Die Auswirkungen der mechanischen Mikroumgebung auf die Zellsignalisierung und -migration nehmen zu. Die Verwendung einzigartiger, experimenteller Ansätze zur mechanischen Stimulation einzelner Zellen ist erforderlich. Diese Technik ermöglicht die dynamische Manipulation der mechanischen Mikroumgebung unter einer Zelle in Echtzeit.
Ermöglicht die Beobachtung mechanisch regulierter Veränderungen des Zellmigrationsverhaltens und subzellulärer Signalereignisse. Mit mir wird das Verfahren demonstriert: Nyla Naim, ein Post-Doc, und Johnathan Patterson, ein Techniker aus unserem Labor. Beginnen Sie mit einem Chorono-1, um die Glasoberfläche jedes Bodendeckels für 20 Sekunden zu aktivieren, bevor Sie sofort 50 Mikroliter Bindesilan-Arbeitslösung auf jeden Deckelschlupf überlagern.
Lassen Sie die Lösung für 10 Minuten trocknen, bevor sie die Abdeckung zweimal mit 95% Ethanol und zweimal mit Isopropanol ausrutscht. Lassen Sie dann die Abdeckungsrutschen für ca. 20 Minuten trocknen. Für fluoreszierende Mikroperlenabscheidung die arbeitende Mikroperlenlösung zunächst für eine Stunde beschallen.
15 Minuten vor dem Ende der Beschallung die aktivierten Deckelschlupfs vertikal in einen keramischen Deckel-Slip-Halter legen und den Halter für die Raum-Luft-Plasmabehandlung für drei Minuten in einen Tischplasmareiniger geben. Als nächstes legen Sie Paraffinfolien in 60 Milliliter Petrischalendeckel und legen Sie die Deckelschlüpfer auf die Folien, wobei Sie leicht auf jeden Deckelzettel tippen, um einen guten Kontakt zwischen dem Film und dem Coverslip zu gewährleisten. Dann fügen Sie 150 Mikroliter der Arbeitsperlenlösung an die Oberseite jedes Deckellips, und sofort die Ethanol-Lösung von der Seite der Abdeckungslipse aspirieren, so dass die Perlen auf dem Deckelschlupf.
Um die Hydrogele unmittelbar nach ihrer Zubereitung zu gießen, fügen Sie ein 25-Mikroliter-Tröpfchen Hydrogel-Lösung auf die aktivierte Seite jedes unteren Deckels und sofort die Perlen-Top-Abdeckungen, Perlenseite nach unten, auf das Tröpfchen kippen. Lassen Sie die Gele 30 Minuten lang polymerisieren, bevor Sie Zangen verwenden, um die Abdeckungen vorsichtig zu entfernen. Dann spülen Sie die Gele mit drei, fünf Minuten Wäscht in frischen 50 MiliMoler Hepes pro Wäsche.
Um die Hydrogels-Oberflächen zu aktivieren, bebrüten Sie die Gele in frischen 50-MiliMoler-Hepes, ergänzt durch 0,4-MiliMolar Sulfo Sanpah, und setzen Die Gele sofort einer uvvioletten Bogenlampe in einem geschlossenen Bereich für 90 Sekunden aus. Am Ende der Aktivierung die Gele mit drei, fünf Minuten Wäscht in frischen Hepes waschen und die aktivierten Hydrogele mit 20 Mikrogramm pro Milliliter Fibronectin für eine Stunde bei 37 Grad Celsius behandeln. Am Ende der Inkubation die überschüssige Fibronectin-Lösung ansaugen und die Gele dreimal in PBS für fünf Minuten pro Wäsche waschen.
Nach der letzten Wäsche die Hydrogele in ein kleines PBS-Volumen geben und die Gele 15 Minuten unter ultraviolettem Licht in einer Gewebekulturhaube sterilisieren. Dann waschen Sie die Gele einmal in frischem PBS. Für die Zellbeschichtung, Samen 2,1 mal 10 die vier Zellen von Interesse in drei Milliliter Medium pro Hydrogel und lassen Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius für vier bis 18 Stunden haften.
Während die Zellen ausgeglichen sind, verwenden Sie einen Mikropipettenzieher, um einen einen Millimeter Durchmesser von 100 Millimetern länge Borosilikatglas-Mikropipette zu ziehen, um eine Verjüngung von über zwei Millimetern zu erhalten, die im ersten Millimeter einen Durchmesser von etwa 50 Mikrometern reduziert und sich bis zu einem langen, parallelen Rohr mit einem Durchmesser von 10 Mikrometern im letzten Millimeter erstreckt. Als nächstes laden Sie die Pipette in eine Mikroschmiede und formen Sie die Pipette so, dass sie eine 15 Mikrometer stumpfe Spitze hat, die ganz am Ende eines 250-Mikrometer-Abschnitts eingeschlossen ist und etwa 35 Grad vom Rest der Pipette gebogen wird. Der ungefähre Durchmesser an der Biegung sollte etwa 30 Mikrometer betragen, um der Spitze Festigkeit zu verleihen.
Als nächstes legen Sie einen Hydrogel auf die Bühne eines invertierten Mikroskops. Bedecken Sie das Medium mit Mineralöl und wählen Sie das 10-fache Objektiv. Sterilisieren Sie die vorbereitete Mikropipette mit dem 70%-Alkohol.
Dann setzen Sie in die Mikro-Pipettenhalter mit dem Haken in Richtung der Schale, und verwenden Sie den Kurs Manipulator, um die Pipette zu senken, bis der Haken nur die Oberfläche der Flüssigkeit berührt. Konzentrieren Sie das Mikroskop auf die Zellen, die an der Oberseite des Gels haften, und achten Sie darauf, dass das Objektiv nicht gefahr ist, die Probe oder das Stadium zu treffen, bringen Sie den Fokus über das Gel, um die Spitze der Mikropipette zu finden. Drehen Sie die Pipette so lange, bis die Spitze senkrecht zur Brennebene ist, so dass die abgestumpfte Spitze der Mikropipette nach unten zeigt, und konzentrieren Sie sich bei Bedarf wieder auf die Spitze der Pipette.
Konzentrieren Sie sich zurück zur Zellschicht, um zu messen, wie weit die Pipette von der Geloberfläche entfernt ist, und fokussieren Sie sich wieder auf eine Ebene, die teilweise zwischen dem Gel und der Pipettespitze liegt. Dann senken Sie langsam die Pipette, um die mittlere Fokalebene zu erreichen, und erhöhen Sie die Vergrößerung zu der, die im Experiment verwendet wird, bevor Sie die Pipette senken, bis sie knapp über der Oberfläche des Hydrogels schwebt. Für die Mikromanipulatorkalibrierung, Bild einen Bereich ohne Zellen, ein Bereich mit Perlen, aber keine Manipulation, mit der Pipette das Gel zu engagieren, und mit der engagierten Pipette ziehen das Gel.
Verwenden Sie dann Bild J, um die Keine-Perlen-Felder mit den Perlenfeldern ohne Eingriff, die Perlenfelder mit dem eingelegten Gel und das gezogene Gel zu vergleichen, um die relativen Perlenverschiebungen und die Auftriebskraft auf die Gele zu berechnen. Um einen Durotaxis-Assay durchzuführen, überwachen Sie eine Gruppe von Zellen für 30 Minuten, um Zellen zu identifizieren, die sich in einer gerichteten Weise bewegen. Wählen Sie eine Zelle aus, die sich ständig in eine Richtung bewegt, und überwachen Sie die Zellen der gewünschten Bildrate für weitere 30 Minuten.
Als nächstes positionieren Sie die Pipette etwa 50 Mikrometer vor der nahen Seite der Vorderkante der ausgewählten Zelle, und bewegen Sie den Mikromanipulator so, dass das Gel orthogonal in die Fahrtrichtung der Zelle verformt wird. Beobachten Sie dann die Zelle im Laufe der Zeit, während sie auf den akuten, lokalen Gradienten der Hydrogel-Steifigkeit reagiert. Mit dieser Technik, wie gezeigt, bewegen sich die embryonalen Fibroblasten der Ratte in Richtung der erhöhten Steifigkeit in Gradienten, die von einer Glas-Mikropipette aufgebracht werden.
Ratter-embryonale Fibroblastenzellen, die auf 125 Kilopascal-Polyacrylamid-Gelen vorübergehend Vinkulin-Spannungssensor exprimieren, zeigen auch die Bildung von Fokaladesionen in den Richtungen der Dehnung über einen Zeitraum von 40 Minuten. Die Forster Resonance Energy Transfer Analyse zeigt, dass Vinculin lokalisiert zu fokalen Adhäsionen eine sofortige Veränderung der Spannung erlebt, wenn sie mit einer akuten durotaktischen Stimulation präsentiert wird. Erweiterung des Nutzens dieses Assays auf die Beobachtung subzellulärer Signalereignisse als Reaktion auf die durotaktische Stimulation.
Wenn Sie mehrere Versuche unternehmen, eine Zelle zu dehnen, oder wenn die Mikronadel während des Testes rutscht, beginnen Sie mit einer neuen Zelle, um zu vermeiden, dass mehrere, variable, mechanische Reize übertragen werden. Abgesehen von ihrem Nutzen für die Assaying-Durotaxis kann diese Technik mit genetischen Ansätzen wie Biosensoren, RNAI oder Genbearbeitung kombiniert werden, um die molekularen Mechanismen der Mechanotransduktion abzugrenzen.
