Neisseria menenjitidis tüm dünyada insan popülasyonu arasında sepsis ve menenjititlerin en yaygın nedenlerinden biridir, ve bakteri insan konak ile sınırlıdır. Bu deneysel protokolde, bakterilerin intrasisternal aşılamadayalı bir fare modelimeningokok menenjitititlerinin indüksiyonu için özel prosedür açıklayacağız. Bu murine modeli ağır bir insan hastalığı olarak meningokok menenjitkarakteristik patolojik olaylar çoğaltılır.
Yani, konak-patojen etkileşimini değerlendirmek ve bu ölümcül hastalıkdan sorumlu patogenetik mekanizmayı analiz etmek için yararlı bir aracı temsil eder. Enfeksiyon modeli sadece csf içine doğrudan bakteri çoğalması önlemek için yenilikçi tedavi stratejisi değerlendirmek için yararlı olabilir, ama aynı zamanda insan patojenlere karşı olası pasif immünoterapi etkinliğini analiz etmek için. Teknik sadece intrasisternal inokülün başarısını garanti etmek için eğitim aşamasını değil, genel olarak daha çok hastalık indüksiyonuna da ihtiyaç dumaktadır.
Prosedürleri gösteren roberta Colicchio ve Chiara Pagliuca araştırmacı olarak, ve Elena Scaglione doktora öğrencisi olarak, tüm laboratuvar tarafından. Başlamak için, gonococcal agar plaka üzerinde taze neisseria menenjitidis kültüründen tek bir koloni almak 1% polibitks takviyesi ile desteklenen ve 10 mililitre GC Broth aşılamak. Meningokok kullanımını içeren tüm işlemler bir laminar akış biyo güvenlik küpü kabine altında yapılmalıdır.
220 RPM'de orbital shake inkübatörde bakterileri 37 derecede büyütün ve spektrofotometre ile farklı zaman noktalarında kültürün optik yoğunluğunu kontrol etmeye devam edin. Erken üstel aşamaya karşılık gelen 0,7 OD600 ulaşın. Bu optik yoğunluk elde edildikten sonra,% 10 gliserol ekleyerek dondurulmuş stokları yapmak ve kriyo şişeleri kültürün bir mililitre dağıtarak.
Şişeleri kullanıma kadar 80 santigrat derecede saklayın. Enfeksiyondan önce, oda sıcaklığında dondurulmuş bakterileri eritin, sonra 1500xG'de 15 dakika santrifüj tüpüne aktarın süpernatantı çıkarın ve kilogram başına beş miligram demir dekstran içeren bir mililitre taze GC Broth'u yeniden askıya alın. Deneye başlamadan önce, hayvanları tartın ve vücut ısılarını değerlendirin.
Hayvanı boynundan aşağı doğru sür ve karnı %70 etanol ile dezenfekte edin. Enfeksiyondan yaklaşık 2 saat önce, 25 gauge iğne kullanarak, karın sağ alt kadranda intraperitoneally demir dekstran enjekte. Hayvanı anesteziden sonra, ayak bası sıkıştığında ağrı yanıtının olmadığını onaylayarak anestezinin derinliğini kontrol edin.
Laminar akış kabine üzerine fare yerleştirdikten sonra sternal dekübitus pozisyon ve dikkatle düz bir pozisyonda vertebral sütun tutmak için ekstremite ve servikal omurga germek. Tutarlı bir bakteriyel süspansiyon korumak için, yavaşça sekiz milimetre 30 gauge iğne ile bir şırınga yüklemeden önce karıştırın. Başı %70 etanolle dezenfekte edin.
Hayvanı lateral recumbency yerleştirin, şekilde kulakları çekin ve orta boynu esnetin. Boyun ve başın orta çizgisinin masa nın üstüne mükemmel paralel konumda olduğundan emin olun. Daha sonra atlas kanatlarına dokunarak, çakıştıklarını ve iğnenin oksipital deliğe girme olasılığının en yüksek olduğu orta hattaki doğal girintiyi hissedin.
Bir şırınga ile doldurun 8 milimetre 30 gauge iğne meningokok veya demir dextran toplam hacmi nde kontrol olarak GC Broth takviye li alt öldürücü bakteriyel doz 10 mikrolitre. Enjeksiyon noktasını belirlemek için iğneyi kullanın ve şırınganın içeriğini oksipital çapak deliğinden farelerin sarnıc magnasına enjekte edin. Enjeksiyondan sonra şırıngayı ve iğneyi güvenli bir şekilde atın.
Bir laminar akış dolabı altında kafeste hayvan yerleştirin. Uyanış ve hareket tam iyileşme bekleyin ve enfekte hayvanlar üzerinde hayvan hayatta kalmak için devam, protokolde açıklandığı gibi. Fareyi anestezi ettikten sonra göğsü %70 etanol ile dezenfekte edin.
25 gauge iğne kullanarak göğüs boşluğunda kardiyak delinme ile kan 600 ila 700 mikrolitre çekin. % 3.8 sodyum sitrat içeren bir tüp kan toplamak ve daha sonra uygulanabilir bakteri hücresi sayımı için 80 santigrat derece de saklamak. Ötenazili fareyi supine pozisyonunda yerleştirin.
Makas ve forceps kullanarak vücudun sagittal düzlemi boyunca kürk kesti. İğneler ile, vücudun yanlarında kürk ile cilt düzeltmek. Periton zarını kesmek için keskin makas kullanın.
Sonra makas ve tek kullanımlık forseps ile, dalak ve karaciğer gibi organları, çıkarmak ve GC Broş bir mililitre ile ayrı bir steril Petri kabına her koymak 10% gliserol ile takviye. Beş milimetrelik bir şırınganın bir piston kullanarak, tek hücreli süspansiyon oluşana kadar yaklaşık 2-3 dakika oda sıcaklığında mekanik organları homojenize ve bir scurdent cryo şişe aktarın. Tüpü hemen kuru buzun üzerine yerleştirin.
Antibiyotikler ile GC agar plakaları olun ve 2-3 saat boyunca 37 santigrat derece kullanmadan önce kurulayın. Her homojen dokudan GC Broth'taki numunelerin 10 tam seri seyreltmesini hazırlayın. GC agar plakaları üzerinde plaka ve% 5 karbondioksit ile 37 santigrat derece gecede kuluçka.
%70 etanol ile ötenazili farenin başını dezenfekte edin. Küçük cerrahi makas ve ince uçlu çelik çömleği kullanarak, kürk ve çıkarılan baş ın deri rezeksiyon, sonra açıkça dikiş görmek ve kafatası nın açılması na rehberlik etmek için kafatasının üst doğru devam edin. Kafatasını açmak için, foramen magnum aracılığıyla küçük makas ucu ekleyin.
Kafatasının merkezine doğru ve kafatasının karşı tarafına parietal kemiğin orta hattı boyunca kesin ve yavaşça lambdoid sütür lateral ekstremite boyunca kesti. Arka parietal köşeden başlayarak ince uçlu forsepsler kullanarak, kafatası kaldırın ve beyin keşfetmek için çapraz yukarı çekin, kafatası kaldırıldığında beyin dokusu başın herhangi bir kemiğe bağlı olmadığından emin olun. Kafatası ve beyin arasındaki herhangi bir bağ dokusu kaldırmak için tek kullanımlık forseps kullanın ve beyin dokusu kurumasına izin vermez.
Hemen GC Broş bir mililitre ile bir Petri kabında beyin yerleştirmek için tek kullanımlık forseps kullanın 10%gliserol ile desteklenmektedir. Tek hücreli süspansiyon oluşana kadar yaklaşık iki ila üç dakika oda sıcaklığında mekanik beyin homojenize etmek için beş mililitrelik şırınga piston kullanın. Daha sonra uygulanabilir bakteri hücresi sayımları değerlendirme için 2 mililitresteril tüp ve 80 santigrat derece de saklamak içine süspansiyon aktarın.
93/4286 yabani tip veya cssA kusurlu Neisseria menenjitidis suşları ile enfekte farelerin sağkalım değerlendirildi. Yabani tip suşun ortanca öldürücü dozu 10'uncu CFU'ya karşılık gelen meningokok mücadelesine karşılık gelir. 5 Inci CFU'ya kadar 10 ölüm oranı %83.4 ve %100 ile %5.CFU dozu arasında ydı.
CSSA kusurlu mutant suşu için ortanca öldürücü dozu elde etmek için, 10 ila 8 CFU arasında bir doz gerekliydi ve yabani tip zorlanmadan 1000 kat daha yüksek. Enjeksiyondan sonra, beyin dokusunda hızlı bir artış oldu enfeksiyon sonrası yaklaşık 24 saat zirveye ulaşan. Mutant türü ile enfekte farelerin beyninde, canlı sayıları zaman içinde giderek düştü.
Ayrıca, mutant enfekte farelerin% 33.3 enfeksiyon sitesinden bakteriyel açıklık gösterdi, vahşi tip enfekte hayvanların aksine. Enfeksiyondan 48 saat sonra, cssA kusurlu mutant tamamen dalak ve karaciğer de temizlendi, yabani tip suşu ile enfekte hayvanlar kalıcı bir enfeksiyon sergiledi ise. Açıklanan deneysel yöntem, immünohistokimya, immünoresans ve serebral kanama analizi gibi patolojik değerlendirme ile, bu ölümcül hastalık ile ilişkili beyin hasarı analiz etmek için yararlı olabilir.
