기계적 미세 환경이 세포 신호 및 마이그레이션에 미치는 영향에 대한 인식이 증가하고 있습니다. 개별 셀에 기계적 자극을 전달하기 위해 독특하고 실험적인 접근 방식을 사용해야 합니다. 이 기술은 실시간으로 셀 아래 기계 마이크로 환경의 동적 조작을 할 수 있습니다.
세포 이동 거동 및 세포 외 신호 이벤트의 기계적 조절 된 변화를 관찰 할 수 있습니다. 저와 함께 절차를 시연하는 것은 박사 후 의자인 닐라 나임(Nyla Naim)과 실험실의 기술자인 조나단 패터슨이 될 것입니다. 초로노-1을 사용하여 각 하단 커버 슬립의 유리 표면을 20초 동안 활성화한 후, 각 커버 슬립에 바인드 시레인 작업 용액 50마이크로리터를 즉시 과도하게 놓는 것입니다.
95%에탄올로 두 번, 이소프로판올로 두 번 덮개를 헹구기 전에 10분 동안 용액을 건조시키십시오. 그런 다음 커버 슬립이 약 20 분 동안 공기 건조되도록하십시오. 형광 마이크로 비드 증착의 경우 먼저 작동 마이크로 비드 솔루션을 1 시간 동안 초음파 처리합니다.
초음파 처리가 끝나기 15분 전에 활성화된 커버 슬립을 세라믹 커버 슬립 홀더에 수직으로 놓고 홀더를 테이블 상단 플라즈마 클리너로 옮겨 실내 공기 플라즈마 처리를 3분 동안 처리합니다. 다음으로, 파라핀 필름 조각을 60밀리리터 페트리 접시 뚜껑에 놓고 커버 슬립을 필름에 가볍게 두드려 필름과 커버슬립 사이의 좋은 접촉을 보장합니다. 그런 다음, 각 커버슬립의 상단에 작업 비드 솔루션 의 150 마이크로 리터를 추가하고 즉시 커버슬립의 측면에서 에탄올 용액을 흡인하여 커버슬립에 구슬을 남깁니다.
준비 직후 하이드로겔을 캐스팅하려면 하이드로겔 용액 25개 소리터 액수를 각 하단 커버슬립의 활성화된 면에 추가하고 구슬이 있는 상단 커버립, 구슬면을 아래로 아래로 뒤집어 물방울에 즉시 넣습니다. 겔이 포셉을 사용하여 커버립을 부드럽게 제거하기 전에 30 분 동안 중합되도록 하십시오. 그런 다음 젤을 3분, 5분간 세척할 때 신선한 50밀리몰러 헤페스로 씻어낸다.
하이드로겔 표면을 활성화하려면 0.4 밀리몰러 설포 산파로 보충된 신선한 50밀리몰러 헤페스로 젤을 배양하고, 밀폐된 지역의 자외선 아치 램프에 즉시 젤을 노출시합니다. 활성화가 끝나면 신선한 헤페스로 3분, 5분 세척하여 젤을 씻고, 활성 하이드로겔을 섭씨 37도에서 1시간 동안 섬유네틴 밀리리터당 20마이크로그램으로 처리합니다. 인큐베이션이 끝나면 과도한 섬유네틴 용액을 흡인시키고, 세척당 5분 동안 PBS에서 젤을 세 번 세척한다.
마지막 세척 후, 하이드로겔을 소량의 PBS에 놓고 조직 배양 후드에 울트라 바이올렛 빛 아래에서 15 분 동안 젤을 살균하십시오. 그런 다음, 신선한 PBS에서 젤을 한 번 씻으시다. 세포 도금의 경우, 시드 2.1배 10회는 하이드로겔당 3밀리리터에 관심 있는 세포 4개에 있으며, 세포가 섭씨 37도에서 4~18시간 동안 부착할 수 있도록 한다.
세포가 평형화되는 동안 마이크로 파이펫 풀러를 사용하여 1밀리미터 직경을 100mm 길이의 보로실리케이트 유리 마이크로 파이펫으로 끌어당기고, 첫 밀리미터에서 직경약 50마이크로미터로 감소하고 마지막 밀리미터에서 길고 평행한 10 마이크로미터 직경의 튜브로 확장되는 2밀리미터 이상의 테이퍼를 얻습니다. 다음으로, 파이펫을 마이크로포지에 넣고 파이펫의 나머지 부분에서 약 35도 천사로 구부러진 250 마이크로미터 섹션의 맨 끝에 동봉된 15 마이크로미터 무딘 팁을 갖도록 파이펫을 형성한다. 굴곡의 대략적인 직경은 팁에 강도를 빌려주기 위해 약 30 마이크로미터여야합니다.
다음으로, 하이드로겔을 반전 된 현미경의 무대에 놓습니다. 미네랄 오일로 매체를 덮고 10배 목표를 선택합니다. 70%의 알코올로 준비된 마이크로 파이펫을 살균합니다.
그런 다음, 후크가 접시를 가리키는 마이크로 파이펫 홀더에 삽입하고, 후크가 액체의 표면에 닿을 때까지 피펫을 낮추기 위해 코스 조작기를 사용합니다. 현미경을 젤 의 상단에 부착 된 세포에 초점을 맞추고, 목적이 샘플이나 단계를 타격의 위험이 없다는 것을 주의, 마이크로 파이펫의 끝을 찾기 위해 젤 위의 초점을 가지고. 팁이 초점 평면에 수직이 될 때까지 파이펫을 회전하여 마이크로 파이펫의 무딘 끝이 아래로 가리키도록하고 필요에 따라 파이펫 끝에 다시 초점을 맞춥니다.
피펫이 젤 표면에서 얼마나 멀리 떨어져 있는지 측정하고 젤과 파이펫 끝 사이의 부분적인 평면에 다시 초점을 맞추려면 셀 레이어에 다시 초점을 맞춥니다. 그런 다음, 파이펫을 천천히 낮추고, 실험에 사용될 배율을 증가시킨 후, 하이드로겔의 표면 바로 위에 마우스를 내밀 때까지 파이펫을 낮추게 한다. 마이크로 조작기 교정의 경우, 세포가 없는 영역, 구슬이 있는 영역을 이미지하지만 조작이 없으며, 파이펫이 젤을 교반하고, 젤을 당기는 약혼한 파이펫을 이미지화한다.
이어서, 이미지 J를 사용하여 비드 필드를 결합하지 않고 비드 필드, 젤이 결합된 비드 필드 및 당겨진 젤을 비교하여 젤에 적용된 상대적 비드 변위와 힘을 계산한다. 두루택시 분석법을 수행하려면 30분 동안 세포 그룹을 모니터링하여 지시된 방식으로 움직이는 세포를 식별합니다. 한 방향으로 꾸준히 이동하는 셀을 선택하고 원하는 프레임 속도의 셀을 추가로 30분 동안 모니터링합니다.
다음으로, 피펫을 선택한 셀의 앞면 에 약 50 마이크로미터를 배치하고, 겔이 세포의 이동 방향에 직교로 변형되는 마이크로 조작기를 이동한다. 그런 다음 하이드로겔 강성의 급성 국부적 그라데이션에 반응할 때 시간이 지남에 따라 세포를 관찰한다. 입증 된 바와 같이이 기술을 사용하여, 쥐 배아 섬유 아세포는 유리 마이크로 파이펫에 의해 적용 그라데이션에서 증가 강성을 향해 이동합니다.
쥐 배아 섬유아세포 세포는 125킬로파스칼 폴리아크라이알라미드 젤에 빈쿨린 장력 센서를 일시적으로 발현하는 것으로, 40분 동안 스트레치 방향으로 초점 접착의 형성을 입증한다. 포스터 공명 에너지 전송 분석은 초점 접착에 국한 된 vinculin 급성 듀로 전술 자극으로 제시 될 때 긴장의 즉각적인 변화를 경험 하는 것으로 나타났습니다. 이 분석의 유용성을 구체 자극에 대한 응답으로 셀룰러 신호 이벤트의 관찰로 확장합니다.
셀을 스트레칭하려고 여러 번 시도하거나 분석 중에 마이크로 니들이 미끄러지는 경우 새 셀로 다시 시작하여 여러 가지, 가변, 기계적 자극을 부여하지 않도록 하십시오. durotaxis를 말하는 그것의 유틸리티를 넘어, 이 기술은 메카노 트랜스듀션에 관련되었던 분자 기계장치를 묘사하는 것을 돕기 위하여 bio sensors, RNAI, 또는 유전자 편집과 같은 유전 접근과 결합될 수 있습니다.
