Bu uygun maliyetli yöntem, FXS ve Fragile X ile ilgili bozuklukların moleküler tanı ve taramasında geniş uygulamalar bulabilir. Bu dönüş süresi hızlı ve ekipman daha az yatırım. PCR tabanlı testimiz, sağlamlık ve hızlı raporlama süresi ile orta, ön mutasyon ve tam mutasyon da dahil olmak üzere FXS ve Fragile X ile ilişkili bozuklukların tam spektrumunun sınıflandırını kolaylaştırabilir.
Prosedür PerkinElmer Singapur Weng Chua tarafından gösterilecek. PCR arabellek karışımını, numune dilüentve DNA örneklerini 20 derecelik santigrat dondurucudan çıkararak ve çözülmek için 20 ila 30 dakika oda sıcaklığında bırakarak başlayın. Reaktifleri kullanmadan önce girdap ve kısaca aşağı çevirin.
DNA numune konsantrasyonunu bir spektrofotometre ile ölçün ve gerekirse numune seyreltici ile mikrolitre başına 25 nanograma seyreltin. Referans ı belirlemek ve DNA örneklerini test etmek ve test, referans ve negatif kontrol örnekleri için gerekli reaksiyon sayısını hesaplamak için bir PCR plakasının kuyularını etiketleyin. Her reaksiyon için 15 mikrolitre PCR tampon karışımını 0,6 mikrolitre numune dilüent ve 0,4 mikrolitre polimeraz ile birleştirerek PCR ana karışımıhazırlayın.
Karışımı girdap ve aşağı çevir. Sonra her kuyuya karışımın 18 mikrolitre sini dağıtın. Sonra pipet uygun kuyuya her DNA iki mikrolitre.
Reaktifleri beş kez yukarı ve aşağı borular oluşturarak karıştırın, sonra plakayı kapatın. Plakayı termocycler'a yerleştirin ve PCR'yi el yazması talimatlara göre çalıştırın. Kuvöz çalkalayıcıyı 65 santigrat dereceye önceden ısıtın ve her PCR ürününe 80 mikrolitre 1X TE tampon ekleyin.
Örnekleri PCR temizleme plakasına aktarmak ve plakayı çalkalayıcıya koymak için çok kanallı bir pipet kullanın. 1200 RPM'de 10 dakika sallayarak 65 derecede kuluçkaya yatırın. Kuluçkadan sonra, kuluçka makinesini 25 santigrat dereceye kadar soğutun, vakum aletini 250 milibar'a ayarlayın ve çözeltiyi filtreden aspire edin.
15 dakika sonra, kuyularda sıvı kalmamalıdır. Vakum kapatın ve her kuyuya 50 mikrolitre 1X TE tampon ekleyin. Önceki vakum ayarlarını kullanarak çözümü 10 dakika aspire edin.
Filtre plakasının alt kısmını kağıt havlu yığınına sıkıca bastırarak kurulayın ve her kuyunun alt merkezine 20 mikrolitre 1X TE tampon ekleyin. Beş dakika boyunca 1200 RPM sallayarak 25 santigrat derece de shaker ve kuluçka plaka yerleştirin. Kuluçkadan sonra, saflaştırılmış PCR ürününün en az 15 mikrolitresini yeni bir 96 iyi PCR plakasına aktarın.
Başlamadan önce, DNA boya sıyrık, DNA jel matrisi, DNA marker, DNA merdiveni ve saflaştırılmış DNA örneklerini oda sıcaklığına getirin. Şırıngayı değiştirerek ve taban plakasını ayarlayarak astar istasyonunu ayarlayın, ardından şırınga klibinin kolu serbest bırakın ve üst konuma kaydırın. Boyutlandırma yazılımı başlatın ve jel boya karışımı hazırlamak.
Girdap boya konsantresi 10 saniye, sonra aşağı spin. Sonra, bir jel matris şişe ve girdap çözeltisi karıştırmak için boya 25 mikrolitre ekleyin. Jel boya karışımını bir spin filtresine aktarın, santrifüje yerleştirin ve 1500 kez g'de 10 dakika döndürün.
Jel boya karışımını yüklemeye hazır olduğunuzda, astar istasyonuna yeni bir DNA çipi yerleştirin ve G.Close astar istasyonunu işaretleyen kuyuya jel boya karışımının dokuz mikrolitresini ekleyin ve pistonun bir mililitrelik işarete yerleştirildiğinden emin olun. Şırınga pistonuna klip tarafından tutulana kadar bastırın. Tam olarak 30 saniye bekleyin ve ardından klibi bırakın.
Beş saniye daha bekleyin ve sonra yavaşça bir mililitre konumuna geri piston çekin. Astar istasyonu açın ve bir merdiven sembolü ve her 12 örnek kuyuile işaretlenmiş içine işaretleyici beş mikrolitre G.Add işaretli işaretli içine jel boya karışımı dokuz mikrolitre ekleyin. Merdiven sembolü ve numune kuyularına BIR mikrolitre PCR ürünü veya su ile birlikte bir mikrolitre merdiven ekleyin.
2400 RPM'de bir dakikalığına çipi gir. Biyoanalizöre yerleştirin ve çipi beş dakika içinde çalıştırın. Çalıştırma tamamlandığında, en yüksek verileri csv tablo dosyaları olarak dışa aktarın.
Referans örnek olarak bir premutasyon kadın örneği ve tam mutasyon kadın örneği kullanılır. Bir üst ve alt marker tepe parçası boyutu profiline dahildir ve genellikle yaklaşık 95 baz çiftleri bir astar karmaşık tepe vardır. Bu referans örnekleri bir regresyon standart eğrisi oluşturmak için kullanılır.
Doğrusal regresyon standart eğrisi daha sonra bilinmeyen örneklerin tekrar boyutlarını hesaplamak için kullanılır. Klinik normal, ara, premütasyon öncesi, tam mutasyon ve mozaik tam mutasyon örnekleri bu yöntemle doğru olarak sınıflandırılabilir. Bazı durumlarda, normal homozigot alellerin varlığınedeniyle mikroakışkan elektroforez sonuçlarında sadece bir tepe gösterilir.
Bir tür suboptimal sonuç, belirsiz veya yorumlanamayan temel önyargıdır ve alet arızalarından kaynaklandığından şüphelenilir. Bu yordamı denerken, protokolü başlatmadan önce uygun miktarda DNA ve kalite sağlamak önemlidir. AGG kesinti modelini tanımlamak için FMR1 gen dizilemesi yapılabilir.
Ve metilasyona duyarlı restriksiyon enzimi veya bisülfit modifikasyon talimi metilasyon durumunu izlemek için kullanılabilir. Bu hızlı, sağlam ve uygun maliyetli bir tekniktir. Bu FXS ve Kırılgan X ilişkili bozuklukların taşıyıcı durumu üzerinde nüfus tabanlı bir çalışma yürüten diğer araştırmacılar alacaktır.
