Bu iş için finansman, ORWH SCOR P50 DK064540 tarafından RO1 DK 051406, RO1 AI 108749-01, F32 DK 101171, ve F32 DK 104516-01 sağlandı.

Etik bildirimi: Washington Üniversitesi Hayvan Çalışmaları Komitesi 2013/01/11 onaylanmış ve 2016/01/11 sona eriyor oldu protokol numarası 20120216, bir parçası olarak, tüm fare enfeksiyonları ve prosedürleri onayladı. Hayvanların genel bakım Ulusal Araştırma Konseyi ve USDA Hayvan Bakım Kaynak Kılavuzu Laboratuvar Hayvanları Bakım için rehber ve Kullanım ile uyumlu idi. Ötenazi prosedürleri ile tutarlı &quot;Hayvanlar 2013 sürümü için Ötenazi için AVMA kurallarına&quot;. 1. UPEC İYE Protokolü, Aşılanması İğne Hazırlama (Şekil S1) <ol><li> 30 G iğne kapağını çıkarın. Iğne miline PI10 boru yaklaşık 1 inç geçirin. Gecede iğne meclisleri sterilize, UV. Kateterize iğneler steril petri tabaklarında süresiz olarak saklanabilir. </li></ol> 2. UPEC bakteriyel inokulum hazırlanması <ol><li> UTI89 inokulum hazırlayın (aşı öncesinde 72 saat başlatmakyon gün) <ol><li> Dondurulmuş stoktan LB (Luria-Bertani) agar plaka üzerine Streak UTI89. 37 ° C&#39;de gece boyunca inkübe edin. Bir koloni seçin ve 125 ml&#39;lik bir flask içinde, 10 ml LB içine inoküle. Statik, 24 saat boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edilir. </li><li> Statik, 37 ° C&#39;de ilave bir 24 saat boyunca yeni 125 ml&#39;lik bir flask içinde LB 10 ml, gece boyunca kültürün 10 ul inoküle. </li><li> Transferi 3 ml 3 dakika boyunca 7.000 xg&#39;de steril 1.5 ml tüplere ve santrifüj (zorlanma ve istenen inokulum boyutuna göre değişir) ve 1x PBS pelet ve santrifüj ikinci kez tekrar süspansiyon. PBS 1x 1 ml bakteri pelletini. </li></ol></li><li> Bakteriyel optik yoğunluk ölçün ve istenen inokulum yoğunluğu konsantrasyon ayarlayın. kullanılan inokulum standart konsantrasyonu 10 7 bakteri; Ancak, bu çalışmanın tasarımı sayesinde değişebilir. </li></ol> 3. Bakteriyel Aşılama <ol><li> % 70 etanol ve c iş istasyonu temizleyin(steril akış kaputu kullanın veya) emici kağıt ile alana. </li><li> 1 ml (TB) şırıngaya hazırlanan bakteri inokulum 0.9 ml kadar çizin (hava kabarcıkları). Sonra steril polietilen boru döşeme, inokulum içeren şırınga üzerine, PI10 boru ile bir hazırlanan steril aşılama iğne takın. NOT: mesane delinmesiyle önlemek için iğne ucu yukarıda boru 1 mm bırakın. </li><li> Parafilm 1 inç kare parça kesin ve üstüne cerrahi kayganlaştırıcı bir dab (bir kuruş yaklaşık boyutu) koyun. </li><li> Kadar (protokol üretmektedir takiben) izofluran veya buharlaştırıcı odasının 3 ml ile ıslatılmış pamuk topları ile bir çay demlik topu içeren 32 onsluk cam kavanoz koyarak dişi C3H / HeN fareler anestezi bilinçsiz ama hala normal nefes (1 nefes / sn) . NOT: Bazı IACUC komiteleri bir kavanoz ya da buharlaştırıcı kullanımını tasvip etmiyoruz. Kurumunuzun IACUC komitesinin göstergesini takip ediniz. NOT: Eğer cam kavanozizofluran-soakd pamuk topları kullanıldığı çay-top ve / veya burun konisi ile hayvan dikkatlice anestezik doz aşımı ve ölümleri önlemek için dikkat edilmelidir. Bir buharlaştırıcı ve anestezi odasına kullanmanın avantajı yanlışlıkla aşırı doz önler kontrollü izofluran yönetimini sağlamasıdır. DİKKAT: İsofluranın bir inhalasyon anestezik. İyi havalandırılan bir alanda kullanın ve inhalasyon en aza indirmek. </li><li> Kavanoz / buharlaştırıcı fareyi çıkarın ve bir kağıt havlu üzerine sırtında üzerine yerleştirin ve bacaklarını yayıldı. </li><li> Bir burun konisi olan fare burun küçük bir miktar ihtiva eden bir pamuk (yaklaşık 1-2 ml veya 50 ml konik tüp (kontrollü isoflurance bir buharlaştırma birimleri donatılmıştır doz sunar buharlaştıncıya bağlı bir tüp) Kapak ) izofluran. </li><li> Yavaşça idrar neden ve işeme mesane sağlamak için mesane palpitate. % 100 etanol silin ile periüretral alanı silin. Içine, ilk aşılama iğne / şırınga gelin dabCerrahi yağlayıcı. </li><li> , Transüretral aşılama iğne takmadan yaklaşık 12 mm, ve mesane yavaşça (10 ul / sn) içine inokulum dağıtmak için hafifçe şırınga pistonu bastırarak bakteri solüsyonu 50 ul her fare inoküle edin. Fare aşılama iğne çıkarın. NOT: aşılamak başlayan üretral açılışında inokulum derhal iade iğnenin yanlış veya eksik ekleme gösterir. </li><li> Burun konisi fareyi çıkarın ve kafesine geri. Yineleyin her fare için 3,3-3,8 adımları. Inokulum koşulları / suşları anahtarlama eğer / ne zaman, onaylanmış bir kesici kapta şırınga ve iğne aşılama imha ve yeniden 3.2 adım başlar. NOT: üropatojenik organizmalarla aşılama genellikle şiddetli ağrı belirtilerine neden olmaz. Ancak nadir durumlarda, patojenlerin yüksek dozlarda tatbik ateş, gıda ve su alımı ve anormal davranışları azalmaya neden olabilir. BirNimal sağlık deney boyunca izlenmelidir. Aşikar ağrı semptomları bildirimi, örneğin Buprenorfin (0.05-0.1 mg / kg verilen deri altına) olarak, bir ağrı kesici, varsa, uygulanabilir. Prosedürler her kurumun IACUC uygun olmalıdır. </li></ol> Bakteriyel Yüklerin 4. Belirlenmesi <ol><li> Her mesane ve böbrekler çifti hasat edilmesi için ayrı 5 ml tüpler hazırlayın. 1x PBS / tüp / fare mesane 1ml ekleyin hasat edilecek. 1x PBS / tüp 0.8 ml ilave edilir / fare böbrek çifti hasat edilmesi. Belirli bir fareye karşılık her tüp etiketleyin. 1:10 seri dilüsyonları için her bir oyuğa 1x PBS 180 ul ihtiva eden bir 96-çukurlu plaka hazırlanması. </li><li> % 70 etanol ile çalışma alanını temizleyin ve emici bir kapak veya kağıt havlu ile alanı kapsayacak. </li><li> Fare, yaklaşık 1 dakika boyunca nefes duruncaya kadar izofluran ile fare anestezisi sonra emici kapağı veya kağıt havlu üzerine koyun, (adım 3.4). Euthana diğer yöntemlersia aynı zamanda, karbon dioksit gibi IACUC komite tarafından kabul edilir, ve izofluran doz aşımı için ikame edilebilir. </li><li> Baş üssünde boyun kısıtlama ve yatay vücuttan çıkık oluşana kadar kuyruk çekme oluşur hızlı servikal dislokasyon ile fare Kurban. NOT: Çoğu IACUC komiteleri ötanazi ve servikal dislokasyon ikincil aracı gerektiren yaygın bir yöntemdir. IACUC komitesi tarafından onaylandı Ancak, diğer yöntemler de kullanılabilir. </li><li> Sırtında ölü fare yerleştirin ve karın% 70 etanol sprey. Fareyi teşrih, böbrek diseksiyonu aşağıdaki kandan potansiyel kontaminasyonu en aza indirmek için bu sırayla, mesane ve böbreklerde hasat. 1x PBS içeren hazırlanmış 5 ml tüpler içine bağımsız organlar yerleştirin (adım 4.1). NOT: Harici diseksiyon ve organ toplama kontaminasyonu minimize etmek için farklı makas kullanın. </li><li> Organlar t sağlamak için tüp dokununO PBS 1x. Her fare için yineleyin 4,3-4,5. Temiz makas ve her bir farenin sonra% 70 etanol içinde forseps. </li></ol> 5. Bakterilerin Kurtarma <ol><li> , Bir doku homojenleştirici ile böbrek başına 15 saniye ve mesane 30 saniye 5 ml tüpler hasat kesesi ve böbrek homojenize edilir. 1x PBS,% 70 etanol ve örnekler arasında 1x PBS homojenizer sekans durulayın. </li><li> 10 -8 dışarı seri 01:10 dilüsyonları yapın ve LB agar plakaları üzerinde CFU için her seyreltme (koloni oluşturan birim) plaka. 37 ° C&#39;de plakaları gece inkübe ve koloniler ertesi gün saymak. </li></ol> 6. IBC numaralandırma <ol><li> Aseptik mesane çıkarın ve bir silikon alt kısma sahip bir 6-yuvalı plaka içindeki 1 x PBS içinde yerleştirin. Plakalar, bir silikon elastomer kiti kullanılarak ve de her biri yaklaşık olarak silikon 1 cm dökme hazırlanabilir, bkz talimatları üretmektedir. Makas kullanılarak yarısında mesane kesin. </li><li> Küçük metal işaretçilerine kullanma hafifçe blad splayder, böylece mesane lümen yukarı bakacak. Ürotelyumun maksimum miktarda maruz sağlamak için mesane bölümlerinin dış kenarlarında işaretçilerine yerleştirmek için emin olun. </li><li> Yayvanlaşmasıyla sonra, yavaşça 1x kez PBS ile mesane yıkayın. Pipet ile 1x PBS çıkarın. Tüm yayvan mesane karşılamak için yeterli% 3 paraformaldehid ekleyerek mesane sabitleyin. DİKKAT: Paraformaldehyde kanserojen olduğunu. Eldiven içeren uygun koruyucu donanım, her zaman giyilmelidir. Bertaraf kurumsal kurallara uymalıdır. </li><li> 1 saat oda sıcaklığında inkübe edin. Paraformaldehit çözüm çıkarın. 1x bir kez PBS ile yıkayın. </li><li> (PBS 1X 2 mM MgCl2,% 0.01 sodyum deoksikolat ve% 0.02 Nonidet-p40in) LacZ yıkama çözeltisi, yıkama başına 5 dakika için üç kez yıkayın. </li><li> Yeterince LacZ leke yıkama solüsyonu çıkarın ve ekleme (9.5 mi LacZ yıkama çözeltisi, 0.4 mi 25 mg / ml X-gal ve 100 mM K-ferrosiyanür / K-ferrisiyanür 0.1 mi) mesane kapsayacak. 30 ° C overni inkübeışıktan koruyarak GHT. </li><li> Inkübatör yayvan mesane çıkarın ve diseksiyon kapsamı, 40-60X büyütme ile görüntülendi gibi mavi puncta görünür IBC, gözlemlemek. NOT: Bazen fare üretranın altında tüpün yerleştirilmesi öncesinde idrar olabilir. Bu durumda, yeniden idrar toplamak için denemeden önce 15-20 dakika bekleyin. </li></ol> 7. İdrar Bakteriüri CFU Sayımı İçin Toplama (CAUTI için Uygulanamaz) <ol><li> İdrar öncesi toplamak veya enfeksiyonu yayınlamak için yavaşça (fare kafesinin üst) kuyruğunu tutan ve düz bir yüzeye yükseltilmiş üzerine yerleştirerek fare dizginlemek. </li><li> Fare üretranın altında steril 1.5 ml tüp tutun. Yavaşça mesaneye baskı uygulamak için kuyruk yakın farenin arkasına bastırın. 1.5 ml tüp idrar yakalayın. </li><li> 10 -7 dışarı seri 1:10 dilüsyonları yapın ve uygun LB her seyreltme plaka 37 ° C&#39;de plakaları gece inkübe ve koloniler ertesi gün saymak. </li></ol> 8. CAUTI Modeli Protokol, CAUTI Modeli için Kateter İğne Hazırlık (Şekil S2) <ol><li> 30 G iğne kapağını çıkarın. PE10 boru ve RenaSIL gibi silikon boru 5 mm büyüklüğündeki bir 7 mm parça kesin. Boru iğne tabanını dokunana kadar PI10 boru ile iğne geçirin. </li><li> Daha sonra PE10 içeren iğne üzerine 5 mm parça besleme. Gecede iğneler derlemeleri sterilize, UV. NOT: silikon tüp yüklerken, iğne ucu geçmiş uzanan boru yaklaşık 1 mm bırakın. </li></ol> 9. E. faecalis OG1RF bakteriyel inokulum hazırlanması <ol><li> Aşılama gün önce 48 saat başlangıç ​​OG1RF inokulum hazırlayın. Donmuş stoktan bir BHI (Beyin Kalp infüzyonu) plakası üzerine Şerit OG1RF. </li><li> Bir koloni seçin ve BHI 10 ml içine aşılamak ve 37 ° C&#39;de 18 saat süreyle statik büyümek. Kültür santrifüj ve steril 1 x PBS içinde 1 ml hacim pelet (3 kez) yıkama. </li><li> 1x PBS içine bakteri pelletini. Bakteriyel optik yoğunluk ölçün ve istenen inokulum boyutuna konsantrasyonunu ayarlayın. kullanılan inokulum standart konsantrasyonu 10 7; Ancak, bu çalışmanın tasarımı nedeniyle değişebilir </li></ol> 10. Kateter Yerleştirilmesi <ol><li> % 70 etanol ile iş istasyonu temizleyin ve bir emici kapak alanı ile kapak (ya da steril akış kapağı kullanın). </li><li> Boş 1 ml (TB) şırınga kateter iğne takın. Parafilm 1 inç kare parça kesin ve üstüne cerrahi kayganlaştırıcı bir dab (bir kuruş yaklaşık boyutu) koyun. Not: iki farklı iğneler katetere bağlı implantasyonu için gerekli olan mekanik manipülasyon kateterin biriktirme ve minimize yanlışlıkla aşılama için aşı için kullanılmıştır. Bu aynı zamanda daha az aşılama iğneleri hazırlama kolaylık sağlar. </li><li> Bir çay içeren 32 onsluk cam kavanozda koyarak C57BL / 6 fareler anesteziizofluran veya buharlaştırıcı odasının 3 ml batırılmış pamuk topları ile -infuser top bilinçsiz ama hala normal nefes (1 nefes / sn) kadar (aşağıdaki protokol üretmektedir). </li><li> Sonra bir kağıt havlu üzerine sırtında fare koymak ve bacaklarını yayıldı. Küçük bir miktar izofluran (yaklaşık 1-2 ml) içeren pamuk topları ile bir burun konisi veya 50 ml konik tüp ile fare burun örtün. DİKKAT: İsofluranın bir inhalasyon anestezik. İyi havalandırılan bir alanda kullanın ve araştırmacı tarafından solunmasını en aza indirmek. </li><li> Yavaşça idrar neden ve işeme mesane sağlamak için mesane palpitate. % 100 etanol silin ile periüretral alanı silin. </li><li> Bir pamuk uçlu aplikatör kullanarak% 10 povidon-iyot çözeltisi ile periüretral alan dezenfekte edin. Cerrahi yağlayıcı içine ilk aşılama iğne / şırınga gelin hafifçe sürün. Not: Povidine-iyot alkol daha kuvvetli bir aseptik çözelti, kateter yerleştirilmesi için kullanılır. Kateter implantasyonu gerektirirdaha fazla mekanik manipülasyon kateter ve kirlenme dolayısıyla daha büyük bir potansiyele eklemek için. </li><li> Üretral kateter deliğe yerleştirin. Bir kez, cımbız kullanın dolayısıyla (5 mm silikon), küçük kateter itme ve mesane içine yatırılması, mesane doğru (7 mm PI10) uzun bir parça itmek için. Hemen hala bağlı 7 mm boru ile, iğne çıkarın. </li></ol> 11. Bakteriyel Aşılama <ol><li> Burun konisi fareyi çıkarın ve kafesine geri bölüm 9. itibaren hazırlanan inokulum kullanarak, bölüm 3 bakteriyel aşılama protokolü takip </li></ol> Kurban Her Zaman Noktasında 12. <ol><li> Mesane ve böbrek 5 ml tüpler (organlar adım 4.1 izleyin için) ve kateter 1.5 ml Eppendorf tüp hazırlayın. Kateter numune için 1.5 ml&#39;lik Eppendorf tüpü içine 1 x PBS içinde 1 ml ilave edilir </li><li> Adımları 4,3-4,5 izleyin. Mesane, böbrek ve kateter hasat, fare teşrih, pla1x PBS ve 1.5 ml Eppendorf içine kateter (adım 12.1 bakınız) ihtiva eden 5 ml tüpler içine, bağımsız bir doku dans ediyorum. NOT: Harici diseksiyon ve kirlenmeyi en aza indirmek için organ toplama ve kateter alımı için farklı bir makas kullanın </li><li> Sonra adım 4.6 izleyin. </li></ol> 13. Bakteriyel Kurtarma <ol><li> Organları için adımları 5.1 ve 5.2 izleyin. 30 saniye boyunca maksimum hızda bakteri kateterler kurtarma, vorteks için 5 dakika ilave bir 30 saniye boyunca maksimum hızda sonra vorteks banyo sonikatör kullanarak ve kateter örnekleri sonikasyon. </li><li> 10 -8 dışarı seri 01:10 dilüsyonları yapın ve BHI plakaları üzerinde CFU sayımı için her seyreltme plaka. Gece boyunca 37 ºC inkübe ve koloniler ertesi gün saymak. </li></ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarını olduğunu beyan ederim.

Komplike olmayan topluluk İYE birkaç milyon birinci basamak ziyaretleri her yıl 46 için muhasebe yaygın ve masraflı enfeksiyonudur satın aldı. Buna ek olarak, Cautis artık CAUTI 45 edinilen hastaneden kaynaklanan tedavi eklenen maliyet sağlayıcıları tazmin Medicare ve Medicaid Hizmetleri Merkezleri gibi sağlık sağlayıcıları için son derece pahalı hale gelmiştir ortak sağlık edinilen enfeksiyon vardır. Bu protokollerin açıklandığı İYE, hem komplike olmayan sistit ve CA...

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/52892/establishment-and-characterization-of-uti-and-cauti-in-a-mouse-model">Establishment and Characterization of UTI and CAUTI in a Mouse Model</a>. The Protocol section has been updated.
The ethics statement has been updated from:
Ethics statement: The Washington University Animal Studies Committee approved all mouse infections and procedures as part of protocol number 20120216, which was approved 01/11/2013 and expires 01/11/2016. Overall care of the animals was consistent with The guide for the Care and Use of Laboratory Animals from the National Research Council and the USDA Animal Care Resource Guide. Euthanasia procedures are consistent with the &#8220;AVMA guidelines for the Euthanasia of Animals 2013 edition.&#8221;
to:
Ethics statement: The Washington University Animal Studies Committee approved all mouse infections and procedures as part of protocol number 20150226, which expires 12/10/2018. Overall care of the animals was consistent with The Guide for the Care and Use of Laboratory Animals from the National Research Council and the USDA Animal Care Resource Guide. Euthanasia procedures are consistent with the &#8220;AVMA guidelines for the Euthanasia of Animals 2013 edition.&#8221;
Step 3 has been updated from:
3. Bacterial Inoculation
<ol>
	<li>Clean the workstation with 70% ethanol and cover area with absorbent paper (or use sterile flow hood).</li>
	<li>Draw up to 0.9 ml of the prepared bacterial inoculum into a 1 ml (TB) syringe (remove air bubbles). Attach a prepared sterile inoculation needle with PE10 tubing, onto the syringe containing the inoculum, then sterilely trim the polyethylene tubing. 
	NOTE: Leave 1 mm of tubing above the tip of the needle to avoid puncturing the bladder.</li>
	<li>Cut a 1 inch square piece of parafilm and put a dab of surgical lubricant (approximately the size of a dime) on top.</li>
	<li>Anesthetize female C3H/HeN mice by putting them in a 32 ounce glass jar containing a tea-infuser ball with cotton balls soaked with 3 ml of isoflurane or vaporizer chamber (following manufactures protocol) until unconscious but still breathing normally (1 breath/sec). 
	NOTE: Some IACUC committees do not approve the use of a jar or vaporizer. Please follow the indication of the IACUC committee of your institution. 
	NOTE: If glass jar with tea-ball and/or nose cone with isoflurane-soakd cotton balls are used, the animal must be carefully observed to avoid anesthetic overdose and death. The advantage of using a vaporizer and anesthesia chamber is that it provides controlled isoflurane administration that avoids accidental overdoses. CAUTION: Isoflurane is an inhalation anesthetic. Use in a well-ventilated area and minimize inhalation.</li>
	<li>Remove the mouse from the jar/vaporizer and place it on its back on a paper towel and spread the legs.</li>
	<li>Cover the nose of the mouse with a nose cone (a tube connected to the vaporizer that provides a controlled isoflurance dose that comes equipped on some vaporizer units) or 50 ml conical tube with a cotton ball containing a small amount (approximately 1-2 ml) of isoflurane.</li>
	<li>Gently palpitate the bladder to induce urination and ensure a voided bladder. Wipe the periurethral area with 100% ethanol wipe. Dab the inoculation needle/syringe, point first, into the surgical lubricant.</li>
	<li>Inoculate each mouse with 50 &#181;l of the bacteria solution by inserting the inoculation needle transurethrally, approximately 12 mm, and pressing down on the syringe plunger gently to dispense the inoculum into the bladder gently (10 &#181;l/sec). Remove the inoculation needle from the mouse. 
	NOTE: Immediate return of inoculum at the urethral opening when beginning to inoculate indicates improper or incomplete insertion of the needle.</li>
	<li>Remove the mouse from nose cone and return it to its cage. Repeat steps 3.3-3.8 for each mouse. When/if switching inoculum conditions/strains, dispose of the syringe and inoculation needle in an approved sharps container and start again step 3.2.&#160;&#160; 
	NOTE: Inoculation with uropathogenic organisms generally does not cause severe pain symptoms. However, in rare instances, administering large doses of pathogens may cause fever, reduction in food and water intake and abnormal behavior. Animal health should be monitored throughout the experiment. If overt pain symptoms are notice, an analgesic, such as Buprenorphine (0.05&#8722;0.1 mg/kg given subcutaneously), can be applied. Procedures should be in accordance with each institution&#8217;s IACUC.</li>
</ol>
to:
3. Bacterial Inoculation
<ol>
	<li>Clean the workstation with 70% ethanol and cover area with absorbent paper (or use sterile flow hood).</li>
	<li>Draw up to 0.9 ml of the prepared bacterial inoculum into a 1 ml (TB) syringe (remove air bubbles). Attach a prepared sterile inoculation needle with PE10 tubing, onto the syringe containing the inoculum, then sterilely trim the polyethylene tubing. 
	NOTE: Leave 1 mm of tubing above the tip of the needle to avoid puncturing the bladder.</li>
	<li>Cut a 1 inch square piece of parafilm and put a dab of surgical lubricant (approximately the size of a dime) on top.</li>
	<li>Anesthetize female C3H/HeN mice by putting them in a vaporizer chamber (following manufactures protocol) until unconscious but still breathing normally (1 breath/sec). 
	NOTE: Some IACUC committees do not approve the use of a vaporizer. Please follow the indication of the IACUC committee of your institution. 
	CAUTION: Isoflurane is an inhalation anesthetic. Use in a well-ventilated area and minimize inhalation.</li>
	<li>Remove the mouse from the vaporizer and place it on its back on a paper towel and spread the legs.</li>
	<li>Cover the nose of the mouse with a nose cone (a tube connected to the vaporizer that provides a controlled isoflurance dose that comes equipped on some vaporizer units) to maintain anesthetization.</li>
	<li>Gently palpitate the bladder to induce urination and ensure a voided bladder. Wipe the periurethral area with 100% ethanol wipe. Dab the inoculation needle/syringe, point first, into the surgical lubricant.</li>
	<li>Inoculate each mouse with 50 &#181;l of the bacteria solution by inserting the inoculation needle transurethrally, approximately 12 mm, and pressing down on the syringe plunger gently to dispense the inoculum into the bladder gently (10 &#181;l/sec). Remove the inoculation needle from the mouse. 
	NOTE: Immediate return of inoculum at the urethral opening when beginning to inoculate indicates improper or incomplete insertion of the needle.</li>
	<li>Remove the mouse from nose cone and return it to its cage. Repeat steps 3.3-3.8 for each mouse. When/if switching inoculum conditions/strains, dispose of the syringe and inoculation needle in an approved sharps container and start again step 3.2.&#160;&#160; 
	NOTE: Inoculation with uropathogenic organisms generally does not cause severe pain symptoms. However, in rare instances, administering large doses of pathogens may cause fever, reduction in food and water intake and abnormal behavior. Animal health should be monitored throughout the experiment. If overt pain symptoms are notice, an analgesic, such as Buprenorphine (0.05&#8722;0.1 mg/kg given subcutaneously), can be applied. Procedures should be in accordance with each institution&#8217;s IACUC.</li>
</ol>

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/52892/establishment-and-characterization-of-uti-and-cauti-in-a-mouse-model">Establishment and Characterization of UTI and CAUTI in a Mouse Model</a>. The Protocol section has been updated.

Erratum: Establishment and Characterization of UTI and CAUTI in a Mouse Model

İdrar yolu enfeksiyonları (İYE) en sık görülen bakteriyel enfeksiyon hastalıklarından biridir ve İYE edinilen kazanım, toplum ve hastane kaynaklı mekanizmasına dayanan iki kategoriye ayrılabilir. Toplum kökenli İYE sık sık aksi takdirde sağlıklı kadın ve çalışmalarda meydana kadınların yaklaşık% 50&#39;si yaşamları 1 en az bir İYE olacaktır göstermiştir. Ayrıca, nüks önemli bir sorundur. Bir başlangıç ​​akut enfeksiyon olan bir kadın antibiyotik tedavisi ve birçok kadın sık nüks 2 yaşamaya devam uygun olmasına rağmen altı ay içinde ikinci bir enfeksiyonu olan bir% 25-40 şansı var. Bu enfeksiyona neden olan bakteriler de giderek daha fazla antibiyotiğe dirençli karıştırıcı tedavi protokolleri 3-6 hale gelmektedir. İYE hastalığın etkilerini ve yaygınlığını vurgulayan ABD&#39;de sağlık ile ilgili giderler yaklaşık 2,5 milyar dolara mal bireylerin milyonlara her yıl etkiler1,7 .Nosocomial esas olarak kalıcı kateter gibi yabancı cisimlerin varlığı ile ilişkilidir İYE satın almıştır. Kateter ilişkili İYE (CAUTI) bu tür enfeksiyonların 8% 70-80 ~ muhasebe, İYE edinilen en sık görülen hastane kalır. Ayrıca, CAUTI artmış morbidite ve mortalite ile ilişkili ve ikincil kan dolaşımı enfeksiyonlarının 9 en sık nedenidir olduğunu. İYE edinilen UPEC ilişkili topluluk cinsel ilişki, kötü hijyen veya farklı konak arasındaki diğer mikrobik nüfus dinamikleri sırasında mekanik manipülasyonu yoluyla gastrointestinal sistemde rezervlerden mesane içine bakterilerin giriş kaynaklandığı 10&#39;a nişler düşünülmektedir. Bir kez mesane içinde UPEC kapsül, demir toplama sistemleri, toksinler, bir virülans plazmid, tRNAs, patojenite adaları ve patogenezde rol oynadığı gösterilmiştir kolonizasyon faktörleri de dahil olmak üzere çok sayıda virülans faktörleri, istihdam &lt;sup&gt; 11-14. UPEC kolonizasyon kurulması için kritik, UPEC da stereokimyasal özgüllük 15 reseptörlerini tanıyan yapışkan hastabakıcı usher yolu (CUP) pili çok tip kodlar. FimH adezin uçlu tip 1 pili, UPEC ile ifade edilmektedir ve her ikisi de, insan ve fare keseli 18 lümen yüzeyi üzerinde ifade edilir uroplakins 16 ve α-1, β-3 integrinleri, 17 manosile bağlar. Bu FimH aracılı etkileşimler bakteri kolonizasyonu ve yüzeyel epitel hücrelerinin 19,20 işgali kolaylaştırmak. Tek bir bakteri hızla olgunlaşması üzerine, ~ 10 4 bakteri 21 içerebilir bir hücre içi bakteri topluluğu (IBC) oluşturmak için bölebilirsiniz nereye kez hücre içinde, UPEC sitoplazmaya kaçabilir. IBC formasyonu en az altı farklı fare soylarında gösterilmiştir, C3H / Hen, C3H / HeJ, C57BL / 6, FMA, FVB / NJ ve BALB / c ve farklı UPE bir çok çeşitliC suşları ve diğer Enterobacteriaceae 22-24. Ancak IBC formasyonunun zamansal ve uzamsal farklılıklar fare arka plan ve enfekte UPEC gerginlik bağlı olarak değişebilir. C3H Giriş / prototip UPEC ile enfekte HeN fareler UTI89 suşları veya CFT073, IBC formasyonu gibi erken 3 HPI (saat sonrası enfeksiyonu) gibi bakterilerin küçük biyokütlelerin olarak görüntülenebilir. Bu topluluk genişletmeye devam ediyor ve çubuk şekilli bakteriler terminal farklılaşmış yüzeysel şemsiye hücrelerinin sitoplazmik alan büyük bir yüzdesini işgal zaman kalkınma yaklaşık 6 HPI bir &quot;orta noktası&quot; ulaştığında benzer boyutları görüntüleyen çoğunluğu ile nispeten senkron bir şekilde bu erken IBC formu ve morfolojisi. ~ 8 hpi bir basilinin gelen IBC değişim bakteri morfolojisi koklar için. IBC doğada geçicidir. Böylece, bakteriyel nüfusunun sürekli genişleme 12-18 hpi sonuçlarından IBC olgunlaşma, hücre wi dışarı onların ipliklenmenin ve dağılma ardındankomşu hücreler 23 sonraki yayılmasını th. Bu nedenle, IBC hücresi konak bağışıklık tepkilerinin ve antibiyotikler 25 korunmuş bir ortamda hızlı bir bakteri büyümesi sağlar. farelerde görülür UPEC enfeksiyonun farklı aşama, aynı zamanda, insanlarda 22,26-28 İYE modellemek için kullanılabilecek yararlı bir araç olarak İYE fare modelini destekler, bu IBC ve ipliklenmenin olarak insanlarda görülür. Kadınların çoğunluğu yaşamları boyunca bir İYE yaşarken, bu enfeksiyonların sonucu sık tekrarlayan sistit, hiçbir nüks akut kendini sınırlayan enfeksiyon uzanabilir. Dahası, çalışmalar genetik bir bileşeni İYE yatkınlık 29 katkıda düşündüren, İYE güçlü ailesel geçtiği gösterilmiştir. Biz kliniklerde görülen farklı İYE sonuçları kendilenmiş fare suşlarının 30 arasında deneysel UPEC enfeksiyonu farklı sonuçların tarafından yansıtılmış olabilir bulduk. Örneğin, C3H / HeN, FMADBA ve C3H / HeOuJ fare bulaşıcı bir doza bağlı bir şekilde, kalıcı, yüksek titre bakteriler (&gt; 10 4 koloni oluşturan birim (CFU) / ml), yüksek titre bakteriyel özelliği uzun ömürlü, kronik sistit, duyarlı kurban mesane yükü&gt; 4 hafta sonrası enfeksiyon (TEFE), kronik inflamasyon ve ürotelyal nekroz. Bu fareler de kronik sistit gelişimi için biyobelirteçleri olarak hizmet ilk 24 HPI içinde IL-6, G-CSF, KC ve IL-5 serum seviyelerini gösterir. Plasebo çalışmaları İYE sistit ilk belirtiler sonra birkaç hafta boyunca kendi idrarda bakteri yüksek düzeyde tutacaktır karşılaşan kadınların büyük bir yüzdesi antibiyotik tedavisi 31 verilmediği takdirde göstermiştir ki gibi bu doğru, bazı kadınlarda İYE doğal seyrini temsil edebilir , 32. Dahası, C3H / HeN fareleri kullanılarak, kronik sistit öyküsü sonraki şiddetli tekrarlayan enfeksiyonlar için önemli bir risk faktörü olduğunu gördük. Tekrarlayan İYE çoğu si iseİYE ve C3H / HeN fare gnificant klinik bulgusu şu anda önceki maruz kaldıktan sonra artan yatkınlık özetlediği tek okudu modeldir. İkinci İYE sonuç Akut UPEC enfeksiyonu yaklaşık bir hafta içinde mesane iltihabı ve bakteriüri çözünürlüğe sahip, kendini sınırlayan nerede C57Bl / 6 fareler değinmeyecek. İlginç olarak, bu modelde, UPEC kolaylıkla UPEC potansiyel insanlarda 33 aynı suşu tekrarlayan İYE dair bir yöntemi, 34 açıklayan bir aktif İYE yeniden başlatmak için atıl bir durumda ortaya çıkan yeteneğine sahip olan mesane dokusu içinde hareketsiz hücre içi rezervuarlar oluştururlar. İYE duyarlılık genetik etkilere ek olarak, mesane içine bir kateter giriş büyük bir enfeksiyona sahip olarak bir enfeksiyon neden olabilecek bakteri dizi artan olasılığını artırır. Bu insan idrar kateterizasyon histolojik neden olduğu gösterilmiştir venedeniyle mekanik sağlam bir inflamatuvar yanıt ile sonuçlanan stres, pul pul dökülme, lamina propria ve submucusa, ürotelyal incelme ödem ve ürotelyum ve böbrek 35,36 mukozal lezyon mesanede immünolojik değişiklikler. Buna ek olarak, kateter ve böylece CAUTI neden çeşitli türleri tarafından kullanılan bir ortam yaratmak bakteriyel bağlanması için bir yüzey temin eder. UPEC hala büyük bir katkı olmakla birlikte, Enterococcus faecalis bu CAUTI 37% 15 oluşturmaktadır. E. faecalis ciddi bir sağlık sorunu 38 poz, direnç ortaya çıkması vankomisin ile antibiyotiklere dirençli giderek hale geliyor. E. faecalis toksinler ve kateter ve epiteline 38 hem tutturmak için gerekli adezinler dahil olmak üzere birçok virülans faktörleri sahiptirler. Üriner kateterizasyon sırasında, ev sahibi idrar yolu 39,40 mikrobiyal yapışma, çarpma ve yayılması savunmasızdır. E. faecabir mekanizmanın parçası mesane inat ve bir fare CAUTI modelinde 41 çoğaltılamaz böbrekler için yaymak olarak lis kateter üzerinde bir biyofilm oluşturmaktadır. Son zamanlarda, üriner kateter içinde gösterilmiştir, fibrinojen (FG) enflamatuar yanıtın bir parçası olarak mesane içine salınır. Fg mont kateter mesanede birikir ve E. için önemlidir faecalis biyofilm oluşumu, bir ek iskele olarak işleyen. CAUTI bir C57BL / 6 fare modelinde, o keşfettik E. faecalis biyofilm kateter üzerinde oluşumu ve mesane böylece sebat, özellikle ucu adhesin EbpA EBP pilus bağlıydı. Biz EbpA N-terminal alanı, özellikle kateter kaplama FG bağlanır olduğu bulunmuştur. Buna ek olarak, tespit E. faecalis enfeksiyon sırasında metaboliti kaynağı, böylece biyofilm oluşumunu 42 artırılması olarak FG kullanır. Fare model under kritik kanıtlanmıştırzanmıştır yanı sıra idrar yolu enfeksiyonu ve CAUTI 41 klinik belirtilerini tahmin. Bu yazıda sistit UPEC inokulum hazırlanması göstermek UTI89 ve C3H / HeN farelerin transüretral aşılama izole. Ayrıca, E. kateter C57BL / 6 farelerinde yerleştirilmesi ve aşılama için bir protokol göstermektedir faecalis&#39;in OG1RF süzün. Bu tekniklerin her ikisi de farelerde tutarlı ve güvenilir üriner veya CAUTI yol açar. Biz de kronik veya tekrarlayan sistit analizi için akut sistit ve idrar toplama sırasında IBC oluşumunu gözlemlemek için kullanılan teknikleri gösterilecek. C3H / HeN fareler ilk bakteri istilası, IBC formasyonu, ipliklenmenin ve kronik sistit 23,33,43 geliştirilmesi dahil olmak üzere UPEC patogenezinde yönlerini incelemek için kullanılmıştır. Bu hastalık oluşturma parametreleri de diğer fare arka 22,33 çeşitli çalışmalar yapılmıştır. CAUTI için C57BL / 6 modeli müteakip bakteriyel işbirliği ile mesane içine yabancı cisim implantasyonu için izin verir7 gün boyunca muhafaza edilebilir lonization, enfeksiyon sonrası 41. Bu modeller daha sonra değinmeyecek veya klinik insan popülasyonlarında gözlenmiştir çok olan konak yanıtları, yıkmak için bakteriyel hastalık mekanizmaları, İYE ev sahipliği yanıtları ve mekanizmaların değerlendirilmesi için yararlı olmuştur.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Material for catheter and needle preparation:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30ga needles</td>
			<td>BD Precision Glide</td>
			<td>305106</td>
			<td>30Gx &#189; (0.3 mm x 13mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE10 polyethylene tubing</td>
			<td>BD</td>
			<td>427400</td>
			<td>Inside diameter -0.011 in (0.28 mm); outside diameter &#8211; 0.024 in (0.61 mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RenaSIL 025 platinum cured silicon tubing</td>
			<td>Braintree Scientific, Inc</td>
			<td>SIL 025</td>
			<td>inside diameter-0.012 x outside diameter 0.025, 25 ft coil</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Material for infections:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflourane &#8211; Isothesia</td>
			<td>Butler Schein</td>
			<td>29405</td>
			<td>250 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear Glass Straight-Sided Jar</td>
			<td>Kimble Chase</td>
			<td>5413289V 21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless Steel Tea Infuser</td>
			<td>Schefs-Amazon</td>
			<td></td>
			<td>Premium Loose Leaf Tea Infuser By Schefs - Stainless Steel - Large Capacity -</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-sterile cotton balls</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>22-456-880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml Falcon tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89039-660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isotec 3 -vaporizer</td>
			<td>Ohmeda</td>
			<td>1224478</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ear punch</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-812-201</td>
			<td>(when necessary)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betadine solution</td>
			<td>Betadine solution</td>
			<td></td>
			<td>10% Povidie-iodine topical solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q-tips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-037-924</td>
			<td>6 in</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diapers for bench</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>14206 63</td>
			<td>Absorbent Underpads (20&#8221;X36&#8221;mats)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical lubricant</td>
			<td>Surgilube</td>
			<td>0281-0205-36</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting scissor</td>
			<td>Fine Science tools, INC</td>
			<td>14084-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-Adson Forceps</td>
			<td>Fine Science tools, INC</td>
			<td>11018-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 ml syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td>Tuberculin slip tip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Bemis</td>
			<td>PM996</td>
			<td>4 in x 125 FT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf rack</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>05-541-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf tubes</td>
			<td>MIDSCI</td>
			<td>AVX-T-17-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Harvesting catheters, bladders and kidneys:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homogenizer</td>
			<td>PRO Scientific INC</td>
			<td>Bio-Gen Pro 200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml polypropylene round-bottom tube</td>
			<td>BD</td>
			<td>352063</td>
			<td>for organ homogenization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paper towel</td>
			<td>Georgia-Pacific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Pharmco-AAPER</td>
			<td>11100020S</td>
			<td>200 proof</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Costar&#8482; Clear Polystyrene 96-Well Plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3788</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X Phosphate sodium saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BRANSONIC Ultrasonic cleaner 1210</td>
			<td>Branson Ultrasonics Corporation</td>
			<td>1210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IBC materials:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well tissue culture test plate</td>
			<td>Techno Plastic Products</td>
			<td>92006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pins</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>26002-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard 184</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>3097358-1004</td>
			<td>Silicone Elastomer Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-b-D-galactoside)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15520-034</td>
			<td>Ultrapure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N, N-Dimethylformamide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D4551</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2 (Magnesium chloride)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D6750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonidet-P40</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11754599001</td>
			<td>Octylphenolpoly(ethyleneglycolether)n</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hexacyanoferrate(II) trihydrate (K-ferrOcyanide)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P3289</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hexacyanoferrate(III) (K-ferrIcyanide)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>60299</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishment and characterization of uti and cauti in a mouse model

İdrar yolu enfeksiyonları (İYE) son derece yaygın bir morbidite nedenidir ve antibiyotik tedavisine giderek dirençlidir. Dişiler orantısız İYE tarafından tutulmuş olan: Bütün kadınların% 50&#39;si yaşamları boyunca bir İYE olacak. Ayrıca, ilk İYE yaşam, ağrı ve rahatsızlık, günlük faaliyetlerin bozulması kalitesinde ciddi bozulma bazı acı sık nüks ile nüks yaşayacaktır var bu kadınların% 20-40, sağlık maliyetleri artmıştır ve birkaç tedavi seçenekleri diğer uzun süreli antibiyotik profilaksisi daha. Üropatojenik Escherichia coli (UPEC) İYE edinilen toplumun temel etkenidir. Kateter ilişkili ÜSE (CAUTI) bir milyon yılda ABD&#39;de olaylar ve dramatik sağlık masrafları için muhasebe en yaygın hastane kökenli bir enfeksiyondur. UPEC ayrıca CAUTI birincil nedeni iken, diğer etkenler de dahil olmak üzere Enterococcus artan öneme sahiptirfaecalis&#39;in. İşte bu insan hastalıklarının klinik özellikleri birçok recapitulate iki köklü fare modellerini kullanmaktadır. İYE için, C3H / HeN modeli konak yanıtları, IBC oluşumu ve ipliklenmenin dahil insanlarda gözlenen UPEC virulans özellikleri birçok özetlediği. CAUTI, kateter, mesane implantlar korumak C57BL / 6 fareleri kullanan bir model için, E. duyarlı olduğu gösterilmiştir faecalis&#39;in mesane enfeksiyonu. Bu temsili modeller yeni terapötik ve yönetim veya önleme stratejilerinin geliştirilmesine öncülük etmektedir İYE hastalığın patogenezinde içine çarpıcı yeni anlayışlar kazanmak için kullanılmaktadır.

komplikasyonsuz ve kateter ilişkili İYE intravezikal modelleri bu ortak ve pahalı enfeksiyonları yönetmek bakteriyel patogenezi, konak dokusunda bu hastalıkların etkisi, ve geliştirme ve yeni yaklaşımların test moleküler mekanizmaların için esnek platformlar sunmak. Fare zorlanma ve patojene bağlı olarak, intravezikal aşılama akut başlatmak veya modüle edilmesi için gerekli faktörleri (Şekil 1 ve 3), kronik veya tekrarlayan (Şekil 2) sistiti ayd?...

Watch this Scientific Journal Video about Establishment and Characterization of UTI and CAUTI in a Mouse Model at JoVE.com

Establishment and Characterization of UTI and CAUTI in a Mouse Model

The ability to model urinary tract infections (UTI) is crucial in order to be able to understand bacterial pathogenesis and spawn the development of novel therapeutics. This work&#8217;s goal is to demonstrate mouse models of experimental UTI and catheter associated UTI that recapitulate and predict findings seen in humans.

Fare Modelinde Kuruluş ve İYE ve CAUTI Karakterizasyonu

Urinary tract infections (UTI) are highly prevalent, a significant cause of morbidity and are increasingly resistant to treatment with antibiotics. ...

establishment-and-characterization-of-uti-and-cauti-in-a-mouse-model

Research

JoVE Journal

Medicine

19.9K Görüntüleme.  Washington University School of Medicine. The ability to model urinary tract infections (UTI) is crucial in order to be able to understand bacterial pathogenesis and spawn the development of novel therapeutics. This work’s goal is to demonstrate mouse models of experimental UTI and catheter associated UTI that recapitulate and predict findings seen in humans.

Video: Establishment and Characterization of UTI and CAUTI in a Mouse Model

A Mouse Model of in Utero Transplantation

The transplantation of stem cells and viruses in utero has tremendous potential for treating congenital disorders in the human fetus. For example, in utero transplantation (IUT) of hematopoietic stem cells has been used to successfully treat patients with severe combined immunodeficiency.1,2 In several other conditions, however, IUT has been attempted without success.3 Given these mixed results, the availability of an efficient non-human model to study the biological sequelae of stem cell transplantation and gene therapy is critical to advance this field. We and others have used the mouse model of IUT to study factors affecting successful engraftment of in utero transplanted hematopoietic stem cells in both wild-type mice4-7 and those with genetic diseases.8,9 The fetal environment also offers considerable advantages for the success of in utero gene therapy. For example, the delivery of adenoviral10, adeno-associated viral10, retroviral11, and lentiviral vectors12,13 into the fetus has resulted in the transduction of multiple organs distant from the site of injection with long-term gene expression. in utero gene therapy may therefore be considered as a possible treatment strategy for single gene disorders such as muscular dystrophy or cystic fibrosis. Another potential advantage of IUT is the ability to induce immune tolerance to a specific antigen. As seen in mice with hemophilia, the introduction of Factor IX early in development results in tolerance to this protein.14 
In addition to its use in investigating potential human therapies, the mouse model of IUT can be a powerful tool to study basic questions in developmental and stem cell biology. For example, one can deliver various small molecules to induce or inhibit specific gene expression at defined gestational stages and manipulate developmental pathways. The impact of these alterations can be assessed at various timepoints after the initial transplantation. Furthermore, one can transplant pluripotent or lineage specific progenitor cells into the fetal environment to study stem cell differentiation in a non-irradiated and unperturbed host environment.
The mouse model of IUT has already provided numerous insights within the fields of immunology, and developmental and stem cell biology. In this video-based protocol, we describe a step-by-step approach to performing IUT in mouse fetuses and outline the critical steps and potential pitfalls of this technique.

A Mouse Model of in Utero Transplantation

The mouse model of in utero transplantation is a versatile tool that can be used to study the potential clinical applications of stem cell transplantation and gene therapy in the fetus. In this protocol, we present a general approach to performing this technique

Bir Fare Modeli Utero Organ Nakli

The transplantation of stem cells and viruses in utero has tremendous potential for treating congenital disorders in the human fetus.  For example, in ...

Tıp

Establishment and Propagation of Human Retinoblastoma Tumors in Immune Deficient Mice

Culturing retinoblastoma tumor cells in defined stem cell media gives rise to primary tumorspheres that can be grown and maintained for only a limited time. These cultured tumorspheres may exhibit markedly different cellular phenotypes when compared to the original tumors. Demonstration that cultured cells have the capability of forming new tumors is important to ensure that cultured cells model the biology of the original tumor. 
Here we present a protocol for propagating human retinoblastoma tumors in vivo using Rag2-/- immune deficient mice. Cultured human retinoblastoma tumorspheres of low passage or cells obtained from freshly harvested human retinoblastoma tumors injected directly into the vitreous cavity of murine eyes form tumors within 2-4 weeks. These tumors can be harvested and either further passaged into murine eyes in vivo or grown as tumorspheres in vitro. Propagation has been successfully carried out for at least three passages thus establishing a continuing source of human retinoblastoma tissue for further experimentation. 
Wesley S. Bond and Lalita Wadhwa are co-first authors.

A method is described to propagate human retinoblastoma tumors in mice. Tumor cells are directly injected into the eyes of immune deficient mice. Secondary tumors have been successfully established using both cells directly harvested from human tumors and cultured tumorspheres.

Bağışıklık Eksik Fare Kuruluş ve İnsan Retinoblastom Tümörler yayılımı

Culturing retinoblastoma tumor cells in defined stem cell media gives rise to primary tumorspheres that can be grown and maintained for only a limited ...

Multi-photon Imaging of Tumor Cell Invasion in an Orthotopic Mouse Model of Oral Squamous Cell Carcinoma

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient management strategies. Orthotopic mouse models of oral cancer have been developed to facilitate the study of factors that impact invasion and serve as model system for evaluating anti-tumor therapeutics. In these systems, visualization of disseminated tumor cells within oral cavity tissues has typically been conducted by either conventional histology or with in vivo bioluminescent methods. A primary drawback of these techniques is the inherent inability to accurately visualize and quantify early tumor cell invasion arising from the primary site in three dimensions. Here we describe a protocol that combines an established model for squamous cell carcinoma of the tongue (SCOT) with two-photon imaging to allow multi-vectorial visualization of lingual tumor spread. The OSC-19 head and neck tumor cell line was stably engineered to express the F-actin binding peptide LifeAct fused to the mCherry fluorescent protein (LifeAct-mCherry). Fox1nu/nu mice injected with these cells reliably form tumors that allow the tongue to be visualized by ex-vivo application of two-photon microscopy. This technique allows for the orthotopic visualization of the tumor mass and locally invading cells in excised tongues without disruption of the regional tumor microenvironment. In addition, this system allows for the quantification of tumor cell invasion by calculating distances that invaded cells move from the primary tumor site. Overall this procedure provides an enhanced model system for analyzing factors that contribute to SCOT invasion and therapeutic treatments tailored to prevent local invasion and distant metastatic spread. This method also has the potential to be ultimately combined with other imaging modalities in an in vivo setting.

A comprehensive overview of the techniques involved in generating a mouse model of oral cancer and quantitative monitoring of tumor invasion within the tongue through multi-photon microscopy of labeled cells is presented. This system can serve as a useful platform for the molecular assessment and drug efficacy of anti-invasive compounds.

Oral Skuamöz Hücre Karsinomu Ortotopik Fare Modeli Tümör Hücre Invasion Multi-foton Görüntüleme

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient ...

Establishment of Human Epithelial Enteroids and Colonoids from Whole Tissue and Biopsy

The epithelium of the gastrointestinal tract is constantly renewed as it turns over. This process is triggered by the proliferation of intestinal stem cells (ISCs) and progeny that progressively migrate and differentiate toward the tip of the villi. These processes, essential for gastrointestinal homeostasis, have been extensively studied using multiple approaches. Ex vivo technologies, especially primary cell cultures have proven to be promising for understanding intestinal epithelial functions. A long-term primary culture system for mouse intestinal crypts has been established to generate 3-dimensional epithelial organoids. These epithelial structures contain crypt- and villus-like domains reminiscent of normal gut epithelium. Commonly, termed &#8220;enteroids&#8221; when derived from small intestine and &#8220;colonoids&#8221; when derived from colon, they are different from organoids that also contain mesenchyme tissue. Additionally, these enteroids/colonoids continuously produce all cell types found normally within the intestinal epithelium. This in vitro organ-like culture system is rapidly becoming the new gold standard for investigation of intestinal stem cell biology and epithelial cell physiology. This technology has been recently transferred to the study of human gut. The establishment of human derived epithelial enteroids and colonoids from small intestine and colon has been possible through the utilization of specific culture media that allow their growth and maintenance over time. Here, we describe a method to establish a small intestinal and colon crypt-derived system from human whole tissue or biopsies. We emphasize the culture modalities that are essential for the successful growth and maintenance of human enteroids and colonoids.

We describe a method to establish human enteroids from small intestinal crypts and colonoids from colon crypts collected from both surgical tissue and biopsies. In this methodological article, we present the culture modalities that are essential for the successful growth and maintenance of human enteroids and colonoids.

Tüm Doku ve Biyopsi İnsan Epitelyal Enteroids ve Colonoids kurulması

The epithelium of the gastrointestinal tract is constantly renewed as it turns over. This process is triggered by the proliferation of intestinal stem ...

Isometric Contractility Measurement of the Mouse Mesenteric Artery Using Wire Myography

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and drugs. It is widely used in many studies on the physiological functions of vascular smooth muscle, the pathogenesis of vascular diseases such as hypertension, and the development of smooth muscle relaxant drugs. The mouse is a widely used model animal with a large pool of disease models and genetically modified strains. We introduced this method to measure the isometric contraction of mouse mesenteric artery in detail. A 1.4-mm segment of mouse mesenteric resistance artery was isolated and mounted on a myograph chamber by passing two steel wires through its lumen. After equilibration and normalization steps, the vessel segment was potentiated by a high-K+ solution twice prior to the contraction assay. As an example of the application of this method in drug development, we measured the relaxant effect of a novel natural substance, neoliensinine, isolated from a Chinese herb, embryos of the lotus seed (Nelumbo nucifera Gaertn.) on mouse mesenteric arteries. The vessel segments mounted on the myograph chamber were stimulated with a high-K+ solution. When the force tension reached a stable sustained phase, cumulative doses of neoliensinine were added to the chamber. We found that neoliensinine had a dose-dependent relaxant effect on smooth muscle contraction, thus suggesting that it bears potential activity against hypertension. In addition, as the vessel segment can survive at least 4 hours after mounting and maintain contractility induced by the high-K+ solution for many times, we suggest that the wire myograph system may be used for the time-consuming process of drug screening.

The wire myograph technique is used to investigate vascular smooth muscle functions and screen new drugs. We report a detailed protocol for measuring the isometric contractility of the mouse mesenteric artery and for screening new relaxants of vascular smooth muscle.

İzometrik Contractility ölçüm tel Myography kullanarak fare mezenterik arter

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and ...

Establishment of a Severe Dry Eye Model Using Complete Dacryoadenectomy in Rabbits

Dry eye disease (DED) is a complex disease with multiple etiologies and variable symptoms, having ocular surface inflammation as its key pathophysiologic step. Despite advances in our understanding of DED, significant knowledge gaps remain. Advances are limited in part due to the lack of informative animal models. The authors recently reported on a method of DED induced by injecting all orbital lacrimal gland (LG) tissues with the lectin concanavalin A. Here, we report a novel model of aqueous-deficient DED based on the surgical resection of all orbital LG (dacryoadenectomy) tissues. Both methods use rabbits because of their similarity to human eyes in terms of the size and structure of the ocular surface. One week after removal of the nictitating membrane, the orbital superior LG was surgically removed under anesthesia, followed by removal of the palpebral superior LG, and finally removal of the inferior LG. Dacryoadenectomy induced severe DED, evidenced by a marked reduction in the tear break up time test and the Schirmer&#39;s tear test, and significantly increased tear osmolarity and rose bengal staining. Dacryoadenectomy-induced DED lasted at least eight weeks. There were no complications and animals tolerated the procedure well. The technique can be mastered relatively easily by those with adequate surgical experience and appreciation of the relevant rabbit anatomy. Since this model recapitulates the features of human aqueous-deficient DED, it is suitable for studies of ocular surface homeostasis, DED, and candidate therapeutics.

A novel approach is presented to induce chronic dry eye disease in rabbits by surgically removing all orbital lacrimal glands. This method, distinct from those previously reported, produces a stable, reproducible model of aqueous deficient dry eye well suited to study tear physiology and pathophysiology and ocular therapeutics.

Tavşanlarda Komple Dakriyoadenektomi Kullanarak Şiddetli Kuru Göz Modelinin Oluşturulması

Dry eye disease (DED) is a complex disease with multiple etiologies and variable symptoms, having ocular surface inflammation as its key pathophysiologic ...

Establishment of a Mouse Severe Acute Pancreatitis Model using Retrograde Injection of Sodium Taurocholate into the Biliopancreatic Duct

The prevalence of acute pancreatitis (AP), especially severe acute pancreatitis (SAP), is increasing in younger age groups annually. However, there is a lack of effective treatments in the current clinical practice. With the easy accessibility of transgenic and knockout strains and their small size, which allows minimal doses of drugs required for in vivo evaluation, a well-established experimental model in mice is preferred for AP research. Moreover, SAP induced through sodium taurocholate (TC) is currently one of the most widely used and best characterized models. This model has been investigated for novel therapies and possible molecular events during the process of AP. Here, we present the generation of an AP mouse model using sodium taurocholate and a simple homemade microsyringe. Moreover, we also provide the methodology for the subsequent histology and serological testing.

A mouse model of severe acute pancreatitis is described herein. The procedure presented here is very rapid, simple, and accessible, thereby potentially allowing the study of the molecular mechanisms and different therapeutic interventions in acute pancreatitis in a convenient way.

Biliopankreatik Kanala Sodyum Taurocholate Retrograd Enjeksiyonu Kullanılarak Fare Şiddetli Akut Pankreatit Modelinin Kurulması

The prevalence of acute pancreatitis (AP), especially severe acute pancreatitis (SAP), is increasing in younger age groups annually. However, there is a ...

A Neonatal BALB/c Mouse Model of Necrotizing Enterocolitis

Necrotizing enterocolitis (NEC) is the most severe gastrointestinal (GI) disease that often occurs in premature infants, especially very low birth weight infants, with high mortality and unclear pathogenesis. The cause of NEC may be related to inflammatory immune regulatory system abnormalities. An NEC animal model is an indispensable tool for NEC disease immune research. NEC animal models usually use C57BL/6J neonatal mice; BALB/c neonatal mice are rarely used. Related studies have shown that when mice are infected, Th2 cell differentiation is predominant in BALB/c mice compared to C57BL/6J mice. Studies have suggested that the occurrence and development of NEC are associated with an increase in T helper type 2 (Th2) cells and are generally accompanied by infection. Therefore, this study used neonatal BALB/c mice to induce an NEC model with similar clinical characteristics and intestinal pathological changes as those observed in children with NEC. Further study is warranted to determine whether this animal model could be used to study Th2 cell responses in NEC.

Necrotizing enterocolitis (NEC) is the most severe gastrointestinal (GI) disease that often occurs in premature infants, especially very low birth weight infants, with high mortality and unclear pathogenesis. The cause of NEC may be related to inflammatory immune regulatory system abnormalities. An NEC animal model is an indispensable tool for NEC disease immune research. NEC animal models usually use C57BL/6J neonatal mice; BALB/c neonatal mice are rarely used. Related studies have shown that when mice are infected, Th2 cell differentiation is predominant in BALB/c mice compared to C57BL/6J mice. Studies have suggested that the occurrence and development of NEC are associated with an increase in T helper type 2 (Th2) cells and are generally accompanied by infection. Therefore, this study used neonatal BALB/c mice to induce an NEC model with similar clinical characteristics and intestinal pathological changes as those observed in children with NEC. Further study is warranted to determine whether this animal model could be used to study Th2 cell responses in NEC.

Nekrotizan Enterokolit'in Yenidoğan BALB/c Fare Modeli

Necrotizing enterocolitis (NEC) is the most severe gastrointestinal (GI) disease that often occurs in premature infants, especially very low birth weight ...

Establishment and Evaluation of a Porcine Vein Graft Disease Model

Venous graft disease (VGD) is the leading cause of coronary artery bypass graft (CABG) failure. Large animal models of CABG-VGD are needed for the investigation of disease mechanisms and the development of therapeutic strategies. 
To perform the surgery, we enter the cardiac chamber through the third intercostal space and carefully dissect the internal mammary vein and immerse it in normal saline. The right main coronary artery is then treated for ischemia. The target vessel is incised, a shunt plug is placed, and the distal end of the graft vein is anastomosed. The ascending aorta is partially blocked, and the proximal end of the graft vein is anastomosed after perforation. The graft vein is checked for patency, and the proximal right coronary artery is ligated. 
CABG surgery is performed in minipigs to harvest the left internal mammary vein for its use as a vascular graft. Serum biochemical tests are used to evaluate the physiological status of the animals after surgery. Ultrasound examination shows that the proximal, middle, and distal end of the graft vessel are unobstructed. In the surgical model, turbulent blood flow in the graft is observed upon histological examination after the CABG surgery, and venous graft stenosis associated with intimal hyperplasia is observed in the graft. The study here provides detailed surgical procedures for the establishment of a repeatable CABG-induced VGD model.

In this protocol, novel pig vein bypass grafting was performed through a small incision in the left chest wall without cardiopulmonary bypass. A postoperative pathology study was done, which showed intimal thickening.

Domuz Damarı Greft Hastalığı Modelinin Kurulması ve Değerlendirilmesi

Venous graft disease (VGD) is the leading cause of coronary artery bypass graft (CABG) failure. Large animal models of CABG-VGD are needed for the ...

Establishment of a Simple and Effective Rat Model for Intraoperative Parathyroid Gland Imaging

Parathyroid gland (PG) identification is a critical unmet need in thyroidectomy. The identification of the PG is challenging in thyroid surgery as it is similar in color to the thyroid gland. The lack of effective animal models in preclinical research is a severe limitation for the development of PG identification techniques. This protocol allows for the establishment of a simple and effective rat model for PG identification. In this model, black iron oxide nanoparticles (IONPs) are injected locally in the thyroid gland and rapidly diffuse within the thyroid gland but not the PG. A negatively stained PG and a positively stained thyroid gland can be easily identified by the naked eye without requiring external microscopes. The position of the PG can be identified by increasing the color contrast between the thyroid gland and the PG, based on the color of the black IONPs. This rat model is low-cost and convenient for PG identification, and the IONPs are a novel PG contrast agent.

To date, the development of parathyroid gland (PG) identification methods is limited by the lack of animal models in preclinical research. Here, we establish a simple and effective rat model for intraoperative PG imaging and evaluate its effectiveness by using iron oxide nanoparticles as a novel PG contrast agent.

İntraoperatif Paratiroid Bezi Görüntülemede Basit ve Etkili Bir Sıçan Modelinin Oluşturulması

Parathyroid gland (PG) identification is a critical unmet need in thyroidectomy. The identification of the PG is challenging in thyroid surgery as it is ...