Bu yöntem bakteri ve maya gibi organizmalarda ve farklı hücre tiplerinde geçici protein etkileşimlerini yakalar. Burada hücresel proteostazda yer alan geçici olarak oluşturulmuş özel şaperon komplekslerini izliyoruz. Bu tekniğin en büyük avantajı prokaryotik ve ökaryotik hücrelerde protein derlemelerinin dinamiği ve hücre altı lokalizasyonu hakkında bilgi üretebilme yeteneğidir.
Bakteri ve maya gibi tek hücreli organizmalarda bu tekniğin adaptasyonları, araştırmacılar mikrobiyal enfeksiyonlar ile ilgili hastalıkları araştırmak için güçlü bir araç olarak kullanmak için izin verir. Bu teknik, protokolün numune hazırlama aşamasındaki koşulları değiştirerek hemen hemen tüm organizmalardaki protein etkileşimlerini analiz etmek için potansiyel olarak kullanılabilir. İmmünhistokimya, immünfloresans, ELISA veya immünoprediyağışlarda spesifik ve test edilmiş kaliteli antikorların seçilmesi önemlidir.
Poli-L-Lizin ile 10 kuyulu tanısal slaytları önceden tedavi ederek başlayın. Her kuyuya 100 mikrolitre steril ve filtrelenmiş %0.0001 poli-L-L-L-Lizin ekleyin ve slaytları steril laminar akış kaputunda 30 dakika kuluçkaya yatırın. Daha sonra, fazla poli-L-L-Lizin kaldırmak için steril su 50 mikrolitre ile her iyi yıkayın.
Hücre tipine bağlı olarak her kuyu başına yaklaşık 15.000 hücre ekleyin ve %5 karbondioksit le 37 santigrat derecede steril nemli bir kuluçka makinesindeki hücreleri %60-80'lik bir kesişme ile büyütün. 24 saat sonra, her kuyunun kenarına bir mendil kağıt yerleştirerek büyüme ortamını çıkarın ve hücreleri 50 mikrolitre PBS ile üç kez yıkayın. Daha sonra her kuyuya PBS'de 50 mikrolitre taze hazırlanmış %4 paraformaldehit ekleyerek ve 10 dakika oda sıcaklığında kaydırağı kuluçkaya yatırarak hücreleri düzeltin.
Fiksasyondan sonra, slaytı PBS ile bir slayt boyama kavanozuna batırarak slaytı üç kez yıkayın. Bağlı hücrelerin zarlarını permeabilize etmek için, pbs%0.5 Triton-X100 100 mililitre slayt batırın ve oda sıcaklığında 10 dakika boyunca hücreleri kuluçkaya yat. Daha sonra tbs-t slaytlar üç kez yıkayın.
Son yıkamadan sonra, bir kağıt mendil ile fazla tampon kaldırın. S.cerevisiae hücrelerini el yazması talimatlara göre büyütüp seyreltin, daha sonra 50 mililitrelik bir santrifüj tüpüne ve pelete santrifüj ile 665 kez g'de üç dakika süreyle aktarın. Supernatant çıkarın ve taze orta beş mililitre hücreleri yeniden askıya.
Daha sonra%4'lük son konsantrasyon için %37 formaldehit 550 mikrolitre ekleyin ve hücreleri düzeltmek için 15 dakika oda sıcaklığında kültürü kuluçkaya yatırın. Kuluçka sonra, hücreleri pelet, supernatant kaldırmak ve yıkama tampon taze hazırlanmış bir mililitre içinde pelet resuspend 4%paraformaldehit. Hücreleri 45 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya yatırın.
Bu arada, her kuyuya %0,0001 poli-L-L-L-Lizin çözeltisi 100 mikrolitre ekleyerek ve slaytları oda sıcaklığında 30 dakika kuluçkaya yatırarak tanı slaytlarını hazırlayın. Daha sonra aşırı poli-L-L-Lizin'i ultra saf suyla yıkayın ve kaydırakların kurumasını bekleyin. Kuluçka adımından sonra, santrifüj ile bir mililitre yıkama tamponu ile hücreleri iki kez yıkayın.
Supernatant çıkarın ve yıkama tampon hücreleri resuspend. Son yıkamadan sonra hücreleri pelet, ve supernatant kaldırmak ve yıkama tampon bir mililitre hücreleri yeniden askıya 1.2 molar sorbitol içeren. Hücre duvarını sindirmek için, hücreleri tekrar pelet ve taze hazırlanmış Lyticase çözeltisi 250 mikrolitre hücreleri yeniden askıya.
Hücreleri 30 derecede 15 dakika boyunca hafifçe sallayarak kuluçkaya yatırın. Sindirim adımından sonra, yıkama tampon hücreleri üç kez yıkayın ve 1.2 molar sorbitol içeren yıkama tampon 250 mikrolitre hücreleri yeniden askıya. Her poli-L-L-Lizin kaplı iyi yeniden askıya hücreleri 20 mikrolitre ekleyin ve sabit ve permeabilized hücrelerin 30 dakika eklemek için izin.
Yapışık olmayan hücreleri çıkarmak için kuyuları 50 mikrolitre yıkama tamponuyla üç kez yıkayın ve yakınlık ligasyon teşbitine devam edin. Her kuyuya blokaj tamponunun bir damlasını ekleyerek yakınlık ligasyon testini veya PLA protokolünü başlatın ve kaydırağı 37 santigrat derecede 30 dakika nemli bir odada kuluçkaya yatırın. Her kuyunun kenarına bir mendil kağıdı yerleştirerek engelleme tamponu çıkarın ve yıkama tampon A.Next 100 mililitre hücreleri iki kez yıkayın, her bir kuyuiçin birincil antikor çözeltisi 40 mikrolitre ekleyin ve nemli bir odada 37 derece santigrat slayt 60 dakika boyunca slayt kuluçka.
Birincil antikor çözeltisini çıkarın ve kaydırakları yıkama tamponu A.After yıkamadan sonra, her kuyuya 40 mikrolitre ikincil antikor çözeltisi ekleyin ve kaydırağı nemli bir odada 37 derecede 60 dakika kuluçkaya yatırın. Daha sonra çözeltiyi çıkarın ve slaytları iki kez yıkama tamponu A.Then konektör oligonükleotid ve DNA ligaz içeren DNA ligasyon karışımının 40 mikrolitre ekleyin, her bir kuyuya, ve 30 dakika boyunca 37 santigrat derece nemli odasında slayt kuluçka. Kuluçka dan sonra, ligasyon karışımı kaldırmak ve iki kez yıkama tampon A.Add 40 dna amplifikasyon karışımı dna polimeraz ve floresan etiketli oligonükleotidler her bir kuyuya içeren mikrolitre ekleyin ve 37 santigrat derece nemli odasında 100 dakika kuluçka.
Amplifikasyon karışımını çıkarın ve slaytları 100 mililitre yıkama tamponu B'de yıkama başına 10 dakika yıkayın. Daha sonra 100 mililitre yıkama tamponu B ultrasaf suda 1 ila 100 seyreltilmiş slaytlar yıkayın. Kuyu başına 20 mikrolitre DAPI içeren montaj ortamı ekleyin.
Bir kapak kayma ve oje ile mühür ile slayt kuyuları kapağı. Bu protokol, HeLa, S.cerevisiae ve E.coli hücrelerinde farklı J-etki alanı proteinleri ile Hsp70 şaperon ve J-etki alanı proteinleri arasında oluşan geçici şaperon montajlarını izlemek için başarıyla kullanılmıştır. İnsan sınıfı A ve B sınıfı J-etki alanı proteinleri son derece spesifik primer antikorlarla hedeflendi.
Kırmızı floresan puncti'nin her biri HeLa hücrelerinde iki farklı J-etki alanı proteini arasında oluşan bir protein kompleksini temsil eder. Benzer karışık sınıf J-etki alanı protein kompleksleri de tek hücreli ökaryot S.cerevisiae, ya da fırıncı maya gözlenir. PLA'dan üretilen floresan penktinbazıları küçük hücre büyüklüğü nedeniyle bireysel fokolarak çözülmesi daha zordu.
E.coli hücrelerinde A ve B-etki alanı proteinleri arasındaki karmaşık oluşum, saflaştırılmış proteinlerle yapılan biyokimyasal çalışmalarla tutarlı olarak gözlenmemiştir. Ancak J-etki alanı proteinleri ve Hsp70 refakatçisi içeren diğer şaperon montajları PLA protokolü kullanılarak yakalandı. Aksi takdirde komple PLA reaksiyonlarında etkileşimeden J-etki alanı proteinlerinden birine karşı birincil antikor eksikliği olan teknik kontroller, hücrelerde çok az floresan puncti oluşumu nu gösterdi, yanlış pozitif sinyal amplifikasyonu eksikliğini gösteriyor.
Yakınlık ligasyon testini kullanarak güvenilir sonuçlar elde etmek için, kullanılan antikorların yeterli kalitede olduğunu önceden doğrulayın. Ayrıca, bir hücre duvarı içeren hücrelerin aşırı sindirim kaçınarak önlem alın.
