DNA parmak izi biyolojik bilimlerde yaygın bir araçtır ve babalık testlerinin yanı sıra adli veya filogenetik çalışmalarda da uygulanır. Bu protokol, lisans öğrencilerine laboratuvar sınıflarında DNA parmak izi almanın temel ilkelerini sağlamak için tasarlanmıştır. Alellerin bireyler arasında uzunluk bakımından farklılık gösterilebileceği değişken sayıda tandem tekrar bölgesi olan insan D1S80 lokus'a dayanır.
DNA ekstraksiyonu, PCR, jel elektroforez ve sonraki analizler, özellikle ilk kez yapılırsa, yapılması zor olabilir. Tüm adımların görsel gösterimi, izleyicilerin bu çok sağlam protokolü gerçekleştirirken genel uygulamaları, ayrıntıları ve alınması gereken önlemleri gözlemlemelerini sağlar. Buccal mukoza epitel hücrelerinden DNA çıkarmak için, steril bir oral çubuk kullanarak hücreleri toplayarak başlayın.
Yanağın içine 30 ila 40 saniye boyunca kuvvetlice sürmek için bir bez kullanın. Toplama çubuğu ucunu etiketli steril mikro santrifüj tüpüne yerleştirin ve kenarın ötesine uzanan plastik uzunluğunu kırın ve tüpü kapatın. Bir ısıtma bloğunu 65 santigrat dereceye kadar önceden ısıtın ve gerekli tüm tamponları ve çözeltileri hazırlayın.
Numunenin tamamen iyse çözeltisine daldırıldığından emin olarak bezeye 500 mikrolitre lyse çözeltisi ekleyin ve numuneyi en az beş saniye boyunca girdaplayın. Numuneyi ara sıra 65 santigrat derecede ve girdapta 10 dakika kuluçkaya yatırın. Kuluçkadan sonra, maksimum numune hacmi elde etmek için tüp duvarına bastırarak çubuğu çıkarın.
Lyse hücrelerine 100 mikroliter denatürasyon tamponu ekleyin ve beyaz bir çökelti görünene kadar tüpü ters çevirerek iyice karıştırın. Oda sıcaklığında beş dakika kuluçkaya yatırın, sonra numuneyi 17,950 G'de beş dakika santrifüjleyin.Süpernatantın 450 mikrolitresini temiz, 1,5 mililitrelik bir mikro santrifüj tüpüne aktarın. Daha sonra 450 mikroliter iso 2-propanol ekleyin ve DNA'yı çökeltmek için tüpü ters çevirerek iyice karıştırın.
Oda sıcaklığında beş dakika kuluçkaya yatır ve beş dakika santrifüj. Üstnatan atın ve tüpü temiz bir kağıt havluya çevirin ve peleti kurulayın. DNA'yı %70 etanolden 500 mikroliterle yıkayın, bir dakika içinde santrifüj ve süpernatantı atın.
Peletin tamamen kurutılması için, numuneyi bir ısıtma bloğunda 65 santigrat derecede beş dakika kuluçkaya bırakın. Son olarak, 30 mikrolitre yağ tamponu ekleyin ve DNA sys'lerini devre dışı bırakmak için 65 santigrat derecede 10 dakika kuluçkaya yatırın. Mikro santrifüj tüpüne yeşil PCR tamponu, DNTP'ler, astarlar, su ve polimeraz ekleyerek ana karışımı hazırlayın.
PCR tüplerini örnek numaralarla ve PCR ana karışımının 45 mikrolitresini her PCR tüpüne etiketle. Ardından, beş mikrolitre DNA ekleyin veya şablonsuz kontrol için su ekleyin. PCR tüplerini kapatın ve kısa bir süre santrifüjlayın.
Tüpleri termal çevrim içine yerleştirin ve PCR programını başlatın. Program tamamlandığında, bir sonraki işleme kadar örnekleri dört santigrat derecede saklayın. 1 1/2 gram agarose tozu tartarak ve bir şişede 100 mililitre TAE tampon çözeltisi ile karıştırarak% 1,5 agarose jel hazırlayın.
Agarose karışımını bir mikrodalga fırında dikkatlice ısıtın ve karışımı agarose tamamen çözünene kadar arada döndürün. Kaynama gecikmelerinin yaşanabileceğini unutmayın. Agarose karışımının kısa bir soğutularak soğutulduğunun ardından iki mikrolitre Pec yeşili ekleyin.
Jeli dökün ve numuneler için yeterli kuyuya sahip bir tarak kullanın. Agarose jelin tam polimerizasyonundan sonra, kuyuları PCR örneklerinin her birinin 10 mikroliteri ile yükleyin ve yan kuyulara moleküler ağırlık standardı ekleyin. Jeli yaklaşık 40 dakika boyunca 150 voltta çalıştırın.
PCR ürünlerini görselleştirmek için jeli ultraviyole ışık kullanarak görüntüleyin. Güçlendirilmiş D1S80 alellerinin analizi için, fotoğraf jeli görüntüsündeki kuyulardan başlayarak moleküler ağırlık standardının yanına bir cetvel yerleştirin. Ağırlık standardının her bandı için mesafeyi ölçün ve uzunlukları bir tablo hesaplama programına kaydedin.
Ardından, ağırlık standardının her parça boyutunun logaritma'sını belirleyin. Günlük dönüştürülmüş, ağırlık standardı parça boyutlarını ve jelinizden ölçülen mesafeleri kullanarak bir dağılım pilotu yerleştirin. Bir eğilim çizgisi sığdırın ve regresyon denklemini ve R-kare değerini görüntüleyin.
Yeni bir tabloda, PCR ampliconlarından kuyulara olan ölçü mesafelerini ekleyin. Bu ampliconların boyutunu belirlemek için doğrusal regresyondan regresyon denklemini kullanın ve ampliconlardan temel çiftler halinde parça boyutlarını elde etmek için antilog'ı hesaplayın. Son olarak, ölçülen her amplicon'a 16 baz çiftin tekrar birimlerini atayın.
DNA'nın çıkarılması ve D1S80 lokusun amplifikasyonu, çalışılan tüm bireyler için başarılı oldu ve şerit 10'daki şablonsuz kontrol herhangi bir amplicon göstermedi. Parça uzunluğu analizinden, bireyler iki alel ile homozigöz veya heterozygöz olarak sınıflandırıldı. Tandem tekrarlarının tekrar birimlerinin sayısı açıkça ilişkiliydi ve artık daha fazla analiz için hizmet edebilir.
Burada, lisans pratik sınıflarında moleküler parmak izi uygulaması için basit ve uygun maliyetli bir yöntem açıklanmaktadır. Tüm prosedür tek bir iş günü içinde tamamlanabilir ve dört farklı adımdan oluşur. İlk adımda, DNA şablonu hazırlanır.
Bukal epitel hücreleri svap örneklemesi ile toplanır. Oral sürüntüler, DNA ekstraksiyonu için yeterli miktarda ve kalitede hücre sağlamak için güvenilir bir araçtır. Ayrıca, DNA ekstraksiyon protokolünde lisans laboratuvar sınıflarında avantajlı olan organik çözücüler kullanılmamaktadır.
Birinci adım 90 dakika veya daha kısa sürede tamamlanabilir. İkinci adımda, D1S80 locus PCR ile güçlendirilir. Burada sunulan PCR koşulları, DNA şablonunun kalitesiz olması durumunda bile sağlamdır.
Bu adım 2,5 saatte tamamlanabilir. PCR ürünleri daha sonra agarose jel elektroforez ile analiz edilir. Agarose jel elektroforezi, tehlikeli bileşenlerden kaçınma ve basit bir hazırlama tekniği gibi diğer tekniklere kıyasla birçok avantaja sahiptir.
Bu analiz 90 dakikada tamamlanabilir. Elektroforezden sonra, parça uzunluğu sonuçları doğrusal regresyon analizi ile 90 dakika içinde analiz edilebilir, bir tablo hesaplama programı kullanılarak veya basit bir hesap makinesi kullanılarak gerçekleştirilir. Özetle, sunulan parmak izi yöntemi, moleküler belirteçlerin kullanımını ve biyolojik bilimde uygulanmasını öğretmek için uygulamalı pratiklerde kullanılabilir.
