On apprécie de plus en plus l’impact du microenvironnement mécanique sur la signalisation cellulaire et la migration. Nécessité de l’utilisation d’approches expérimentales uniques pour fournir une stimulation mécanique à chaque cellule. Cette technique permet la manipulation dynamique du micro-environnement mécanique sous une cellule en temps réel.
Permettre l’observation de changements mécaniquement réglementés dans le comportement de migration cellulaire, et les événements de signalisation sous-cellulaire. Nyla Naim, post-doc, et Johnathan Patterson, technicien de notre laboratoire, feront la démonstration de la procédure avec moi. Commencez par utiliser un Chorono-1 pour activer la surface vitrée de chaque glissement de couverture inférieure pendant 20 secondes, avant de sur-poser immédiatement 50 microlitres de solution de travail de liaison silane sur chaque glissement de couvercle.
Laisser sécher la solution pendant 10 minutes avant de rincer le couvercle glisse deux fois avec 95% d’éthanol et deux fois avec de l’isopropanol. Ensuite, laissez le couvercle glisser à l’air sec pendant environ 20 minutes. Pour le dépôt fluorescent de micro-perles, soniquez d’abord la solution de micro-perle de travail pendant une heure.
15 minutes avant la fin de la sonication, placez le couvercle activé glisse verticalement dans un porte-feuillet de couvercle en céramique et transférez le support dans un nettoyant plasma à table pour un traitement plasma air-pièce pendant trois minutes. Ensuite, placez des morceaux de film de paraffine dans des couvercles de boîte de Petri de 60 millilitres, et placez les feuillets de couverture sur les films, tapant légèrement chaque glissement de couverture pour assurer un bon contact entre le film et le coverslip. Ensuite, ajoutez 150 microlitres de la solution de perles de travail au sommet de chaque coverslip, et aspirez immédiatement la solution d’éthanol du côté des coverslips, laissant les perles sur le coverslip.
Pour lancer les Hydrogels immédiatement après leur préparation, ajouter une gouttelette de 25 microlitres de solution Hydrogel sur le côté activé de chaque coverslip inférieur, et retourner immédiatement les couvre-coverslips dessus perlés, côté perle vers le bas, sur la gouttelette. Laisser les gels polymériser pendant 30 minutes avant d’utiliser des forceps pour enlever délicatement les coverslips. Ensuite, rincer les gels avec trois lavages de cinq minutes dans 50 hepes miliMoler frais par lavage.
Pour activer les surfaces Hydrogels, incuber les gels dans 50 hepes miliMoler frais, complétés par 0,4 miliMolar Sulfo Sanpah, et exposer immédiatement les gels à une lampe à arc ultraviolet dans une zone fermée pendant 90 secondes. À la fin de l’activation, laver les gels avec trois lavages de cinq minutes dans des hepes fraîches, et traiter les Hydrogels activés avec 20 microgrammes par millilitre de fibronectine pendant une heure à 37 degrés Celsius. À la fin de l’incubation, aspirer l’excès de solution de fibronectine et laver les gels trois fois en PBS pendant cinq minutes par lavage.
Après le dernier lavage, placer les Hydrogels dans un petit volume de PBS et stériliser les gels pendant 15 minutes sous la lumière ultra-violette dans une hotte de culture tissulaire. Ensuite, lavez les gels une fois dans pbs frais. Pour le placage cellulaire, les graines 2,1 fois 10 les quatre cellules d’intérêt dans trois millilitres de moyen par Hydrogel et permettent aux cellules d’adhérer à 37 degrés Celsius pendant quatre à 18 heures.
Pendant que les cellules équilibrent, utilisez un tireur de micro-pipette pour tirer un diamètre d’un millimètre par micro-pipette en verre borosilicate de 100 millimètres de long, pour obtenir un cône de plus de deux millimètres de diamètre qui réduit à environ 50 micromètres de diamètre dans le premier millimètre, et s’étend à un long tube parallèle de 10 micromètres de diamètre dans le dernier millimètre. Ensuite, chargez la pipette dans un microforge et façonnez la pipette pour avoir une pointe émoussée de 15 micromètres qui est enfermée à l’extrémité d’une section de 250 micromètres, pliée à environ 35 degrés ange du reste de la pipette. Le diamètre approximatif à la courbure doit être d’environ 30 micromètres pour donner de la force à la pointe.
Ensuite, placez un Hydrogel sur la scène d’un microscope inversé. Couvrir le milieu d’huile minérale et sélectionner l’objectif 10x. Stériliser la micro-pipette préparée avec l’alcool à 70%.
Ensuite, insérez dans le support de micro-pipette avec le crochet pointé vers le plat, et utilisez le manipulateur de cours pour abaisser la pipette jusqu’à ce que le crochet touche juste la surface du liquide. Concentrez le microscope sur les cellules adhéré au dessus du gel, et en prenant soin que l’objectif n’est pas en danger de frapper l’échantillon ou le stade, amener la mise au point au-dessus du gel pour trouver la pointe de la micro-pipette. Faites pivoter la pipette jusqu’à ce que la pointe soit perpendiculaire au plan focal, de sorte que l’extrémité émoussée de la micro-pipette soit pointée vers le bas, et recentrer sur la pointe de la pipette au besoin.
Concentrez-vous vers le bas à la couche cellulaire pour évaluer la distance de la pipette est de la surface du gel, et se concentrer de nouveau à un plan qui est à mi-chemin entre le gel et la pointe de pipette. Ensuite, abaissez lentement la pipette pour atteindre le plan focal intermédiaire, et augmentez le grossissement à celui qui sera utilisé dans l’expérience, avant d’abaisser la pipette jusqu’à ce qu’elle plane juste au-dessus de la surface de l’Hydrogel. Pour l’étalonnage du micro-manipulateur, imagez une zone dépourvue de cellules, une zone avec des perles, mais pas de manipulation, avec la pipette engageant le gel, et avec la pipette engagée tirant le gel.
Ensuite, utilisez l’image J pour comparer les champs sans perles aux champs de perles sans engagement, les champs de perles avec le gel engagé, et le gel tiré pour calculer les déplacements relatifs de perles et la force appliquée sur les gels. Pour effectuer un essai de durotaxis, surveillez un groupe de cellules pendant 30 minutes pour identifier les cellules qui se déplacent d’une manière dirigée. Sélectionnez une cellule qui se déplace régulièrement dans une direction et surveillez les cellules de la fréquence d’image désirée pendant 30 minutes supplémentaires.
Ensuite, placez la pipette à environ 50 micromètres devant le côté proche du bord d’attaque de la cellule sélectionnée, et déplacez le micro-manipulateur de telle sorte que le gel soit déformé orthogonally à la direction de la cellule de voyage. Ensuite, observez la cellule au fil du temps car elle répond au gradient aigu et local de la rigidité Hydrogel. En utilisant cette technique comme démontré, les fibroblastes embryonnaires de rat se déplacent vers la rigidité accrue dans les gradients appliqués par une micro-pipette en verre.
Les cellules embryonnaires de fibroblaste de rat, exprimant transitoirement le capteur de tension de vinculin sur 125 gels kilopascal de polyacrylamide démontrent également la formation des adhérences focales dans les directions de l’étirement sur une période de 40 minutes. L’analyse de transfert d’énergie de résonance de Forster indique que la vinculine localisée aux adhérences focales éprouve un changement immédiat de tension, une fois présenté avec une stimulation durotactic aiguë. Étendre l’utilité de cet essai à l’observation d’événements de signalisation sous-cellulaires, en réponse à la stimulation durotactic.
Si vous faites plusieurs tentatives pour étirer une cellule, ou si le microneedle glisse pendant l’analyse, recommencez avec une nouvelle cellule pour éviter de transmettre plusieurs stimuli mécaniques variables. Au-delà de son utilité pour l’analyse durotaxis, cette technique peut être combinée avec des approches génétiques, telles que les biocapteurs, RNAI, ou l’édition de gènes pour aider à délimifier les mécanismes moléculaires impliqués dans la mécanotransduction.
