Mekanik mikroortamın hücre sinyalizasyonu ve göçü üzerindeki etkisi ne kadar takdir edilebilip bulunulmaktadır. Tek tek hücreye mekanik stimülasyon sağlamak için benzersiz, deneysel yaklaşımların kullanılmasını gerektirir. Bu teknik, bir hücrenin altındaki mekanik mikro ortamın gerçek zamanlı olarak dinamik olarak manipüle edilebilmektedir.
Hücre göçü davranışında mekanik olarak düzenlenmiş değişikliklerin ve hücre altı sinyal olaylarının gözlemlemesine izin vermek. Prosedürü benimle birlikte gösteren nyla Naim, bir post-doc ve Johnathan Patterson, bizim laboratuvar bir teknisyen olacaktır. Her alt kapak fişinin cam yüzeyini 20 saniye boyunca etkinleştirmek için bir Chorono-1 kullanarak başlayın, her kapak fişinin üzerine hemen 50 mikrolitre bağlama silane çalışma çözeltisi döşenmeden önce.
Kapağı durulamadan önce çözeltinin %95 etanol ve iki kez isopropanol ile iki kez durulanmadan önce 10 dakika kurumasını bekleyin. Daha sonra, kapak fişleri yaklaşık 20 dakika kuru hava sağlar. Floresan mikro boncuk birikimi için, ilk bir saat boyunca çalışan mikro boncuk çözeltisi sonicate.
Sonication'ın bitiminden 15 dakika önce, aktif kapak fişlerini seramik kapak tutucuya dikey olarak yerleştirin ve tutucuyu üç dakika boyunca oda havaplazması tedavisi için masa üstü plazma temizleyicisine aktarın. Daha sonra, 60 mililitre petri çanak kapakları parafin film parçaları yerleştirin ve film ve coverslip arasında iyi bir temas sağlamak için hafifçe her kapak fişi dokunarak, filmler üzerine kapak fişleri yerleştirin. Daha sonra, her coverslip üstüne çalışan boncuk çözeltisi 150 mikrolitre ekleyin ve hemen coverlips kenarından etanol çözeltisi aspire, coverslip üzerinde boncuk bırakarak.
Hydrogels'i hazırlıklarından hemen sonra atmak için, her alt kapağın aktif tarafına 25 mikrolitrelik bir Hydrogel çözeltisi damlatın ve hemen boncuklu üst kapakları damlacık üzerine ters çevirin. Kapakları nazikçe çıkarmak için forseps kullanmadan önce jellerin 30 dakika polimerize olmasını bekleyin. Sonra, yıkama başına taze 50 miliMoler Hepes üç, beş dakika yıkar ile jelleri durulayın.
Hydrogels yüzeyleri etkinleştirmek için, taze jeller kuluçka 50 miliMoler Hepes, 0.4 miliMolar Sulfo Sanpah ile takviye, ve hemen kapalı bir alanda ultraviyole kemer lamba jelleri maruz 90 saniye. Aktivasyon sonunda, taze Hepes üç, beş dakikalık yıkar ile jelleri yıkayın ve 37 santigrat derece bir saat için fibronectin mililitre başına 20 mikrogram ile aktive Hydrogels tedavi. Kuluçka sonunda, aşırı fibronektin çözeltisi aspire ve yıkama başına beş dakika PBS üç kez jelleri yıkayın.
Son yıkamadan sonra Hydrogels'i küçük bir hacimde PBS'ye yerleştirin ve jelleri bir doku kültürü başlığında ultraviyole ışık altında 15 dakika sterilize edin. Sonra, taze PBS bir kez jelleri yıkayın. Hücre kaplaması için, tohum 2.1 kez 10 orta başına üç mililitre ilgi hücrelerinin dört ve hücrelerin 4 ila 18 saat boyunca 37 derece santigrat yapışmasını sağlar.
Hücreler dengelenirken, bir milimetre çapında 100 milimetre uzunluğunda borosilicate cam mikro-pipet çekmek için bir mikro-pipet çekmece kullanın, ilk milimetre çapı yaklaşık 50 mikrometre ye kadar azaltır iki milimetrenin üzerinde bir konik elde etmek için, ve son milimetre içinde uzun, paralel 10 mikrometre çapında tüp kadar uzanır. Daha sonra, pipeti bir mikroforge içine yükleyin ve pipet insanın geri kalanından yaklaşık 35 derece melek bükülmüş bir 250 mikrometre bölümü tam sonunda kapalı bir 15 mikrometre körpli ucu var şekli. Bükümde yaklaşık çapı ucuna mukavemet vermek için yaklaşık 30 mikrometre olmalıdır.
Daha sonra, ters bir mikroskop aşamasına bir Hydrogel yerleştirin. Orta yı mineral yağile kaplayın ve 10x hedefini seçin. Hazırlanan mikro pipeti %70 alkol le sterilize edin.
Daha sonra, çanağa doğru işaret kanca ile mikro-pipet tutucu içine takın ve kanca sadece sıvı yüzeyine dokunan kadar pipet düşürmek için ders manipülatör kullanın. Mikroskobu jelin üst kısmına yapışan hücrelere odakla ve amacın numuneye veya aşamaya çarpma tehlikesi olmadığına dikkat edin, mikro pipetin ucunu bulmak için odağı jelin üzerine getirin. Ucu odak düzlemine dik olana kadar pipeti döndürün, böylece mikro pipetin körelmiş ucu aşağı yaslanır ve gerektiğinde pipetin ucuna yeniden odaklanın.
Pipetin jel yüzeyinden ne kadar uzakta olduğunu ölçmek için hücre katmanına geri odaklanın ve jel ile pipetin ucu arasında yarı yolda olan bir düzleme odaklanın. Daha sonra, ara odak düzlemine ulaşmak için pipeti yavaşça indirin ve pipeti Hydrogel'in yüzeyinin hemen üzerinde gezinene kadar indirmeden önce deneyde kullanılacak olana büyütmeyi artırın. Mikro-manipülatör kalibrasyonu için, hücrelerden yoksun bir alanı, boncuklu bir alanı, ama manipülasyon yok, pipet jeli çekerek ve devreye giren pipetle jeli çekerek görüntüleyin.
Daha sonra, nişan olmadan boncuk alanları için boncuk alanları karşılaştırmak için görüntü J kullanın, jel meşgul ile boncuk alanları, ve göreceli boncuk deplasmanları ve jeller uygulanan kuvvet hesaplamak için çekilen jel. Durotaksis titretisi yapmak için, yönlendirilmiş bir şekilde hareket eden hücreleri tanımlamak için bir grup hücreyi 30 dakika boyunca izleyin. Tek bir yönde sürekli hareket eden bir hücre seçin ve istenen kare hızındaki hücreleri 30 dakika daha izleyin.
Daha sonra, pipeti seçili hücrenin ön kenarının yakın tarafının yaklaşık 50 mikrometre önüne yerleştirin ve mikro manipülatörü jelin ortogonal olarak hücrenin hareket yönüne doğru hareket ettirin. Daha sonra, hidrojel sertliğinin akut, lokal degradesine yanıt verebilmek için hücreyi zaman içinde gözlemleyin. Gösterildiği gibi bu tekniği kullanarak, sıçan embriyonik fibroblastlar bir cam mikro-pipet tarafından uygulanan degradelerde artan sertlik doğru hareket.
Sıçan embriyonik fibroblast hücreleri, geçici 125 kilopascal poliakrilamid jeller üzerinde vinkülin gerilim sensörü ifade de 40 dakikalık bir süre boyunca streç yönde fokal yapışıklıkoluşumunu göstermektedir. Forster Rezonans Enerji Transferi analizi, fokal yapışıklıklara lokalize vinkülin, akut durotaktik stimülasyon ile sunulduğunda gerginlikte ani bir değişim yaşadığını ortaya koymaktadır. Durotaktik stimülasyona yanıt olarak, bu tazyiğin yararını hücre altı sinyal olaylarının gözlemine genişletmek.
Bir hücreyi germek için birden fazla girişimde bulunursanız veya deneme sırasında mikroiğne kayıyorsa, birden fazla, değişken, mekanik uyaran vermemek için yeni bir hücreyle baştan başlayın. Durotaksisi'ni atama ya da bu teknik, mechanotransdüksiyonda yer alan moleküler mekanizmaların çizgilendirilmesine yardımcı olmak için biyosensörler, RNAI veya gen düzenleme gibi genetik yaklaşımlarla birleştirilebilir.
