Bu prosedür HIV enfeksiyonu dinamikleri çalışma için insanlaşmış immüneksik farelerin üç model açıklar. NSG insanlaşmış fareler insan bağışıklığının özelliklerini özetler. Bu durumda, pre-klinik ortamlarda kronik, akut ve yeniden hiv enfeksiyonu çalışma izin.
Hücre hazırlama prosedürünü gösteren Sandra Medina-Moreno, grubumuzdan bir laboratuvar araştırma danışmanı olacaktır. Bu işlemi gerçekleştirirken, steril önlükler, eldivenler, özel ayakkabılar, ayakkabı kılıfları, maske, gözlük, saç ve sakal kaputları ve steril laboratuvar önlüğü de dahil olmak üzere her zaman tek kullanımlık kişisel koruyucu ekipman kullanın. Kronik model için, sertifikalı bir biyogüvenlik kabinealtında% 10 FBS rpmi 1640 medya 10 mililitre bir milyon dondurulmuş CD34 + insan kök hücreleri resuspend ve steril koşulları korumak.
Bir hemositometrede Trypan Blue dışlama boyama ile hücre canlılığını saymak ve kontrol etmek için süspansiyon 10 mikrolitre kullanın. Daha sonra hücre süspansiyonuna 400 kez g'de oda sıcaklığında 15 dakika santrifüj edin. Supernatant atın ve gerekli konsantrasyonda soğuk 1X PBS hücreleri resuspend.
İğne yenene kadar hücreleri buzda tutun. Alıcı yavrular üzerinde diğer yabancı kokuları maskelemek için eller arasında temiz yatak ovmak. Sonra damızlık kafesten yatak malzemesi küçük bir miktar ile birlikte steril 100 milimetre kare Petri çanak içine yavru yerleştirin.
Petri kabını temiz bir taşıma kafesine koyun ve yavruları doğrudan ışık ve gürültüden korumak için kafesi bir Carboy taşıma kafesine yerleştirin. Işınlama odasına geçerken hayvanların çevreye maruz kalmasını önlemek için taşıma kafesini bir kapak pedi ile kapatın. Metin protokolünde açıklandığı gibi anesteziden sonra hepatik enjeksiyon ile engraftment için hazırlayın.
Fare kısıtlama süresini en aza indirmek için, bir araştırmacı kök hücre süspansiyon ile şırınga yük ve ikinci araştırmacı yavru tutun ve enjeksiyon yönetmek sağlar. CD34+insan kök hücre süspansiyonunun 50 mikrolitresini sertifikalı biyogüvenlik kabininin altına bağlı bir iğneyle şırıngaya yükleyin. Başparmak ve işaret parmakları ile yavru dizginlemek ve% 70 alkol ile enjeksiyon sitesi temizleyin.
Tamamen karaciğer delmek için değil, doğrudan karaciğer içine hücrelerin 50 mikrolitre teslim etmek için sığ bir iğne açısı kullanın. Yavruların aşırı ısınmamasını sağlamak için 20 santigrat derecede kemirgenler için kızılötesi ısıtma yastığı kullanarak yemeği Önceden ısıtın. Kurtarma sağlamak için bir ila beş dakika steril gazlı bez ile kaplı Petri çanak üzerinde yavru yerleştirin.
Yavruları ebeveynlerine geri vermeden hemen önce, yamyamlık tan kaçınmak veya yavruları reddetmek için başparmağı ve işaret parmaklarını her iki ebeveynin de banına kullanarak az miktarda mentol ve okaliptüs bazlı merhem uygulayın. Kuru cilt, hiçbir beslenme, döküntü, ya da alopesi gibi yavrularda greft karşı konak hastalığı herhangi bir belirti arıyor, her gün kafesleri kontrol edin. Yavruları üç haftalıkken wean ve farklı kafeslerde barındır.
14 haftalıkken kan sitometrisi ile periferik kanda engreftlemayı doğrulayın. İnsan CD45+hücre rekonstrüksiyonu ve CD4+ve CD8+T hücrelerinin yüzdesi için temsili bir gating stratejisi gösterilmiştir. Engraftment başarı oranı arasındadır 80%100 Akut model için sağlıklı bir donör den elde edilen insan periferik kan mononükleer hücreleri kullanın veya reaktivasyon modeli için antiretroviral tedavi altında olan bir HIV enfekte hasta.
50 mililitrelik konik bir tüpiçine steril yoğunluk gradyan orta beş mililitre tam kan Katman 15 mililitre. Buffy coat'un yoğunluk gradyan ortamıyla karışmasını önlemek için oda sıcaklığında 30 dakika boyunca 400 kez g'de santrifüj edin. Dikkatle yoğunluk gradyan orta ve supernatant arasındaki mononükleer hücrelerin fraksiyonu toplamak.
Buffy paltoyu 10 mililitre 1X PBS içeren 15 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 300 kez g santrifüj. Supernatant atın ve peletli hücrelere eklenen ACK lysis tampon beş mililitre ile lysing tarafından kalan kırmızı kan hücreleri çıkarın.
Oda sıcaklığında dört dakika kuluçkaya yat. Daha önce olduğu gibi tekrar santrifüj sonra, supernatant atın ve 1X PBS veya RPMI 1640 orta 10 mililitre resuspend. Hücreleri saymak ve bir hemositometrede Trypan Blue dışlama boyama tarafından canlılığını kontrol etmek için hücre süspansiyon 10 mikrolitre kullanın.
Tipik olarak, bir ila iki milyon hücre fazla% 95 canlılık ile kan her bir mililitre için elde edilir. Daha önce olduğu gibi santrifüj den sonra, supernatant atın ve gerekli konsantrasyoniçin hücre numarasını ayarlayın. 200 mikrolitre 1X PBS'de 3,5 milyon periferik kan mononükleer hücresini sertifikalı bir biyogüvenlik kabini altında iğne ile şırıngaya yükleyin.
Fareyi kafesten çıkarın ve arka arkaya hafif çekiş uygulayarak kafesi tutabilmesi için kuyruğundan tutun. Daha sonra işaret parmağını ve başparmağı, boynun gevşek derisini tutarak ve sırtını stabilize etmek için orta parmağı kullanarak hayvanın omuzlarına yerleştirin. Fare kafasını geriye doğru kaydırın, böylece sırtı başının üstünde olacak şekilde.
Bu, karın boşluğundaki visseranın geriye doğru yer değiştirmesine izin verir ve enjeksiyon sırasında iç organlarıdelme riskini azaltır. Enjeksiyon bölgesini %70 alkolle temizleyin. Hazırlanan şırınganın karın duvarından nüfuz edin ve hücrelere enjekte etmeden önce aspire edin.
Herhangi bir malzeme aspire edilirse, şırıngayı çıkarın ve atın. Aksi takdirde, şırıngayı çıkarıp atmadan önce hücreleri intraperitoneal kaviteye yavaşça enjekte edin. Hayvanı kafesine geri getirin ve enjeksiyondan üç hafta sonra akan sitometri ile periferik kandaki engreftlemi doğrulayın.
Fareleri kulak etiketleme ile tanımlayın. Bu deneylerde kullanılan fareleri klinik sıkıntı belirtileri için her işlemden sonra günde iki kez yakından gözlemleyin. Daha sonra metin protokolünde açıklandığı gibi HIV enjeksiyonuna devam edin.
HIV enjeksiyonu sonrasında, reaktivasyon modelinde benzer kinetik lere sahip kronik ve akut modellerde iki ila üç hafta sonrası enfeksiyon sonrası plazma viral yükünde hızlı bir artış saptanabilir. Viral yükteki artış CD4:CD8 oranındaki düşüşle çakışıyor. Bu değişiklikler kontrol farelerinde gözlenmez.
Dikkat, insanlaştırılmış PBMC NSG yetişkin fare modelinde, CD4:CD8 oranının ilk ters çevrilmesi gözlemlenir ve izleme süresi boyunca yeniden oluşturulmuştur. Antiretroviral tedavi HIV enfekte farelere uygulandığında, viral yük bir bastırma yanı sıra CD4:CD8 oranı kurtarma enfekte olmayan kontrollerde benzer seviyelere ulaşan beklendiği gibi oluştu. Tipik olarak, tedavinin iki ila üç hafta sonra, viral yük bir azalma ve CD4:CD8 oranında artış kronik gözlenir, akut, ve reaktivasyon modelleri.
Ölümcül aşırı doz veya nakledilen hücrelerin reddi önlemek için önerilen ışınlama dozu kullanın. Enjeksiyon sırasında karaciğeri tamamen delmeyin ve barajın yabancı olarak algıladığı kokuları maskelemek için yatak takımları kullanmayın. Bu üç model antiviral bileşiklerin test izin, anti-HIV antikorları veya viral çoğaltma etkileyen diğer biyolojik maddeler.
Ayrıca, HIV immünoterapi için adaptif transfer deneyleri sağlar. NSG insanlaşmış fareler kısmen veya tamamen insan hücreleri ile patojenler veya ilaçlara yanıt vermek için, insan bağışıklık sisteminin karmaşıklığını taklit yeniden oluşturulabilir. NSG insanlaşmış fareler hem murine hem de insan patojenleri ile enfekte olabileceğinden, özellikle HIV virüsü manipülasyonu kullanan bu durumda, tüm temel biyolojik önlemlerin kesinlikle izlenmesi gerekir.
