
Add 1.5 milliliters of 3.5 molar sodium acetate buffer to each sample. Then, add 1.5 milliliters of aqueous 0.8% thiobarbituric acid solution. Bring the final volume in each tube to 4 milliliters by adding 700 microliters of deionized water. Tightly cap the glass tubes, and incubate them in a heating block set to 95 degrees Celsius for 1 hour. Cover the tubes with aluminum foil to prevent condensation. Then, remove the tubes from the block and incubate them on ice for 30 minutes.
After the incubation, centrifuge the samples and standards at 1,500 x g for 10 minutes at 4 degrees Celsius. Transfer 150 microliters of supernatant from each tube to a well in a 96-well plate, removing any air bubbles with a pipette tip.
Measure the absorbance of the samples at 532 nanometers. Then, subtract the average absorbance reading of the blank samples from all other absorbance readings.
Create a standard curve and use it to calculate unknown sample concentrations.

Sistemik Oksidatif Stresin bir Dolaylı Tedbir olarak Comet Assay

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler