Sağlık, AR53579, Osteogenezi National Institutes: Kemik Tropic Peptitler potansiyelize Ulusal Sağlık Enstitüleri, AR056422 osteojenik Peptitler Anabolik Etkisi Ulusal Sağlık Enstitüleri, T32 AR050960, Kas-iskelet Doku Onarımı ve Rejenerasyon DOD, PC051219 Nucleolin: Prostat Kanseri ve Kemik İliği Endotel Hücre Adezyon Romanı Arabulucu Savunma Bakanlığı, PC061508 Prostat Kanseri Metastaz Hücre Kemik İliği yapışma Arabulucular

1 in vivo olarak Faj yalıtın Biopanning Bu Hedef Uzun Kemikler Faj DNA dizilimini ve buna karşılık gelen bir dizisi ile Peptitler sentezlenmiştir. Peptitler Gly-Gly-Gly-ser-lizin Bağlayıcı (linker / iz peptidler izlemek için yardımcı çift floresan kromoforlar tabi) sentezlenmiştir. <ol><li> 10 haftalık Balb / c fare anestezi, kalp maruz. </li><li> Doktora-12 Faj ekran peptit kütüphanesi kiti (New England Biolabs, Beverly, MA) in vivo biopanning, 10 x 1010 pfu için kullanılan ve kalbin içine enjekte edildi. </li><li> Yaklaşık 5 dakika sonra, fare ötenazi edildi. Femur maruz kalan ve disseke, femur ucu kesildi ve kemik iliği kaldırıldı. </li><li> Sol femur içinde ve dışında 10 kez PBS ile yıkandıktan sonra, femur ER2537 bakteriler eklendi (non-yıkandı, faj olarak adlandırılır, 6. adıma atlayın). </li><li> Sağ femur intramedüller kanal, 21-gauge iğne ile bağlı olmayan faj kaldırmak için bir şırınga% 2 kurutulmuş yağsız süt ile on kez durulanır. Bound faj, HCl glisin tamponu, pH 2.2, 1M Tris ile nötralize ile intramedüller kanal yıkandı, ER2537 bakteri ve faj (kolonda sürüklenecektir olarak anılacaktır) yükseltmek için 4.5 saat süreyle kültüre. </li><li> Bakteriler, 4 ° C ve faj PEG / NaCl çözeltisi ilave edilerek 4 ° C&#39;de gece çöktürülmüş 10 dakika santrifüj sedimentasyon çıkarıldı. Faj santrifüj tarafından toplanan ve asma ve 1 / 6 hacmi PEG / NaCl ilave edilerek iki kez çöktürülmüş oldu. Son pelet% 0,02 NaN3 TBS içinde yeniden süspanse edildi. </li><li> Ve non-yıkandı, yıkandı, faj amplifiye Eluatlar ayrı farelere enjekte edildi ve faj yukarıdaki gibi izole edilmiştir. Sadece sol femur olmayan yıkandı, faj enjekte ve femur (bkz. yukarıda adım 4) bakteriler doğrudan yerleştirilir fare kaldırıldı. Yıkandı, faj fare sadece sağ femur ve (bkz. yukarıdaki adım 5), bakteri eklemeden önce HCI-glisin tampon tarafından yayımlanan faj izole edilmiştir. </li><li> Bu in vivo biopanning prosedürü astar (Faj ekran kiti ile sağlanan)-98 kullanarak DNA sıralama önce üç kez tekrarlandı. </li><li> Pooled faj, saflaştırılmış, bakteri kültürleri amplifiye quantitated ve sonra dördüncü bir fare enjekte edildi. Sıralama tekrarlanır oldu. </li><li> Kemik ve kemik iliği peptid özgüllüğü göstermek için, faj, böbrek yıkandı, ve karaciğer yukarıda açıklandığı gibi analiz edildi. Tüm etaplarda bu organların (% 10&#39;dan az) bulunan faj küçük miktarda vardı. </li><li> Peptitler, ve biyotin, hücre ve doku boyama için kullanılacak gibi in vivo çalışma olmadan, Gly-Gly-Gly-ser-lys sırası ile sentezlenmiştir . </li></ol> 2. Osteojenik Hücre Farklılaşma Deneyler Mezenkimal Hücre Kültürü <ol><li> Laboratuarımızda 1 izole edilen klonlanmış bir fare çoklu potansiyel kemik iliği stroma (D1) in vitro deneylerde hücre hattı kullanılmıştır . Hücreleri Dulbecco&#39;nun modifiye temel, orta, DMEM,% 10 fetal sığır serumu (Gibco kedi # 16.000-044), elli miligram sodyum askorbat mililitrede (ile desteklenmiş düşük glikoz (Gibco kedi # 11.885-084) kültüre edildi Sigma kedi # A7631 ), ve 100 U / ml penisilin G ve 100 mg / ml streptomisin (Gibco kedi # 15.140-122). </li><li> Kültürler 37 tutuldu ° C,% 5 CO 2 su ceketli inkübatörler ve alt-kültür nemlendirilmiş bir atmosferde hücreleri yaklaşık 90% konfluent kadar . </li><li> Hücre, tripsinize pelet için santrifüj sayılır ve plasticware tedavi 5x10 3 hücre / doku kültürü cm 2 &#39;lik bir konsantrasyon numaralı seribaşı idi. </li></ol> 3. Doku ve Hücre ve Doku Peptid Boyama <ol><li> D1 veya kemik iliği hücreleri, fibronektin veya jelatin kaplı oda kaplanmıştır DMEM ve 24 saat boyunca% 10 fetal sığır serumu içeren slaytlar. </li><li> Hücreler PBS ile yıkandı. 30 dakika boyunca% 4 paraformaldehid hücre / doku ile tespit edildi </li><li> Aşırı aldehit, 10 dakika için 0.5 M Glisin (pH 7.5) ile bloke edildi. </li><li> Endojen avidin ve biyotin reseptörleri hücre yüzeyinde, 1 saat süreyle% 5 BSA + Avidin engelleme çözüm ek tarafından bloke edildi, sonra 1 saat süreyle% 5 BSA + Biotin engelleme çözümü bloke 5 dakika boyunca bir kez PBS ile durulanır. </li><li> Daha sonra 100 mcM biotinlenmiş L7 ve R1 peptidler, 30 dakika boyunca kuyulara ilave edildi. </li><li> Hücreler ve Alexa Un Streptavidin 1:1000 dilüsyon eklenir ve 30 dakika boyunca karanlıkta inkübe edildi 5 dk PBS ile üç kez yıkandı. </li><li> Hücreler yıkanmış ve lamelleri vectashield montaj medya ile monte edilmiş ve bir floresan mikroskop altında incelenir. </li></ol> 4. Alkalin Fosfataz Aktivitesi Testi <ol><li> Alkalin fosfataz cüretici tarafından önerilen bir alkalin fosfataz kiti (BioRad) kullanarak mono tabakaları olorimetric tahlil yapıldı. </li><li> D1 hücreleri x 10 3 hücre / cm 2, 6 kuyu kültür plakalar üzerinde bir yoğunluk 5 kaplama ve R1 peptit ile tedavi edildi, ALP aktivitesi gün 4, 8, 12, 16 ve 20 belirlendi . </li><li> Hücre lizatları hazırlamak için, hücre tabakaları PBS ile üç defa yıkanır ve sonra PBS içine kazınmış sonication ve hücresel enkaz kaldırmak için santrifüj izledi. </li><li> Eşit miktarda lizat (100 mcL) 100 mcL taze hazırlanmış kolorimetrik substrat para-nitrofenil fosfat ile karıştırdı ve 37 inkübe ° C de 30 dakika boyunca. </li><li> 0.2 N NaOH çözümleri 100 mcL ekleyerek enzimatik reaksiyon durduruldu. ALP aktivitesi ELISA okuyucu (Bio-Rad) kullanılarak 405 nm&#39;de ölçüldü. </li><li> Protein konsantrasyonu hücre lizatları BioRad Protein Testi Kiti ile ölçüldü ve AP aktivitesi sonra para-nitrofenol nmol / dak / mg protein olarak ifade edildi. </li><li> ALP aktivitesi üreticinin özellikleri (Sigma, Inc.) Göre hesaplanmıştır. </li><li> ALP aktivite birimleri hücre lizat BCA yöntemi (Pierce, Rockford, IL) ile toplam protein içeriği miligram normalize edildi. </li></ol> 5. L7 ve R1 kullanarak Mezenkimal Hücre Farklılaşması <ol><li> Akışkan mezenkimal hücreler (D1) confluency yaklaşık% 90 büyüdü ve 5nm L7 ve R1 peptid ile tedavi edildi. </li><li> Hücreler, 0.5, 2, 6, 24 ve 48 saat hasat edildi ve RNA üreticinin talimatlarına kullanarak Qiagen RNeasy kiti kullanılarak hazırlanmıştır. </li><li> Ters transkriptaz (RT) reaksiyonlar tavlanmış (37 ° C, 10 dakika) ve ilk iplikçik cDNA sentezi (42 ° C, 30 dakika) ve ısı inaktivasyonu (5 dakika boyunca 95 ° C) ile takip edildi. Ortaya çıkan cDNA donmuş depolanan (-70 ° C), gerçek zamanlı PCR ile test kadar. </li><li> Real Time PCR QuantiTect SYBR Green PCR kiti (Qiagen) kullanılarak yapıldı. Reaksiyonlar, 25 SYBR Green kiti ana karışımı mcL ve ileri ve Runx2 örneğin, Osterix, Osteokalsin, Kemik sialoprotein ve-katenin olarak wnt yol genler için kemik spesifik genlerin ters primerler (300 nmol / L) ile yapıldı LRP6, Wnt 5a, 7b, 10b, DKK1 ve OPG ve RANKL (bkz. Tablo 1). </li><li> CDNA örnek 3 mcL RT tepki sulandırılmamış nihai reaksiyon karışımına eklendi. 96-iyi real-time PCR formatı plazmid DNA standartları yinelenen altı 10 kat dilüsyonlarının dahildir. Plaka kuyu optik yapıştırıcı kapakları (BioRad) ile mühürlü ve tam karıştırma sağlamak için düşük hızda (300 g, 5 dakika) santrifüj edildi. </li><li> Her numune en az iki nüsha iCycler aleti (BioRad Laboratories, Hercules, CA) ile incelendi. </li><li> PCR protokolleri 94 40 döngü denatürasyon AmpliTaq Gold DNA polimeraz ilgili aktivasyon ° C 30 saniye, 30 saniye boyunca 72 ° C&#39;de 30 saniye, ve uzatma ilgili tavlama sıcaklığı. Her bir örnek için PCR eşik devir sayısı (BT), floresan eşik sınırı aşıldı noktada hesaplanmıştır. Eşik sınırı, ortalama bir arka plan floresan üzerinde 10 ila 20 standart sapma (SD) floresan eğrileri doğrusal logaritmik faz boyunca tespit edildi. Standart eğri denklemleri toplam RNA günümüze kadar cDNA göreli log10 karşısında ortalama BT regresyon analizi ile hesaplandı. Hedef genlerin Bağıl ifade kemik spesifik genler 18S normalize ve b-aktin Wnt yolunun gen için kullanılır. </li></ol> 6 Gelfoam Kompozit in vivo Hazırlık <ol><li> Aseptik rutinleri kullanarak, gelfoam silindir (Pharmacia &amp; Upjohn kedi # 09-0353-01), 3 mm çapında 8 mm uzunluğunda, kendi kendine tasarlanmış bir alet kullanılarak oluşturuldu. </li><li> Cerrahi yirmi dört saat önce, gelfoam silindir emmek-yüklü L7 veya peptid olmadan R1 peptid (PBS içinde 20 mcM) veya PBS. Gelfoam silindirler steril 12 kuyu kültür kaplarına aktarılır ve gece -4 ° C&#39;de muhafaza edildi </li><li> Cerrahi zamanda, kültür yemekler gelfoam kompozit buzdolabı taşındı ve ameliyat kadar buz koymak. </li></ol> 7. Kemik defektleri <ol><li> Tüm hayvan prosedürleri, Virginia Üniversitesi, Sağlık Sistemi Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu, önceki yapılmaktadır tarafından kabul edildi. On dokuz aylık yetişkin singeneik erkek Fischer 344 sıçanlar (350-400 g), ketamin (gram vücut ağırlığı başına 50 g) ve xylazine (5 g gram vücut ağırlığı başına) karışımı ile anestezi intraperitoneal. </li><li> Tibianın anteromedial yönü ile ikili bir cerrahi yaklaşım yapıldı. Sıçanlar bu yaşta veya daha büyük kesit alanı önemsiz artışlar, kortikal kemik alanı, kemik kütlesi, kemik yoğunluğu ve anteromedia aksiyel uzunluk gösterirtibia l yönü. Tuzlu sulama altında; büyük bir dikdörtgen unicortical defekt uzun bir pnömatik çapak (Zimmer Hall High Speed ​​Drill) kullanarak 8 mm 3 mm genişliğinde ölçülen oluşturuldu. </li><li> Kemik defekti peptidler içeren veya içermeyen ya gelfoam ile tedavi edildi. 1.5 mm derinlik 8 mm uzunluğunda 3 mm genişliğinde ölçüm implante Tüm iskeleler, nazik dokunarak yerleştirildi. Hayır harici veya dahili uzuv fiksasyon cihazlarının ameliyat sonrası kullanılır ve herhangi bir kısıtlama olmaksızın ambulasyon izin hayvanların ameliyattan hemen takip ediyorlardı. </li></ol> 8. Histoloji ve morfometrisi Kemik rejenerasyonu brüt morfolojisi ve alınan dijital görüntüler ile değerlendirildi. <ol><li> Sıçanlar ötenazi ve tibiaları 5, 3 toplandı ve 12 hafta hasarına yanıt olarak oluşturulan yeni kemik miktarını ölçmek için. </li><li> Hasat tibia kemik defekti dikkatle kontrol ettikten sonra, sonra boyuna rutin olarak işlenmiş ve parafine ve kesitli, 72 saat boyunca RDO hızlı decalcifier Tankı, nötr formalin tamponlu% 10 fikse edildi. </li><li> Kemik rejenerasyonu brüt ve ışık mikroskobik muayene ile değerlendirildi. </li><li> On hayvanlar her koşul için (yani boş kusur, gelfoam tek başına ve gelfoam artı R1 peptid) kullanılmıştır. 8mm unicortical kusur, 8 mikron kalınlığında, her biri ~ 40 doku bölümleri, çapında temsil edildi. Bu 40 bölümden, yeni kemik miktarını ölçmek için en az 6 bölümden kullandı. </li><li> Tüm doku kesitlerinde osteoid matriks etiketler Hematoksilen / eozin (H &amp; E) ile boyandı. </li><li> Tüm slaytlar mikroskobu ile incelendi. </li></ol> 9 - Kemik Onarım Genel bakış Kemik onarım açıkça göz kas-iskelet doku rejenerasyonu alanında çok önemli bir alan. Peptidler hedef yıl olmasa bile on yıllar boyunca kalıcı olabilir protez kullanımı özellikle kemik, Ortopedi ve Travmatoloji pratiğinde önemli bir yardımcı program olabilirdi ki. Kemik tropik faktörlerin biyomimetik doku mühendisliği alanında teknolojik bir adım, hem de kemik protez ameliyatı için yaratabilir. Sentetik ya da doğal polimerleri kemik faktörleri hedef alması dolayısıyla, onarım ve yenilenme gören dokuların içinde endojen hücreler temizleyici, hücre bağlılık özgüllüğü yardımcı olabilir. Ek bir amaç, bir faj gösterim kütüphanesi biopanning in vivo tarafından tespit peptidler hedefleme benzersiz kemik, kemik ve kemik iliğinden izole hücreleri bağlamak olsaydı kurmak ve osteogenezis vitro ve in vivo olarak kemik rejenerasyon modüle potansiyeline sahip oldu. Deneylerde, kemik rejenerasyonu peptid faaliyetin ayrıntıları aydınlatmak için, histoloji, biyokimya, gen ekspresyonu, mikro-CT ve sipariş biyomekanik tarafından incelenir, doğal ve sentetik polimer matrisler ve kemik rejenerasyonu kullanarak sıçan femoral kusurları peptidler teslim etti. Bu yaklaşım daha da geliştirilmesi, biyolojik olarak aktif bileşikler hedef kemik keşfi ve geliştirilmesi için yol ve hücresel ve moleküler düzeyde biyolojik olarak karakterize edilirler mekanizmalar aracılığıyla onarım potansiyalize. Boyanma Peptidler mezenkimal hücreler için bağlayıcı ve lokalizasyonu belirlemek için biotin etiketleri ile sentezlenmiştir. Floresein izotiyosiyanat (FITC) avidin, in vitro olarak yetiştirilen hücreler mikroskobik peptidlerin bağlama yerelleştirmek kullanılan etiketli . Peptidlerin yanı sıra kültür mezenkimal hücreler in vitro fare kaburga doku kesitlerinde (Şekil 1) ve kemik iliği bağlanırlar. Von Kossa Boyama Mezenkimal hücre (D1), kemik iliği klonlanmış ve peptidlerin osteojenik Vitro hücreleri üzerinde etkisini belirlemek için kullanılmıştır . Hücreleri, hücre morfolojisi ve gen ekspresyonu değişiklikleri belirlemek için peptidler L7 ve R1 ile tedavi edildi. 4. günde, hücrelerin toplam başlamıştı, ve agrega, nodüller, kültür kemik hücreleri (Şekil 2) benzer bir hücre davranış kalıbı oluşturmak için zaman genişletilmiştir . Peptid L7 ek veya von Kossa ile kültürlerin hücreleri gelişmiş boyama R1. Hücreler daha sonra 16 gün kültür peptid L7 veya R1 farklı konsantrasyonları ile tedavi edildi. In vitro 5 nM peptid en etkili olduğu tespit edilmiştir. Peptid ile tedavi edildi kültürlerde Alkalin fosfataz aktivitesi 2 ila 3,5 kat arttı. Kat artış peptid konsantrasyonu ve kültür tedavi süresi bağlıydı. Real-time PCR L7 ile muamele edilen hücreler ve R1 peptidler Gerçek Zamanlı P kullanılarak analiz edildiCR için, bilinen iki kemik hücresi transkripsiyon faktörleri (Osterix ve Runx2) ve üç kemik matriks proteinleri (kemik sialoprotein, osteokalsin ve kollajen tip I) gen ekspresyonu. R1 ile tedavi Osterix ve Runx2 gen ekspresyonu artış gösterdi. Kollajen tip 1 gen ekspresyonu değişmemiştir. L7 ile tedavi, BSP ve osteokalsin gen ekspresyonu bir artışın yanı sıra, tip I kollajen gen ekspresyonu gösterdi. Bu hem peptidler, mezenkimal hücre kültürlerinde osteogenezis oluşumu ve ilerlemesinde ilgili genler üzerinde bir etkiye sahip olduğunu göstermektedir. Peptidler R1 ve L7 ile in vitro hücre kültürleri tedavi mezenkimal hücreler kullanarak kemik oluşumu ile ilgili bir anabolik etkisi ortaya çıkarmıştır . RANKL için osteoprotegerin oranında bir artış osteoklastlar olarak bilinen kemik yıkıcı hücreler işe bir azalma gösterir. Peptitler ile hücrelerin tedavisi ayrıca kemik oluşumu ile ilişkilidir ve osteogenezis inhibe eden faktörleri azalır genlerin ifadesinde bir artışa yol açar. Histoloji Kemik miktarını belirlemek için, biz böylece otofloresans μLtraviolet ışık üreten kemik dilim maruz. Bu niceliklendirme 2 amaç için, kemik ve non-kemik dokuları arasında daha fazla kontrast sağlar . Bölümlerde aynı büyütme (x10 objektif) bir Nikon dijital görüntüleme sistemi ile parlak bir alan ve UV ışığı (Şekil 3) Nikon ve UV ışığı kullanarak fotoğrafları çekildi. Sonuçta elde edilen dijital görüntüler Metavue görüntüleme yazılımı (Moleküler Cihazlar) ile analiz edildi. 8 mm unicortical kusur içeren sabit bir faiz, dikdörtgen bölge (ROI) seçti. Yaralanma site her zaman, her görüntünün doğru pozisyonda elle kutuya koyarak bu ROI içinde temsil ediliyordu. H &amp; E-pozitif piksel kısmen, bir renk tolerans sihirli değnek aracı kullanarak otomatik. H &amp; E-boyanan kesitler kemik dokusunun histolojik görünümü ile tam denk yeşil bir dizi vurgulanır piksel sonuçlandı Bu tolerans ayarı. H &amp; E-pozitif piksel her bölüm için toplam sayısı kaydedildi. Tibial her numune için ayrı ayrı bölümlerden piksel sayıları ortalamaları alındı ​​ve bu ortalamalara göre tedavi grupları içinde ve arasındaki farkları alınarak hesaplanmıştır. Tüm numuneler için alanlarda daha sonra yeni kortikal kemik miktarı (Şekil 4) dayalı olarak karşılaştırıldı . Karşılaştırıldığında tek başına gelfoam gelfoam + peptit ile tedavi edilen kusurlar kemik onarım belirlemek için kemik bölümlerde varlığı belirlendi. Gelfoam + R1 peptit ile doluydu Kusur 3. en büyük 10 ile kortikal onarım tutarı, 7 ve 2 kat artarak, 5, 12 hafta sırasıyla gösterdi. Gelfoam kortikal kemik onarım farklar + peptid yalnız gelfoam ile karşılaştırıldığında peptid kortikal kemik rejenerasyonu (Şekil 5) teşvik gösteren 3 ve 5 hafta en dikkat çekici. 10 Osteojenik Peptitler Anabolik Etkisi OPG / RANKL oranı peptidler osteoblastlar üzerinde doğrudan bir etkisi var ve kemik rezorpsiyonu düzenleyen anlaşılacağı RANKL / OPG oranı, daha büyüktür. Sentetik peptidlerin hazırlık hız, moleküler istikrar, uzun raf ömrü ve potansiyel terapötik uygulamalar gibi daha büyük moleküller daha fazla avantaj olabilir. Önemli bir ilerleme kontrol sitokinler ve büyüme faktörleri, kemik kaybı ve rejenerasyon modüle girişimleri yapılmıştır. Bu osteotropic peptitler, kemik anabolizmasını ve kemik rejenerasyonu teşvik mevcut tedaviler için cazip alternatifler sunabilir. <img src="/files/ftp_upload/2362/2362fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1 in vitro fare kaburga doku bölümünde kemik iliği ve bağlayıcıdır Peptid. <img src="/files/ftp_upload/2362/2362fig2.jpg" alt="Şekil 2" /> Şekil 2 mezenkimal hücreler (D1) peptid tedaviden sonra nodüller oluşturur. <img src="/files/ftp_upload/2362/2362fig3.jpg" alt="Şekil 3" /> Şekil 3 osteojenik peptidler, L7 ve R1 ile kemik onarım Histoloji. <img src="/files/ftp_upload/2362/2362fig4.jpg" alt="Şekil 4" /> Şekil 4. Kemik bölümler otofloresans neden olan UV ışık altında H &amp; E ile boyandı. Bu kantitatif amaçlar için, kemik ve non-kemik dokuları arasında daha fazla kontrast sağlar. <img src="/files/ftp_upload/2362/2362fig5.jpg" alt="Şekil 5" /> Şekil 5 kantitasyonu histoloji bölümlerinde kemik kortikal onarım en büyük miktar ile 5 hafta olduğunu gösterdi10 katlık bir değişiklik, 7 ve 2 kat, 3 ve 5 hafta peptid kortikal kemik rejenerasyonu teşvik gösteren.

<ol>
	<li>Diduch, D. R., Coe, M. R., Joyner, C., Owen, M. E., Balian, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+cell+lines+from+bone+marrow+that+differ+in+terms+of+collagen+synthesis,+osteogenic+characteristics,+and+matrix+mineralization.">Two cell lines from bone marrow that differ in terms of collagen synthesis, osteogenic characteristics, and matrix mineralization.</a> J. Bone Joint Surg. Am. 75, 92-105 (1993).</li><li>Stoddart, M. J., Furlong, P. I., Simpson, A. E., Davies, C. M., Richards, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viability+in+ex+vivo+cultured+cancellous.">Viability in ex vivo cultured cancellous.</a> Eur. Cells. Mater. 13, 69-70 (2007).</li><li>Lehr, J. E., Pienta, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preferential+adhesion+of+prostate+cancer+cells+to+a+human+bone+marrow+endothelial+cell+line.">Preferential adhesion of prostate cancer cells to a human bone marrow endothelial cell line.</a> J. Natl. Cancer Inst. 90, 118-123 (1998).</li><li>Schuster, N., G&#246;tz, C., Faust, M., Schneider, E., Prowald, A., Jungbluth, A., Montenarh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wild-type+p53+inhibits+protein+kinase+CK2+activity.">Wild-type p53 inhibits protein kinase CK2 activity.</a> J. Cell Biochem. 81, 172-183 (2001).</li><li>Cwirla, S. E., Peters, E. A., Barrett, R. W., Dower, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptides+on+phage:+a+vast+library+of+peptides+for+identifying+ligands.">Peptides on phage: a vast library of peptides for identifying ligands.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 87, 6378-6382 (1990).</li><li>Doorbar, J., Winter, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+a+peptide+antagonist+to+the+thrombin+receptor+using+phage+display.">Isolation of a peptide antagonist to the thrombin receptor using phage display.</a> J. Mol. Biol. 244, 361-369 (1994).</li><li>Ellerby, H. M., Arap, W., Ellerby, L. M., Kain, R., Andrusiak, R., Rio, G. D., Krajewski, S., Lombardo, C. R., Rao, R., Ruoslahti, E., Bredesen, D. E., Pasqualini, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-cancer+activity+of+targeted+pro-apoptotic+peptides.">Anti-cancer activity of targeted pro-apoptotic peptides.</a> Nat. Med. 5, 1032-1038 (1999).</li><li>Goodson, R. J., Doyle, M. V., Kaufman, S. E., Rosenberg, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-affinity+urokinase+receptor+antagonists+identified+with+bacteriophage+peptide+display.">High-affinity urokinase receptor antagonists identified with bacteriophage peptide display.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 91, 7129-7133 (1994).</li><li>Pasqualini, R., Koivunen, E., Ruoslahti, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+peptide+isolated+from+phage+display+libraries+is+a+structural+and+functional+mimic+of+an+RGD-binding+site+on+integrins.">A peptide isolated from phage display libraries is a structural and functional mimic of an RGD-binding site on integrins.</a> J. Cell Biol. 130, 1189-1196 (1995).</li><li>Pasqualini, R., Koivunen, E., Ruoslahti, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alpha+v+integrins+as+receptors+for+tumor+targeting+by+circulating+ligands.">Alpha v integrins as receptors for tumor targeting by circulating ligands.</a> Nat. Biotechnol. 15, 542-546 (1997).</li><li>Pasqualini, R., Koivunen, E., Kain, R., Lahdenranta, J., Sakamoto, M., Stryhn, A., Ashmun, R. A., Shapiro, L. H., Arap, W., Ruoslahti, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aminopeptidase+N+is+a+receptor+for+tumor-homing+peptides+and+a+target+for+inhibiting+angiogenesis.">Aminopeptidase N is a receptor for tumor-homing peptides and a target for inhibiting angiogenesis.</a> Cancer Res. 60, 722-727 (2000).</li><li>Rajotte, D., Arap, W., Hagedorn, M., Koivunen, E., Pasqualini, R., Ruoslahti, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+heterogeneity+of+the+vascular+endothelium+revealed+by+in+vivo+phage+display.">Molecular heterogeneity of the vascular endothelium revealed by in vivo phage display.</a> J. Clin. Invest. 102, 430-437 (1998).</li><li>Rajotte, D., Ruoslahti, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+dipeptidase+is+the+receptor+for+a+lung-targeting+peptide+identified+by+in+vivo+phage+display.">Membrane dipeptidase is the receptor for a lung-targeting peptide identified by in vivo phage display.</a> J. Biol. Chem. 274, 11593-11598 (1999).</li><li>Wang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+high-affinity+peptide+antagonists+of+14-3-3+proteins+by+phage+display.">Isolation of high-affinity peptide antagonists of 14-3-3 proteins by phage display.</a> Biochemistry. 38, 12499-12504 (1999).</li><li>Sugahara, K. N., Teesalu, T., Karmali, P. P., Kotamraju, V. R., Agemy, L., Greenwald, D. R., Ruoslahti, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coadministration+of+a+tumor-penetrating+peptide+enhances+the+efficacy+of+cancer+drugs.">Coadministration of a tumor-penetrating peptide enhances the efficacy of cancer drugs.</a> Science. 328, 1031-1035 (2010).</li><li>Sikes, R. A., Cooper, C. R., Beck, G. L., Pruitt, F., Brown, M. L., Balian, G., Meadows, G., Kluwer, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+Stromal+Cells+as+Therapeutics+Targets+in+Osseous+Metastasis.">Bone Stromal Cells as Therapeutics Targets in Osseous Metastasis.</a> Cancer Growth and Progression. "Integration/Interaction of Oncologic Growth". , 369-386 (2005).</li><li>Santos, J. L., Pandita, D., Rodrigues, J., P&#234;go, A. P., Granja, P. L., Tom&#225;s, H., Balian, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor-Mediated+Gene+Delivery+in+Mesenchymal+Stem+Cells+using+PAMAM+Dendrimers+conjugated+with+Osteotropic+Peptides.">Receptor-Mediated Gene Delivery in Mesenchymal Stem Cells using PAMAM Dendrimers conjugated with Osteotropic Peptides.</a> Molecular Pharmaceutics. , (2010).</li></ol>

Bu video üretim, Inc, New England Biolabs Bu makalede kullanılan bazı reaktiflerin üreten sponsor oldu.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Phage Display Peptide Library Kit-Ph.D-12</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>New England Biolabs</td>
<td>E8110S</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

peptides from phage display library modulate gene expression in mesenchymal cells and potentiate osteogenesis in unicortical bone defects

İki yeni sentetik peptidlerin kemik oluşumunu hızlandıran ve kollajen matriks kullanılarak teslim edilebilir. Bu çalışmanın amacı, bir unicortical defekt modeli, kemik onarım üzerindeki etkilerini araştırmaktır. Tedavi mezenkimal hücreler, alkalin fosfataz aktivitesinde bir artış, üretilen bu hücreler tarafından nodül oluşumu gösterdi ve Runx2, Osterix, kemik sialoprotein, ve osteokalsin için genlerin ifade arttı. Kontrolü daha az etkili iken kollajen sünger, kemik defektleri peptid terfi onarım ile ıslatılır. Bu çalışmada elde edilen sonuçlar, in vitro peptit ile tedavi edilen mezenkimal hücreler, kollajen sünger kullanarak in vivo teslim peptidler unicortical kusurlar tamir teşvik, osteogenesis doğru farklılaştırmak, ve gösterdi.

Watch this Scientific Journal Video about Peptides from Phage Display Library Modulate Gene Expression in Mesenchymal Cells and Potentiate Osteogenesis in Unicortical Bone Defects at JoVE.com

Peptides from Phage Display Library Modulate Gene Expression in Mesenchymal Cells and Potentiate Osteogenesis in Unicortical Bone Defects

Bir faj gösterim kütüphanesi hedef kemiği de peptit dizileri tanımlamak için kullanılır oldu. Amacı, mezenkimal hücre farklılaşması, bu peptitler etkisini araştırmak ve kemik rejenerasyonu üzerindeki etkisini belirlemek için.

Bakteriyofaj Görüntüleme Kütüphane Peptitler Mezenkimal Hücreler Gen ekspresyonunu modüle ve Unicortical Kemik Hastalıkları Osteogenezi potansiyalize

Two novel synthetic peptides accelerate bone formation and can be delivered using a collagen matrix. The aim of this study was to investigate the effects ...

peptides-from-phage-display-library-modulate-gene-expression

Research

JoVE Journal

Biology

17.9K Görüntüleme.  University of Virginia. Bir faj gösterim kütüphanesi hedef kemiği de peptit dizileri tanımlamak için kullanılır oldu. Amacı, mezenkimal hücre farklılaşması, bu peptitler etkisini araştırmak ve kemik rejenerasyonu üzerindeki etkisini belirlemek için.

Video: Peptides from Phage Display Library Modulate Gene Expression in Mesenchymal Cells and Potentiate Osteogenesis in Unicortical Bone Defects

Culture of myeloid dendritic cells from bone marrow precursors

Myeloid dendritic cells (DCs) are frequently used to study the interactions between innate and adaptive immune mechanisms and the early response to infection. Because these are the most potent antigen presenting cells, DCs are being increasingly used as a vaccine vector to study the induction of antigen-specific immune responses. In this video, we demonstrate the procedure for harvesting tibias and femurs from a donor mouse, processing the bone marrow and differentiating DCs in vitro. The properties of DCs change following stimulation: immature dendritic cells are potent phagocytes, whereas mature DCs are capable of antigen presentation and interaction with CD4+ and CD8+ T cells. This change in functional activity corresponds with the upregulation of cell surface markers and cytokine production. Many agents can be used to mature DCs, including cytokines and toll-like receptor ligands. In this video, we demonstrate flow cytometric comparisons of expression of two co-stimulatory molecules, CD86 and CD40, and the cytokine, IL-12, following overnight stimulation with CpG or mock treatment. After differentiation, DCs can be further manipulated for use as a vaccine vector or to generate antigen-specific immune responses by in vitro pulsing using peptides or proteins, or transduced using recombinant viral vectors. 

This video demonstrates the procedure for differentiating myeloid dendritic cells from mouse bone marrow. Isolation of mouse tibia and femur, and processing of bone marrow are demonstrated. Pictures demonstrating cell morphology before and after differentiation, and figures depicting cell phenotype and IL-12 production following maturation using CpG are shown.

Myeloid dendritik hücreler kemik iliği öncüleri Kültür

Myeloid dendritic cells (DCs) are frequently used to study the interactions between innate and adaptive immune mechanisms and the early response to ...

Biyoloji

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell  electroporation system and Gene Pulser  electroporation buffer were specifically developed to transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells.This video demonstrates how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow, and then prepare them for electroporation in the MXcell system. We begin by isolating femur and tibia. Bone marrow from both femur and tibia are then harvested and cultures are established. Cultured bone marrow cells are then transfected and analyzed.

This procedure describes how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow and is followed by transfection using the Gene Pulser MXCell electroporation system.

Hazırlık Elektroporasyon murin Kemik İliği itibaren İlköğretim Hematopoetik Hücre Kültürleri

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

In utero and ex vivo Electroporation for Gene Expression in Mouse Retinal Ganglion Cells

The retina and its sole output neuron, the retinal ganglion cell (RGC), comprise an excellent model in which to examine biological questions such as cell differentiation, axon guidance, retinotopic organization and synapse formation[1]. One drawback is the inability to efficiently and reliably manipulate gene expression in RGCs in vivo, especially in the otherwise accessible murine visual pathways. Transgenic mice can be used to manipulate gene expression, but this approach is often expensive, time consuming, and can produce unwanted side effects. In chick, in ovo electroporation is used to manipulate gene expression in RGCs for examining retina and RGC development. Although similar electroporation techniques have been developed in neonatal mouse pups[2], adult rats[3], and embryonic murine retinae in vitro[4], none of these strategies allow full characterization of RGC development and axon projections in vivo. To this end, we have developed two applications of electroporation, one in utero and the other ex vivo, to specifically target embryonic murine RGCs[5, 6]. 
With in utero retinal electroporation, we can misexpress or downregulate specific genes in RGCs and follow their axon projections through the visual pathways in vivo, allowing examination of guidance decisions at intermediate targets, such as the optic chiasm, or at target regions, such as the lateral geniculate nucleus. Perturbing gene expression in a subset of RGCs in an otherwise wild-type background facilitates an understanding of gene function throughout the retinal pathway. Additionally, we have developed a companion technique for analyzing RGC axon growth in vitro. We electroporate embryonic heads ex vivo, collect and incubate the whole retina, then prepare explants from these retinae several days later. Retinal explants can be used in a variety of in vitro assays in order to examine the response of electroporated RGC axons to guidance cues or other factors. In sum, this set of techniques enhances our ability to misexpress or downregulate genes in RGCs and should greatly aid studies examining RGC development and axon projections.

In utero and ex vivo Electroporation for Gene Expression in Mouse Retinal Ganglion Cells

Here we present two techniques for manipulating gene expression in murine retinal ganglion cells (RGCs) by in utero and ex vivo electroporation. These techniques enable one to examine how alterations in gene expression affect RGC development, axon guidance, and functional properties.

Fare Retina Ganglion Hücreleri Gen İfadesi utero ve ex vivo Elektroporasyon

The retina and its sole output neuron, the retinal ganglion cell (RGC), comprise an excellent model in which to examine biological questions such as cell ...

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell electroporation system and Gene Pulser electroporation buffer (Bio-Rad) were specifically developed to easily transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells. We will demonstrate how to perform a simple experiment to quickly identify the best electroporation conditions. We will demonstrate how to run several samples through a range of electroporation conditions so that an experiment can be conducted at the same time as optimization is performed. We will also show how optimal conditions identified using 96-well electroporation plates can be used with standard electroporation cuvettes, facilitating the switch from electroporation plates to electroporation cuvettes while maintaining the same electroporation efficiency. In the video, we will also discuss some of the key factors that can lead to the success or failure of electroporation experiments.

This procedure shows how to use the Gene Pulser MXcell electroporation system to rapidly and easily identify the best electroporation conditions for mouse embryonic fibroblasts (MEFs) or other primary cells. Considerations for troubleshooting are also discussed in the associated video.

Yüksek Verimli Primer Hücre Transfect Gen Verici MXcell Elektroporasyon Sistemi

Implantation of Ferumoxides Labeled Human Mesenchymal Stem Cells in Cartilage Defects

The field of tissue engineering integrates the principles of engineering, cell biology and medicine towards the regeneration of specific cells and functional tissue. Matrix associated stem cell implants (MASI) aim to regenerate cartilage defects due to arthritic or traumatic joint injuries. Adult mesenchymal stem cells (MSCs) have the ability to differentiate into cells of the chondrogenic lineage and have shown promising results for cell-based articular cartilage repair technologies. Autologous MSCs can be isolated from a variety of tissues, can be expanded in cell cultures without losing their differentiation potential, and have demonstrated chondrogenic differentiation in vitro and in vivo1, 2.
In order to provide local retention and viability of transplanted MSCs in cartilage defects, a scaffold is needed, which also supports subsequent differentiation and proliferation. The architecture of the scaffold guides tissue formation and permits the extracellular matrix, produced by the stem cells, to expand. Previous investigations have shown that a 2% agarose scaffold may support the development of stable hyaline cartilage and does not induce immune responses3.
Long term retention of transplanted stem cells in MASI is critical for cartilage regeneration. Labeling of MSCs with iron oxide nanoparticles allows for long-term in vivo tracking with non-invasive MR imaging techniques4.
This presentation will demonstrate techniques for labeling MSCs with iron oxide nanoparticles, the generation of cell-agarose constructs and implantation of these constructs into cartilage defects. The labeled constructs can be tracked non-invasively with MR-Imaging.

Goal of the presentation is to demonstrate a highly reproducible method to generate matrix associated stem cell implants in cartilage defects, which can be visualized with MR imaging. Stem cells are labeled with FDA-approved Ferumoxides, mixed with agarose, implanted into cartilage defects and imaged with a 7T MR scanner.

Ferumoxides implantasyonu Kıkırdak Kusur İnsan Mezenkimal Kök Hücreler Etiketli

The field of tissue engineering integrates the principles of engineering, cell biology and medicine towards the regeneration of specific cells and ...

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only to study the effects of downregulating single genes, but also to interrogate signaling pathways and other complex interaction networks.  These pathway analyses require both the use of relevant cellular models and methods that cause less perturbation to the cellular physiology.  Electroporation is increasingly being used as an effective way to introduce siRNA and other nucleic acids into difficult to transfect cell lines and primary cells without altering the signaling pathway under investigation. There are multiple critical steps to a successful siRNA experiment, and there are ways to simplify the work while improving the data quality at several experimental stages.  To help you get started with your siRNA mediated gene knockdown project, we will demonstrate how to perform a pathway study complete from collecting and counting the cells prior to electroporation through post transfection real-time PCR gene expression analysis.  The following study investigates the role of the transcriptional activator STAT6 in IL-4 dependent gene expression of CCL17 in a Burkitt lymphoma cell line (Namalwa).  The techniques demonstrated are useful for a wide range of siRNA-based experiments on both adherent and suspension cells.  We will also show how to streamline cell counting with the TC10 automated cell counter, how to electroporate multiple samples simultaneously using the MXcell electroporation system, and how to simultaneously assess RNA quality and quantity with the Experion automated electrophoresis system.

This procedure describes a quick and easy workflow to introduce siRNA into difficult to transfect cell lines and follow gene expression by real-time PCR. Use of an automated cell counter, multi-well electroporation plate, and automated electrophoresis station provide quick and reliable results without the need for expensive robotic handling.

Gen İfadesi Çalışmaları basitleştirin Otomatik Hücre Sayıcı kullanma: Namalwa Hücreler IL-4 Bağımlı Gen İfadesi siRNA demonte

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.
Telomerase is a specialized reverse transcriptase1 that adds short DNA repeats, called telomeres, to the 3' end of linear chromosomes2 that serve to protect them from end-to-end fusion and degradation. Following DNA replication, a short segment is lost at the end of the chromosome3 and without telomerase, cells continue dividing until eventually reaching their Hayflick Limit4. Additionally, telomerase is dormant in most somatic cells5 in adults, but is active in cancer cells6 where it promotes cell immortality7.
The minimal telomerase enzyme consists of two core components: the protein subunit (TERT), which comprises the catalytic subunit of the enzyme and an integral RNA component (TER), which contains the template TERT uses to synthesize telomeres8,9. Prior to 2008, only structures for individual telomerase domains had been solved10,11. A major breakthrough in this field came from the determination of the crystal structure of the active12, catalytic subunit of T. castaneum telomerase, TcTERT1.
Here, we present methods for producing large quantities of the active, soluble TcTERT for structural and biochemical studies, and the reconstitution of the telomerase RNP complex in vitro for telomerase activity assays. An overview of the experimental methods used is shown in Figure 1.

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.

Active T. in vitro Sulandırma castaneum Telomeraz

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

A Protocol for Phage Display and Affinity Selection Using Recombinant Protein Baits

Using recombinant phage as a scaffold to present various protein portions encoded by a directionally cloned cDNA library to immobilized bait molecules is an efficient means to discover interactions. The technique has largely been used to discover protein-protein interactions but the bait molecule to be challenged need not be restricted to proteins. The protocol presented here has been optimized to allow a modest number of baits to be screened in replicates to maximize the identification of independent clones presenting the same protein. This permits greater confidence that interacting proteins identified are legitimate interactors of the bait molecule. Monitoring the phage titer after each affinity selection round provides information on how the affinity selection is progressing as well as on the efficacy of negative controls. One means of titering the phage, and how and what to prepare in advance to allow this process to progress as efficiently as possible, is presented. Attributes of amplicons retrieved following isolation of independent plaque are highlighted that can be used to ascertain how well the affinity selection has progressed. Trouble shooting techniques to minimize false positives or to bypass persistently recovered phage are explained. Means of reducing viral contamination flare up are discussed.

Phage display is a powerful technique to capture proteins or protein moieties that interact with an immobilized molecule of interest. Once a decision of the type of phage cDNA library to create and screen has been made, the protocol described here permits efficient affinity selection leading to identification of interactors.

Rekombinant Protein Yemler Kullanarak Phage Ekran ve Affinity seçimi için Protokol

Using  recombinant phage as a scaffold to present various protein portions encoded by  a directionally cloned cDNA library to immobilized bait molecules ...

siRNA Screening to Identify Ubiquitin and Ubiquitin-like System Regulators of Biological Pathways in Cultured Mammalian Cells

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that regulates diverse biological pathways including the hypoxia response, proteostasis, the DNA damage response and transcription.&#160; To better understand how UBLs regulate pathways relevant to human disease, we have compiled a human siRNA &#8220;ubiquitome&#8221; library consisting of 1,186 siRNA duplex pools targeting all known and predicted components of UBL system pathways. This library can be screened against a range of cell lines expressing reporters of diverse biological pathways to determine which UBL components act as positive or negative regulators of the pathway in question.&#160; Here, we describe a protocol utilizing this library to identify ubiquitome-regulators of the HIF1A-mediated cellular response to hypoxia using a transcription-based luciferase reporter.&#160; An initial assay development stage is performed to establish suitable screening parameters of the cell line before performing the screen in three stages: primary, secondary and tertiary/deconvolution screening. &#160;The use of targeted over whole genome siRNA libraries is becoming increasingly popular as it offers the advantage of reporting only on members of the pathway with which the investigators are most interested.&#160; Despite inherent limitations of siRNA screening, in particular false-positives caused by siRNA off-target effects, the identification of genuine novel regulators of the pathways in question outweigh these shortcomings, which can be overcome by performing a series of carefully undertaken control experiments.

Here, we describe a methodology to perform a targeted siRNA &#8220;ubiquitome&#8221; screen to identify novel ubiquitin and ubiquitin-like regulators of the HIF1A-mediated cellular response to hypoxia.&#160; This can be adapted to any biological pathway where a robust read out of reporter activity is available.

Kültür Memeli Hücrelerde Biyolojik tanımında ubikitin ve Ubiquitin benzeri Sistemi Regülatörleri tanımak siRNA Eleme

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that ...

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial scientific task. Many disease causing genes in humans have a fly homologue, making Drosophila a good model to study signaling pathways involved in the development of different disorders. Additionally, the tractability of Drosophila simplifies genetic screens to aid in identifying novel therapeutic targets that may regulate metabolism. In order to perform such a screen a simple and fast method to identify changes in the metabolic state of flies is necessary. In general, carbon dioxide production is a good indicator of substrate oxidation and energy expenditure providing information about metabolic state. In this protocol we introduce a simple method to measure CO2 output from flies. This technique can potentially aid in the identification of genetic perturbations affecting metabolic rate.

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are among one of the most common diseases in humans. The genetically tractable model organism D. melanogaster can be used to identify novel genes that regulate metabolism. This paper describes a relatively simple method which allows studying the metabolic rate in flies by measuring their CO2 production.