Bragonzi laboratuarında Araştırma İtalyan Kistik Fibrozis Vakfı (CFaCore) ve AB-F7-2009-223670 tarafından finanse edilmiştir. Bu çalışmanın bir parçası alembic, gelişmiş mikroskobu laboratuvarında gerçekleştirildi ve fare histopatoloji Patolojik Anatomi (San Raffaele Bilimsel Enstitüsü) Ünitesinde yapıldı.

1.. Kronik Enfeksiyon için hazırlık Bakteriler (önceki Fare Mücadelesi Üç ve İki Gün) <ol><li> Uygun P ismi seçin aeruginosa ırk test edilmesi. </li><li> P. loopful inoküle Bir Trypticase Soy Agar (TSA) plakaya bir -80 ° C stok kültüründen aeruginosa ve gece boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> Tek bir koloni almak ve bir 15 ml ek-kapaklı bir tüp içinde 5 ml Trypticase Soy Broth (TSB) içine inoküle ve 200 rpm&#39;de bir çalkalama inkübatör içinde gece boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li></ol> 2. Kronik Enfeksiyon Agar Boncuk Bakteriler katıştırma (önceki Enfeksiyon One Day) <ol><li> , Bakteri kültürü gece boyunca küçük bir kısım al fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) içinde 1:50 seyreltilmiş ve 600 nm&#39;de optik yoğunluk (OD) ölçün. </li><li> Taze TSB 20 ml içeren, yeni bir çırpıda-kapaklı tüp içinde 2 OD ekleyerek gecede bakteri kültürü sulandırmak. </li><li> Yaklaşık 3 boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edin -10-15 OD toplam ulaşana kadar, 200 rpm&#39;de bir çalkalama inkübatöründe log fazına kadar 4 saat. </li><li> Bu arada,% 1.5 ağar, otoklav ve bir su banyosu içinde 50 ° C&#39;de dengeye ile TSB yapılmış TSA hazırlamak. Bir su banyosu içinde 50 ° C&#39;de bir Erlenmeyer şişesi içinde preautoclaved ağır mineral yağ 150 ml dengelenmesi. </li><li> Bir kez P. aeruginosa, 4 ° C&#39;de 15 dakika boyunca 2700 x g&#39;de santrifüj ile bakteriyel hücreleri toplamak ve supernatant atmak log fazına ulaşır. </li><li> Iyice tamamen pelet tekrar süspansiyon için 1 ml steril PBS ve vorteks de bakteriyel pelet yeniden süspanse edin. </li><li> Sıvı TSA 9 ml, 50 ° C&#39;de önceden dengelendi ile karıştırın 1 ml bakteri süspansiyonu </li><li> 10 ml-TSA P. ekleme hemen aeruginosa (50 ° C&#39;de önceden ısıtılmış), ağır mineral yağ elde karışımı oda sıcaklığında 6 dakika boyunca karıştırın. Ajitasyon yağ içinde görünür bir girdap üretmelidir. </li><li> En az sp karıştırıldıktan sonra, 4 ° C&#39;ye soğutun35 dakika (Şekil 1) için Bayram. </li><li> Ilave bir 20 dakika boyunca buz içinde agar-boncuk-yağ karışımı bekletin. </li><li> 4 ° C&#39;de 15 dakika boyunca 2700 x g&#39;de 50 ml Falcon tüpleri ve santrifüj içine agar-boncuk Transferi </li><li> Doğru mineral yağı çıkarmak ve aşama 2.11 &#39;de tarif edildiği gibi, steril PBS ile altı kez yıkayın. Üç yıkamadan sonra, boncuklar yerine santrifüj kullanılarak yer çekimi ile tane haline edilebilir. Son yıkamadan sonra, 20-30 ml PBS içinde tekrar süspansiyon agar-boncuklar. </li><li> Boncuklar (yaklaşık 0.5 mi) bir kısım alın ve aseptik homojenleştirin. </li><li> Homojenize boncuk 100 ul alın ve steril PBS içinde 900 ul seyreltik. Seri 10 -6 aşağı 01:10 sulandırmak. </li><li> -6 Aşağı 10 ve 37 ° C de inkübe etmek plakaları seyreltilmemiş örnek de dahil olmak üzere TSA plakaları üzerine Plate seri seyreltme, </li><li> Çeşitli alanlarda bir ters ışık mikroskobu kullanarak boncuk çapını ölçün. Bir kordon çapı (100-200 um arasında olmalıdır <strong&gt; Şekil 1). </li><li> 4 ° C de bir gece boncuk saklayın </li></ol><img alt="Şekil 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/51019/51019fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51019/51019fig1.jpg" width="500px" /> Şekil 1. Agar boncuk hazırlama ve fare enfeksiyon bakış. P. aeruginosa hücreler PBS içinde 1 ml yeniden süspansiyon haline getirilmiş ve sıvı TSA (50 ° C) 9 ml eklenir. Bu karışım, bir şişe içinde 50 ° C de, 150 ml, ağır mineral yağ ilave edildi ve oda sıcaklığında 6 dakika boyunca yüksek hızda karıştırılır. Şişe 35 dakika boyunca yavaş bir karıştırma ile 4 ° C&#39;ye soğutulur, agar boncuk oluşturma katılaşarak ve bu karışım içinde mevcut bakteri agar boncuklar içine gömülürler. Bakteriyel hücreler ihtiva eden bir agar kordonun Detay (A) gösterilmektedir. Steril PBS ile birkaç yıkama ile mineral yağı ayrılmasından sonra, agar-boncuk süspansiyonu f hazırya da soluk borusuna enjeksiyon (B) farelerin akciğerlerinde aşılama. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51019/51019fig1highres.jpg" target="_blank">resmi büyütmek için buraya tıklayın</a> . 3. Agar-boncuk olan fareler meydan Etik Beyanı: Bu protokol ve deney San Raffaele Bilimsel Enstitüsü hayvan bakımı ve etik komitesinin yönergeleri izleyin. <ol><li> Agar-boncuk süspansiyon CFU / ml sayısını belirlemek için TSA plakaları üzerine koloni oluşturan birim sayısı (CFU) sayısı. 50 ul 1-2 x 10 6 optimal inokülümü elde etmek için 2-4 x 10 7 CFU / ml steril PBS ile agar-boncuk seyreltin. </li><li> C57Bl/6NCr (6-8 haftalık, 20-22 g) ile 0.002 ml / g vücut ağırlığı hacminde tatbik% 0.9 NaCI içinde ketamin (50 mg / ml) ve ksilazin (5 mg / ml) ile birlikte erkek farenin anestezisi intraperitoneal enjeksiyonu. Not: Anestezi adeq düşünülmektedirUATE hayvan sessizce hala kaldığında, dış uyaranlara yanıt vermeyen ve sürekli kalp ve solunum oranları vardır. </li><li> Yatar pozisyonda fare yerleştirin. % 70 etanol ile fare kat dezenfekte edin. </li><li> Cilt dikey kesim tarafından trakea Açığa ve trakea içine aşağı hareket ederken stylette kaldırmak dikkat tutarak, steril, esnek 22 G 0,9 mm x 25 mm IV kateter ile trakea entübe. Değil çok derin trakea içine kateter yerleştirin. Karina (çatallanma) ulaşmadan önce durdurun. </li><li> Derhal bir 1 ml şırınga ile agar boncuk süspansiyonu, 50 ul bir hacmi almak ve katetere ekleyin. Yavaşça boncuklar akciğer içine implante izin vererek, şırınga pistonu itin. Dikiş klipleri kullanarak kesi kapatın. </li><li> Tamamen uyanık kadar bir ısıtma pedi üzerinde hayvan yerleştirin. </li></ol> 4. Fareler Değerlendirme <ol><li> Ceket kalitesi, duruş dahil klinik belirtileri için günlük fareler gözlemlemek,ambulasyon ve hidrasyon durumu. Günlük vücut ağırlığı izleyin. ≥% 20 vücut kilo Fareler ötenazi edilmelidir. </li><li> Bronkoalveoler lavaj (BAL) ile akciğer toplanması ve toplam CFU analizinde, histolojik analiz, BAL, sitokin analizleri için toplam ve diferansiyel hücrelerin sayısı açısından iltihap tepkisi ve için İlgi 6 ya da 7 toplanması için Noktası 5 izleyin miyeloperoksidaz (MPO) etkinliği. </li></ol> 5. BAL Sıvı Toplama ve Analizi <ol><li> CO 2 inhalasyon yoluyla fareler Euthanize. </li><li> Yatar pozisyonda fare yerleştirin. % 70 etanol ile fare kat dezenfekte edin. </li><li> Cilt dikey kesik ile trakea ve göğüs kafesi Açığa. Diyafram keserek akciğerleri Açığa. </li><li> Cımbız kullanarak trakea altında bir dikiş ipliği takın ve bir steril, esnek 22 g 0,9 mm x 25 mm IV kateter ile trakea entübe. Ca bağlamak için dikiş ipliğinin her iki ucu çekintrakea için theter ve trakea etrafında iplik düğüm. </li><li> Bir 1 ml şırınga ile RPMI 1640 içinde 1 ml&#39;lik bir hacim alın ve katetere ekleyin. Akciğer yıkama ve hemen sıvı geri, bir 15 ml tüp içinde depolamak için, enjektörün pistonu itin. NOT: sitokinler analiz edilecek ise, RPMI 1640 proteaz inhibitörleri ekleyin. </li><li> RPMI 3 ml bir toplam Bu adımı üç kez tekrarlayın. Şu andan itibaren, buz üzerinde BAL sıvısı saklayın. Akciğerlerin toplama ve analiz için 6. adıma gidin. NOT: tüm sıvı (2.8 ml maksimum) alınacağını unutmayın. </li><li> BAL sıvısında bulunan bakteri miktarının için, küçük bir kısım (300 ul) örnek, seri TSA plakaları üzerinde, steril PBS içinde plaka 1:10 seyreltin ve gece boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> Bir Bürker hücre sayısı odası içinde Tuerk çözeltisi ile BAL sıvısı 1:02 arasında bir kısım seyreltilmesi ters bir ışık optik mikroskop kullanılarak toplam hücre sayımı. </li><li> R santrifüj4 ° C &#39;de 8 dakika boyunca 330 x g BAL sıvısı emaining -80 ° C&#39;de depolamadan, ELISA sitokin analizi için üstteki sıvı kısmı alınır Sitospin tarafından diferansiyel hücre sayımı için adımları 5,10-5,13 izleyin. </li><li> Pelet kırmızı ise, RBC liziz tamponu 250-300 ul içinde topağın tekrar askıda eritrositler 3 dakika için ultra-saf damıtılmış su içinde 1:10 seyreltilir lize edildi. 4 ° C &#39;de 8 dakika boyunca 330 x g, 2 ml PBS ve santrifüj ile nötralize </li><li> Süpernatant atılır ve RPMI,% 10 cenin sığır serumu (FBS) içinde pelletini. Toplam hücre sayısı göre 1 x 10 6 hücre / ml &#39;sağlayacak bir ses kullanın. </li><li> Sitospin merkezine bakan karton filtreler ile Sitospin uygun yuvalara mikroskop slaytlar ve filtreleri yerleştirin. 5 dakika boyunca 300 x g&#39;de bir sitosantrifüj olarak Sitospin ve santrifüj uygun kuyulara her bir numune 150 ul Pipet. </li><li> Ma göre, Romanowsky bir ticari kit kullanılarak boyanarak slaytlar Lekenufacturer talimatları ve daha önce 12 açıklandığı gibi. Adımları MPO aktivite analizi için 5,14-5,17 izleyin. </li><li> 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 380 x g &#39;de BAL kalan hacmi santrifüj Süpernatant atılır ve hücreleri lize etmek için ultra-saf damıtılmış su içinde heksadesiltrimetilamonyum klorür,% 0.5 250 ul pelletini. Süspansiyon deneyi gerçekleştirmeden önce birkaç gün -20 ° C de dondurulabilir. </li><li> 30 ° C&#39;de 4 dakika ve numunenin aynı zamanda uygun seyreltmeleri, iyi ve eğer gerekli her iki kez örneği ekleyerek, 96 oyuklu plakalar içinde MPO deneyi gerçekleştirmek için süpernatan kullanım için 16,000 x g&#39;de santrifüjleyin. </li><li> Kuyularda her bir örneğe ekle 3,3 eşit hacimde &#39;, 5,5&#39; da peroksidaz için bir alt-tabaka olarak-tetrametilbenzidin (TMB). Renginde bir gelişme söz kadar reaksiyon, en az 5 dakika süreyle karanlıkta yer alan ve izin verin. </li><li> 2 MH 2 SO 4 ilave ederek reaksiyonu durdurunnd 450 nm&#39;de OD&#39;yi ölçün. OD değeri peroksidaz aktivitesi ile doğrudan orantılı olacaktır. </li></ol> 6. Akciğer ve Sitokin Analizi Bakteriyel Yük Ölçümü <ol><li> Hemen BAL sıvı toplandıktan sonra, fare tüketim akciğerler, steril PBS ayrı lobları yıkayın steril 2 ml PBS ile bir yuvarlak alt tüp koyun ve buz üzerinde saklayın. NOT: sitokinler analiz edilecek ise, tüplere PBS proteaz inhibitörleri ekleyin. </li><li> Aseptik akciğer homojenleştirmek, homojenattan küçük bir kısım (300 ul) almak, seri TSA plakaları üzerinde, plaka PBS içinde 1:10 seyreltilmiş ve bir gece boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edin. Toplam hava yolu bakteriyel yük BAL sıvısı ve akciğer bulunan CFU toplamı olacaktır unutmayın. </li><li> 4 ° C&#39;de 30 dakika boyunca 16,000 xg&#39;de kalan Homojenat santrifüj -80 ° C de ELISA sitokin analizi için supernatant ve mağaza almak </li></ol> 7. Histolojik Sınav &lt;ol&gt; <li> Akciğer yönü ve özelliklerini korumak için, sadece BAL sıvısı tahsil edilmemiştir hangi akciğerler üzerinde histolojik analizi yapın. </li><li> CO 2 inhalasyon yoluyla fare Euthanize. </li><li> Cilt dikey kesik ile göğüs kafesi Açığa, diyafram keserek akciğerlerin ortaya çıkartılması. </li><li> Tüketim akciğerler, PBS içinde yıkayın lobları ayrı, ışıksız bir ortamda 4 ° C &#39;de 5-10 ml% 10 luk nötral tamponlu formalin (% 4 formaldehid) ve deposu içeren bir tüpe koydu. </li><li> Standart prosedürler kullanılarak parafin gömmek akciğerler. </li><li> Mikrotom ile 5 mikron kalınlığında kesitler kesti. </li><li> Hematoksilin ve eozin ile ve Leke slaytlar, standart prosedürlere göre, bir lamel ile slaytlar kapsamaktadır. </li><li> Ters bir aydınlık mikroskop kullanarak slaytları inceleyin ve bir kameraya mikroskop bağlayarak görüntü kazanır. </li></ol>

<ol>
	<li>Gibson, R., Burns, J. L., Ramsey, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathophysiology+and+management+of+pulmonary+infections+in+cystic+fibrosis.">Pathophysiology and management of pulmonary infections in cystic fibrosis.</a> Am. J. Respir. Crit. Care. 168, 918-951 (2003).</li><li>Bragonzi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+models+of+acute+and+chronic+lung+infection+with+cystic+fibrosis+pathogens.">Murine models of acute and chronic lung infection with cystic fibrosis pathogens.</a> IJMM. 300, 584-593 (2010).</li><li>Cash, H. A., McCullough, B., Johanson, W. G., Bass, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rat+model+of+chronic+respiratory+infection+with+Pseudomonas+aeruginosa.">A rat model of chronic respiratory infection with Pseudomonas aeruginosa.</a> Am. Rev. Respir. Dis. 119, 453-459 (1979).</li><li>Starke, J. R., Langston, C., Baker, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mouse+model+of+chronic+pulmonary+infection+with+Pseudomonas+aeruginosa+and+Pseudomonas+cepacia.">A mouse model of chronic pulmonary infection with Pseudomonas aeruginosa and Pseudomonas cepacia.</a> Pediatr. Res. 22, 698-702 (1987).</li><li>Pedersen, S. S., Hansen, B. L., Hansen, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+experimental+chronic+Pseudomonas+aeruginosa+lung+infection+with+P.+aeruginosa+entrapped+in+alginate+microspheres.">Induction of experimental chronic Pseudomonas aeruginosa lung infection with P. aeruginosa entrapped in alginate microspheres.</a> APMIS. 98, 203-211 (1990).</li><li>Bragonzi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonmucoid+Pseudomonas+aeruginosa+expresses+alginate+in+the+lungs+of+patients+with+cystic+fibrosis+and+in+a+mouse+model.">Nonmucoid Pseudomonas aeruginosa expresses alginate in the lungs of patients with cystic fibrosis and in a mouse model.</a> J. Infect. Dis. 192, 410-419 (2005).</li><li>van Heeckeren, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+models+of+chronic+Pseudomonas+aeruginosa+lung+infection.">Murine models of chronic Pseudomonas aeruginosa lung infection.</a> Lab. Anim. 36, 291-312 (2002).</li><li>Bragonzi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa+microevolution+during+cystic+fibrosis+lung+infection+establishes+clones+with+adapted+virulence+AJRCCM.">Pseudomonas aeruginosa microevolution during cystic fibrosis lung infection establishes clones with adapted virulence AJRCCM.</a> 180, 138-145 (2009).</li><li>Kukavica-Ibrulj, I., Facchini, M., Cigana, C., Levesque, R. C., Bragonzi, A., Filloux, S., Ramos, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+Pseudomonas+aeruginosa+virulence+and+the+host+response+using+murine+models+of+acute+and+chronic+lung+infection.">Assessing Pseudomonas aeruginosa virulence and the host response using murine models of acute and chronic lung infection.</a> Methods in Pseudomonas aeruginosa: Humana Press. , (2014).</li><li>Moalli, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Therapeutic+Potential+of+the+Humoral+Pattern+Recognition+Molecule+PTX3+in+Chronic+Lung+Infection+Caused+by+Pseudomonas+aeruginosa.">The Therapeutic Potential of the Humoral Pattern Recognition Molecule PTX3 in Chronic Lung Infection Caused by Pseudomonas aeruginosa.</a> J. Immunol. 186, 5425-5534 .</li><li>Paroni, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Response+of+CFTR-deficient+mice+to+long-term+Pseudomonas+aeruginosa+chronic+infection+and+PTX3+therapeutic+treatment.">Response of CFTR-deficient mice to long-term Pseudomonas aeruginosa chronic infection and PTX3 therapeutic treatment.</a> J. Infect. Dis. In press, .</li><li>Maxeiner, J., Karwot, R., Hausding, M., Sauer, K. A., Scholtes, P., Finotto, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+to+enable+the+investigation+of+murine+bronchial+immune+cells,+their+cytokines+and+mediators.">A method to enable the investigation of murine bronchial immune cells, their cytokines and mediators.</a> Nat. Protoc. 2, 105-112 (2007).</li><li>Bragonzi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa+microevolution+during+cystic+fibrosis+lung+infection+establishes+clones+with+adapted+virulence..">Pseudomonas aeruginosa microevolution during cystic fibrosis lung infection establishes clones with adapted virulence..</a> AJRCCM. In press, (2009).</li><li>Pirone, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Burkholderia+cenocepacia+strains+isolated+from+cystic+fibrosis+patients+are+apparently+more+invasive+and+more+virulent+than+rhizosphere+strains.">Burkholderia cenocepacia strains isolated from cystic fibrosis patients are apparently more invasive and more virulent than rhizosphere strains.</a> Environ. Microbiol. 10, 2773-2784 (2008).</li><li>Bragonzi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+co-infection+of+the+cystic+fibrosis+lung+by+Pseudomonas+aeruginosa+and+Burkholderia+cenocepacia+reveals+influences+on+biofilm+formation+and+host+response.">Modelling co-infection of the cystic fibrosis lung by Pseudomonas aeruginosa and Burkholderia cenocepacia reveals influences on biofilm formation and host response.</a> PLoS One. 7, .</li><li>Bianconi, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Positive+signature-tagged+mutagenesis+in+Pseudomonas+aeruginosa:+tracking+patho-adaptive+mutations+promoting+long-term+airways+chronic+infection.">Positive signature-tagged mutagenesis in Pseudomonas aeruginosa: tracking patho-adaptive mutations promoting long-term airways chronic infection.</a> PLoS Pathog.. 7, (2011).</li></ol>

Yazarlar, hiçbir rakip mali çıkarlarını olmadığını beyan ederim.

P. kritik adımlar aeruginosa-boncuk hazırlama ve fare meydan aşağıda rapor edilmiştir. Farenin meydan okuma için kullanılan P. aeruginosa ırk kritiktir. Mortalite, kronik enfeksiyon veya açıklık meydan okuma için kullanılan bakteri suşuna bağlı olarak önemli ölçüde farklılık gösterebilir. P. Bu nispeten daha düşük mortalite, daha ağır lezyonlar, ve daha yüksek kronik enfeksiyona neden beri aeruginosa RP73 klinik suşu...

Kistik fibrozis (CF) kistik fibrozis transmembran iletkenlik regülatör (CFTR) gen mutasyonlarının neden olduğu genetik bir hastalıktır. Bu gen, en epitel hücrelerinin membranı üzerinde ifade edilen bir klorür kanal için kodlar. Bronşektazi, mukus tıkacı ve parankimal yıkım giderek ciddi akciğer hastalığı ve CF hastaların 1 çoğunda mortaliteye neden Pseudomonas aeruginosa enfeksiyonlar çoğunlukla neden oldu. Anlama CF patogenez ve yeni tedavilerin daha da geliştirilmesi CF karakteristik özellikleri ile hayvan modelinde güveniyor. Genetik CFTR geni değiştirilmiş çeşitli fareler, üretildi, ancak CF gibi akciğer hastalığı ve KF hastalarında görülen birçok diğer organ anormallikleri özetlemek için bu türlerin yeteneği sınırlamalar yaygın olarak 2 belgelenmiştir. Enfeksiyon gelişimi CF hayvan modelinde önemli sorunlardan biridir. Edebiyat clErken fareler, ağar, agaroz, alginat ya da yosun 3-5 gibi bir hareketsiz kılma maddesini içine gömülü bakteri ile aşılanır yalnızca bir aydan fazla süren bir kronik enfeksiyon elde edilebileceğini göstermektedir. Bu hareketsizleştirici maddeler, bakteriler Benzer CF hastalarında 6&#39;nın mukus büyümesine, mikrokoloniler şeklinde büyümeye izin mikroaerobik / anaerobik şartları sağlar. Kronik enfeksiyon Bu model hava yolu enflamasyonu ve hasara neden 7 akciğerlerde bakterilerin sürekli olmasına yol açmaktadır. Ancak, kullanılan yöntem, bakteri suşu ve akciğer aşılandı dozuna bağlı olarak, farklı zaman noktalarında akciğerlerde geri kronik enfekte edilmiş farelerin yüzdesi ve bakteri yükü önemli ölçüde farklı olabilir. Özellikle, uzun süreli kronik enfeksiyon için ana zorluk P. tarafından düşük bakteriyel yük olmaya devam aeruginosa ve mücadeleden sonra enfekte olmuş fareler hafta düşük yüzdesi belirten that bakteri hücreleri giderek ev sahibi tarafından temizlenir. P. seçerek CF bir koleksiyon aeruginosa RP73 klinik suş başarıyla C57Bl/6NCrl farelerde bir ay için istikrarlı bir bakteri yüküne kadar düşük mortalite, daha ağır lezyonlar, ve kronik enfeksiyon yüksek oranda elde 8 ayırır. Bu kağıt P. gömmek için metodoloji detayları Agar boncuk aeruginosa, biz, trakea içine aşılanmasıyla fareleri enfekte akciğerlerde bakteri yükü ve sitokinler ölçülen, BAL sıvısı toplanır ve histolojik muayene gerçekleştirdik. Genel olarak, bu protokol patogenez 8,9 tarihinde temelde önemli soruları ele P. karşı yeni tedaviler test araştırmacılarına yardımcı olacaktır aeruginosa kronik enfeksiyon 10,11.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="605">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Bacto Tryptic Soy Broth</td>
			<td style="width:191px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:143px;">211823</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Difco Agar, granulated</td>
			<td style="width:191px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:143px;">214510</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Heavy mineral oil</td>
			<td style="width:191px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:143px;">330760-1L</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">S-(+)-Ketamine hydrochloride</td>
			<td style="width:191px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:143px;">K1884</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Xylazine hydrochloride</td>
			<td style="width:191px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:143px;">X1251</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:272px;">1 ml syringe 25 G 5/8&#39;&#39;&#160;0.5 x 16 mm</td>
			<td style="width:191px;">PIC</td>
			<td style="width:143px;">3071250300350</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:272px;">Catheter 22GA 0.9 x 25 mm</td>
			<td style="width:191px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:143px;">381223</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:272px;">Graefe Forceps - 0.5 mm Tips Curved</td>
			<td style="width:191px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:143px;">11152-10</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:272px;">Scissors, Iris, 11 cm, straight</td>
			<td style="width:191px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:143px;">501758</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Suture clips</td>
			<td style="width:191px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:143px;">12040-01</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Suture thread</td>
			<td style="width:191px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:143px;">18020-40</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">RPMI 1640</td>
			<td style="width:191px;">Lonza</td>
			<td style="width:143px;">BE12-167F</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Complete protease inhibitor cocktail</td>
			<td style="width:191px;">Roche</td>
			<td style="width:143px;">11836145001</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:272px;">Fast-Read 102 Burker disposable chamber</td>
			<td style="width:191px;">Biosigma</td>
			<td style="width:143px;">390497</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Tuerk solution</td>
			<td style="width:191px;">Fluka</td>
			<td style="width:143px;">93770</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">RBC lysis buffer</td>
			<td style="width:191px;">Biolegend</td>
			<td style="width:143px;">420301</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:191px;">Lonza</td>
			<td style="width:143px;">DE14-801F</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">EZ cytofunnel</td>
			<td style="width:191px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:143px;">A78710021</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:272px;">Superfrost ultra plus microscope slides</td>
			<td style="width:191px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:143px;">J3800AMNZ</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Diff-Quik Romanowsky staining set</td>
			<td style="width:191px;">Medion Diagnostics</td>
			<td style="width:143px;">130832</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:272px;">Hexadecyltrimethylammonium chloride</td>
			<td style="width:191px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:143px;">52366-10G</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">96-well EIA/RIA plate</td>
			<td style="width:191px;">Costar</td>
			<td style="width:143px;">3590</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">3,3&#8217;,5,5&#8217;- tetramethylbenzidine</td>
			<td style="width:191px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:143px;">T8665-1L</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Sulfuric acid</td>
			<td style="width:191px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:143px;">320501-1L</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">10% neutral buffered formalin</td>
			<td style="width:191px;">Bio-optica</td>
			<td style="width:143px;">05-01005Q</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Harris haematoxylin non Papanicolau</td>
			<td style="width:191px;">Bio-optica</td>
			<td style="width:143px;">05-M06004</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:272px;">Eosin plus alcoholic solution</td>
			<td style="width:191px;">Bio-optica</td>
			<td style="width:143px;">05-M11007</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
<td>[header]</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Shaking incubator</td>
			<td style="width:191px;">Amerex Instruments</td>
			<td style="width:143px;">Steady Shake 757</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Water bath</td>
			<td style="width:191px;">Grant</td>
			<td style="width:143px;">SUB14</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Homogenizer</td>
			<td style="width:191px;">Ystral</td>
			<td style="width:143px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Precision balance</td>
			<td style="width:191px;">KERN</td>
			<td style="width:143px;">440-47N</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Cytocentrifuge</td>
			<td style="width:191px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:143px;">A78300003</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Low Cost Heating Pad</td>
			<td style="width:191px;">2biol</td>
			<td style="width:143px;">LCHP</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="42" rowspan="2" style="height:42px;width:272px;">Homogenization probe</td>
			<td rowspan="2" style="width:191px;">Ystral</td>
			<td style="width:143px;">2366931(great)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:143px;">2366925(small)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Inverted optical microscope</td>
			<td style="width:191px;">Zeiss</td>
			<td style="width:143px;">Axioplan2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Camera (microscope)</td>
			<td style="width:191px;">Zeiss</td>
			<td style="width:143px;">Axiocam MRc5</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:272px;">Rotary microtome</td>
			<td style="width:191px;">Leica</td>
			<td style="width:143px;">RM2255</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

long term chronic pseudomonas aeruginosa airway infection in mice

Modelin kendisi ile ilgili endişeleri bir dizi olmasına rağmen, kronik solunum yolu enfeksiyonu fare modeli, kistik fibrozis (CF) araştırma önemli bir varlıktır. Yalnızca çok az sayıda rapor in vivo olarak uzun vadeli kronik enfeksiyon odaklı iken inflamasyon ve enfeksiyonun erken aşamaları yaygın olarak Pseudomonas aeruginosa agar-boncuk fare modeli kullanarak çalışılmıştır. Uzun süreli kronik enfeksiyon için temel zorluk P. tarafından düşük bakteriyel yük olmaya devam aeruginosa ve bakteri hücreleri giderek ev sahibi tarafından temizlenir belirten mücadeleden sonra enfekte olmuş fareler hafta düşük yüzdesi. Bu çalışma, farede etkili, uzun vadeli kronik enfeksiyon elde etmek için bir yöntem sunmaktadır. Bu yöntem, P. katıştırma dayanır C57Bl/6NCrl farelerde trakea içi damlatma ardından in vitro agar-tanelerinde aeruginosa klinik suşları. Bilateral akciğer enfeksiyonu sev ile ilişkilikilo kaybı, ölüm, kronik enfeksiyon ve inflamatuar yanıt dahil eral ölçülebilir okuma-çıkışları. P. Bu nispeten daha düşük mortalite, daha ağır lezyonlar, ve daha yüksek kronik enfeksiyona neden beri aeruginosa RP73 klinik suşu PAO1 referans laboratuvar suşu tercih edildi. P. aeruginosa kolonizasyonu üç aydan fazla akciğer devam edebilir. Murin akciğer patolojisi ilerlemiş kronik akciğer hastalığı olan hastalarda CF benzediği. Bu fare modeli en yakın insan hastalığın seyrini taklit eden ve patojenez çalışmalarında ve yeni tedavilerin değerlendirilmesi için de kullanılabilir.

Protokol P., doğru yapıldığında aeruginosa agar-boncuk 100-200 arasında mikron ölçmek ve bir slayt üzerinde agar-boncuk süspansiyon küçük bir hacim pipetleyerek bir ters ışık mikroskobu ile görülebilir. Şekil 1 &#39;de ayrıntılı olarak gösterildiği gibi tek bakteri hücreleri, agar boncuk olarak görebilir. P. seçimi agar-boncuk hazırlanmasında kullanılan aeruginosa ırk kritiktir. Şekil 2 ve <...

Watch this Scientific Journal Video about Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice at JoVE.com

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

Bu fare modelinde kalıcı, uzun vadeli kronik Pseudomonas aeruginosa enfeksiyonu kurmak için agar-boncuklar bir yöntem tarif eder.

Uzun Vadeli Kronik<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</emFarelerde&gt; Havayolu Enfeksiyon

A mouse model of chronic airway infection is a key asset in cystic fibrosis (CF) research, although there are a number of concerns regarding the model ...

long-term-chronic-pseudomonas-aeruginosa-airway-infection-in-mice

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

22.4K Görüntüleme.  San Raffaele Scientific Institute.  Bu fare modelinde kalıcı, uzun vadeli kronik Pseudomonas aeruginosa enfeksiyonu kurmak için agar-boncuklar bir yöntem tarif eder. 

Video: Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

Bacterial biofilms have been associated with a number of different human diseases, but biofilm development has generally been studied on non-living surfaces. In this paper, we describe protocols for forming Pseudomonas aeruginosa biofilms on human airway epithelial cells (CFBE cells) grown in culture. In the first method (termed the Static Co-culture Biofilm Model), P. aeruginosa is incubated with CFBE cells grown as confluent monolayers on standard tissue culture plates. Although the bacterium is quite toxic to epithelial cells, the addition of arginine delays the destruction of the monolayer long enough for biofilms to form on the CFBE cells. The second method (termed the Flow Cell Co-culture Biofilm Model), involves adaptation of a biofilm flow cell apparatus, which is often used in biofilm research, to accommodate a glass coverslip supporting a confluent monolayer of CFBE cells. This monolayer is inoculated with P. aeruginosa and a peristaltic pump then flows fresh medium across the cells. In both systems, bacterial biofilms form within 6-8 hours after inoculation. Visualization of the biofilm is enhanced by the use of P. aeruginosa strains constitutively expressing green fluorescent protein (GFP). The Static and Flow Cell Co-culture Biofilm assays are model systems for early P. aeruginosa infection of the Cystic Fibrosis (CF) lung, and these techniques allow different aspects of P. aeruginosa biofilm formation and virulence to be studied, including biofilm cytotoxicity, measurement of biofilm CFU, and staining and visualizing the biofilm.

Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

This paper describes different methods of growing Pseudomonas aeruginosa biofilms on cultured human airway epithelial cells. These protocols can be adapted to study different aspects of biofilm formation, including visualization of the biofilm, staining of the biofilm, measuring the colony forming units (CFU) of the biofilm, and studying biofilm cytotoxicity.

Co-kültür Modelleri Pseudomonas aeruginosa</emCanlı İnsan Havayolu Hücreler Yetiştirilen> Biyofilmler

Bacterial biofilms have been associated with a number of different human diseases, but biofilm development has generally been studied on non-living ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

Many microbial cells have the ability to form sessile microbial communities defined as biofilms that have altered physiological and pathological properties compared to free living microorganisms. Biofilms in nature are often difficult to investigate and reside under poorly defined conditions1. Using a transparent substratum it is possible to device a system where simple biofilms can be examined in a non-destructive way in real-time: here we demonstrate the assembly and operation of a flow cell model system, for in vitro 3D studies of microbial biofilms generating high reproducibility under well-defined conditions2,3.
The system consists of a flow cell that serves as growth chamber for the biofilm. The flow cell is supplied with nutrients and oxygen from a medium flask via a peristaltic pump and spent medium is collected in a waste container. This construction of the flow system allows a continuous supply of nutrients and administration of e.g. antibiotics with minimal disturbance of the cells grown in the flow chamber. Moreover, the flow conditions within the flow cell allow studies of biofilm exposed to shear stress. A bubble trapping device confines air bubbles from the tubing which otherwise could disrupt the biofilm structure in the flow cell.
The flow cell system is compatible with Confocal Laser Scanning Microscopy (CLSM) and can thereby provide highly detailed 3D information about developing microbial biofilms. Cells in the biofilm can be labeled with fluorescent probes or proteins compatible with CLSM analysis. This enables online visualization and allows investigation of niches in the developing biofilm. Microbial interrelationship, investigation of antimicrobial agents or the expression of specific genes, are of the many experimental setups that can be investigated in the flow cell system.

Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

Protocol describing the application of a flow cell system for growing and analyzing microbial biofilms for Confocal Laser Scanning Microscopy (CLSM).

Pseudomonas aeruginosa ve Saccharomyces cerevisiae Biyofilm Akış Hücreler

Many microbial cells have the ability to form sessile microbial communities defined as biofilms that have altered physiological and pathological ...

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

Pseudomonas aeruginosa (PA) infections result in significant morbidity and mortality in hosts with compromised immune systems, such as patients with leukemia, severe burn wounds, or organ transplants1. In patients at high-risk for developing PA bloodstream infections, the gastrointestinal (GI) tract is the main reservoir for colonization2, but the mechanisms by which PA transitions from an asymptomatic colonizing microbe to an invasive, and often deadly, pathogen are unclear. Previously, we performed in vivo transcription profiling experiments by recovering PA mRNA from bacterial cells residing in the cecums of colonized mice 3 in order to identify changes in bacterial gene expression during alterations to the host&#x2019;s immune status.
As with any transcription profiling experiment, the rate-limiting step is in the isolation of sufficient amounts of high quality mRNA. Given the abundance of enzymes, debris, food residues, and particulate matter in the GI tract, the challenge of RNA isolation is daunting. Here, we present a method for reliable and reproducible isolation of bacterial RNA recovered from the murine GI tract. This method utilizes a well-established murine model of PA GI colonization and neutropenia-induced dissemination4. Once GI colonization with PA is confirmed, mice are euthanized and cecal contents are recovered and flash frozen. RNA is then extracted using a combination of mechanical disruption, boiling, phenol/chloroform extractions, DNase treatment, and affinity chromatography. Quantity and purity are confirmed by spectrophotometry (Nanodrop Technologies) and bioanalyzer (Agilent Technologies) (Fig 1). This method of GI microbial RNA isolation can easily be adapted to other bacteria and fungi as well.

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

A reliable method for the RNA isolation of Pseudomonas aeruginosa recovered from murine cecums is described. The RNA recovered is of sufficient quantity and quality for subsequent qPCR, transcription profiling, and RNA Seq experiments. This technique can be adapted for RNA isolation of other intestinal microbes.

RNA İzolasyonu Pseudomonas aeruginosa Murin Gastrointestinal Yolu koloniler

Pseudomonas aeruginosa (PA) infections result in significant morbidity and mortality in hosts with compromised immune systems, such as patients with ...

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

There is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from cystic fibrosis (CF) patients. Existing methods rely on single or a few isolates grown aerobically and planktonically. Predetermined cut-offs are used to define whether the bacteria are sensitive or resistant to any given antibiotic1. However, during chronic lung infections in CF, P. aeruginosa populations exist in biofilms and there is evidence that the environment is largely microaerophilic2. The stark difference in conditions between bacteria in the lung and those during diagnostic testing has called into question the reliability and even relevance of these tests3.
 Artificial sputum medium (ASM) is a culture medium containing the components of CF patient sputum, including amino acids, mucin and free DNA. P. aeruginosa growth in ASM mimics growth during CF infections, with the formation of self-aggregating biofilm structures and population divergence4,5,6. The aim of this study was to develop a microtitre-plate assay to study antimicrobial susceptibility of P. aeruginosa based on growth in ASM, which is applicable to both microaerophilic and aerobic conditions.
 An ASM assay was developed in a microtitre plate format. P. aeruginosa biofilms were allowed to develop for 3 days prior to incubation with antimicrobial agents at different concentrations for 24 hours. After biofilm disruption, cell viability was measured by staining with resazurin. This assay was used to ascertain the sessile cell minimum inhibitory concentration (SMIC) of tobramycin for 15 different P. aeruginosa isolates under aerobic and microaerophilic conditions and SMIC values were compared to those obtained with standard broth growth. Whilst there was some evidence for increased MIC values for isolates grown in ASM when compared to their planktonic counterparts, the biggest differences were found with bacteria tested in microaerophilic conditions, which showed a much increased resistance up to a &gt;128 fold, towards tobramycin in the ASM system when compared to assays carried out in aerobic conditions.
 The lack of association between current susceptibility testing methods and clinical outcome has questioned the validity of current methods3. Several in vitro models have been used previously to study P. aeruginosa biofilms7, 8. However, these methods rely on surface attached biofilms, whereas the ASM biofilms resemble those observed in the CF lung9 . In addition, reduced oxygen concentration in the mucus has been shown to alter the behavior of P. aeruginosa2 and affect antibiotic susceptibility10. Therefore using ASM under microaerophilic conditions may provide a more realistic environment in which to study antimicrobial susceptibility.

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Current diagnostic antimicrobial susceptibility testing relies on the planktonic growth of isolates in nutrient rich, aerobic conditions. Here, we employ an alternative artificial sputum medium to study antimicrobial susceptibility of Pseudomonas aeruginosa biofilms under both aerobic and microaerophilic conditions more representative of the cystic fibrosis lung.

Karşı Antibiyotik Etkinlik Test Yapay Balgam Orta Kullanımı<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Kistik Fibrozis Akciğer Daha İlgili Koşullar

There  is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial  susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from  cystic ...

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

In order to study human acute lung injury and pneumonia, it is important to develop animal models to mimic various pathological features of this disease. Here we have developed a mouse lung injury model by intra-tracheal injection of bacteria Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa or PA). Using this model, we were able to show lung inflammation at the early phase of injury. In addition, alveolar epithelial barrier leakiness was observed by analyzing bronchoalveolar lavage (BAL); and alveolar cell death was observed by Tunel assay using tissue prepared from injured lungs. At a later phase following injury, we observed cell proliferation required for the repair process. The injury was resolved 7 days from the initiation of P. aeruginosa injection. This model mimics the sequential course of lung inflammation, injury and repair during pneumonia. This clinically relevant animal model is suitable for studying pathology, mechanism of repair, following acute lung injury, and also can be used to test potential therapeutic agents for this disease.

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

We have developed a mouse lung injury model by intra-tracheal injection of bacteria Pseudomonas aeruginosa. This model mimics lung injury during pneumonia and is clinically relevant.

Pseudomonas aeruginosa Kaynaklı Akciğer Hasarı Modeli

In order to study human acute lung injury and pneumonia, it is important to develop animal models to mimic various pathological features of this disease. ...

Come to the Light Side: In Vivo Monitoring of Pseudomonas aeruginosa Biofilm Infections in Chronic Wounds in a Diabetic Hairless Murine Model

The presence of bacteria as structured biofilms in chronic wounds, especially in diabetic patients, is thought to prevent wound healing and resolution. Chronic mouse wounds models have been used to understand the underlying interactions between the microorganisms and the host. The models developed to date rely on the use of haired animals and terminal collection of wound tissue for determination of viable bacteria. While significant insight has been gained with these models, this experimental procedure requires a large number of animals and sampling is time consuming. We have developed a novel murine model that incorporates several optimal innovations to evaluate biofilm progression in chronic wounds: a) it utilizes hairless mice, eliminating the need for hair removal; b) applies pre-formed biofilms to the wounds allowing for the immediate evaluation of persistence and effect of these communities on host; c) monitors biofilm progression by quantifying light production by a genetically engineered bioluminescent strain of Pseudomonas aeruginosa, allowing real-time monitoring of the infection thus reducing the number of animals required per study. In this model, a single full-depth wound is produced on the back of STZ-induced diabetic hairless mice and inoculated with biofilms of the P. aeruginosa bioluminescent strain Xen 41. Light output from the wounds is recorded daily in an in vivo imaging system, allowing for in vivo and in situ rapid biofilm visualization and localization of biofilm bacteria within the wounds. This novel method is flexible as it can be used to study other microorganisms, including genetically engineered species and multi-species biofilms, and may be of special value in testing anti-biofilm strategies including antimicrobial occlusive dressings.

Come to the Light Side: In Vivo Monitoring of Pseudomonas aeruginosa Biofilm Infections in Chronic Wounds in a Diabetic Hairless Murine Model

Here we describe a novel diabetic murine model utilizing hairless mice for real-time, non-invasive, monitoring of biofilm wound infections of bioluminescent Pseudomonas aeruginosa. This method can be adapted to evaluate infection of other bacterial species and genetically modified microorganisms, including multi-species biofilms, and test the efficacy of antibiofilm strategies.

Işık tarafa: In Vivo izleme bir diyabetik tüysüz fare modelinde kronik yaralarda Pseudomonas aeruginosa biyofilm enfeksiyonların

The presence of bacteria as structured biofilms in chronic wounds, especially in diabetic patients, is thought to prevent wound healing and resolution. ...

Methods for Detecting Cytotoxic Amyloids Following Infection of Pulmonary Endothelial Cells by Pseudomonas aeruginosa

Patients who survive pneumonia have elevated death rates in the months following hospital discharge. It has been hypothesized that infection of pulmonary tissue during pneumonia results in the production of long-lived cytotoxins that can lead to subsequent end organ failure. We have developed in vitro assays to test the hypothesis that cytotoxins are produced during pulmonary infection. Isolated rat pulmonary endothelial cells and the bacterium Pseudomonas aeruginosa are used as model systems, and the production of cytoxins following infection of the endothelial cells by the bacteria is demonstrated using cell culture followed by direct quantitation using lactate dehydrogenase assays and a novel microscopic method utilizing ImageJ technology. The amyloid nature of these cytotoxins was demonstrated by thioflavin T binding assays and by immunoblotting and immunodepletion using A11 anti-amyloid antibody. Further analyses using immunoblotting demonstrated that oligomeric tau and A&#946; were produced and released by endothelial cells following infection by P. aeruginosa. These methods should be readily adaptable to analyses of human clinical samples.

Methods for Detecting Cytotoxic Amyloids Following Infection of Pulmonary Endothelial Cells by Pseudomonas aeruginosa

Simple methods are described for demonstrating the production of cytotoxic amyloids following infection of pulmonary endothelium by Pseudomonas aeruginosa.

Yöntemleri için algılama sitotoksik Amyloids aşağıdaki enfeksiyon pulmoner endotel hücre Pseudomonas aeruginosa tarafından

Patients who survive pneumonia have elevated death rates in the months following hospital discharge. It has been hypothesized that infection of pulmonary ...

Long-term In Vivo Tracking of Inflammatory Cell Dynamics Within Drosophila Pupae

During the rapid inflammatory response to tissue damage, cells of the innate immune system are quickly recruited to the injury site. Once at the wound, innate immune cells perform a number of essential functions, such as fighting infection, clearing necrotic debris, and stimulating matrix deposition. In order to fully understand the diverse signaling events that regulate this immune response, it is crucial to observe the complex behaviors of (and interactions that occur between) multiple cell lineages in vivo, and in real-time, with the high spatio-temporal resolution. The optical translucency and the genetic tractability of Drosophila embryos have established Drosophila as an invaluable model to live-image and dissect fundamental aspects of inflammatory cell behavior, including mechanisms of developmental dispersal, clearance of apoptotic corpses&#160;and/or microbial pathogens, and recruitment to wounds. However, more recent work has now demonstrated that employing a much later stage in the Drosophila lifecycle &#8211; the Drosophila pupa &#8211; offers a number of distinct advantages, including improved RNAi efficiency, longer imaging periods, and significantly greater immune cell numbers. Here we describe a protocol for imaging wound repair and the associated inflammatory response at the high spatio-temporal resolution in live Drosophila pupae. To follow the dynamics of both re-epithelialization and inflammation, we use a number of specific in vivo fluorescent markers for both the epithelium and innate immune cells. We also demonstrate the effectiveness of photo-convertible fluorophores, such as Kaede, for following the specific immune cell subsets, to track their behavior as they migrate to, and resolve from, the injury site.

Long-term In Vivo Tracking of Inflammatory Cell Dynamics Within Drosophila Pupae

Here we present a protocol for live-imaging wound repair and the associated inflammatory response at high spatio-temporal resolution in vivo. This method utilizes the pupal stage of Drosophila development to enable long-term imaging and tracking of specific cell populations over time and is compatible with efficient RNAi-mediated gene inactivation.

İnflamatuar hücre dinamiği Drosophila pupa içinde uzun vadeli Vivo içinde izleme

During the rapid inflammatory response to tissue damage, cells of the innate immune system are quickly recruited to the injury site. Once at the wound, ...

Culture of Small Colony Variant of Pseudomonas aeruginosa and Quantitation of its Alginate

Pseudomonas aeruginosa, an opportunistic Gram-negative bacterial pathogen, can overproduce an exopolysaccharide alginate resulting in a unique phenotype called mucoidy. Alginate is linked to chronic lung infections resulting in poor prognosis in patients with cystic fibrosis (CF). Understanding the pathways that regulate the production of alginate can aid in the development of novel therapeutic strategies targeting the alginate formation. Another disease-related phenotype is the small colony variant (SCV). SCV is due to the slow growth of bacteria and often associated with increased resistance to antimicrobials. In this paper, we first show a method of culturing a genetically defined form of P. aeruginosa SCV due to pyrimidine biosynthesis mutations. Supplementation of nitrogenous bases, uracil or cytosine, returns the normal growth to these mutants, demonstrating the presence of a salvage pathway that scavenges free bases from the environment. Next, we discuss two methods for the measurement of bacterial alginate. The first method relies on the hydrolysis of the polysaccharide to its uronic acid monomer followed by derivatization with a chromogenic reagent, carbazole, while the second method uses an ELISA based on a commercially available, alginate-specific mAb. Both methods require a standard curve for quantitation. We also show that the immunological method is specific for alginate quantification and may be used for the measurement of alginate in the clinical specimens.

Culture of Small Colony Variant of Pseudomonas aeruginosa and Quantitation of its Alginate

Here, we describe a growth condition to culture the small colony variant of Pseudomonas aeruginosa. We also describe two separate methods for the detection and quantitation of the exopolysaccharide alginate produced by P. aeruginosa using a traditional uronic acid carbazole assay and an alginate-specific monoclonal antibody (mAb) based ELISA.

Pseudomonas aeruginosa Küçük Koloni Varyant Kültürü ve Aljinat Quantitation

Pseudomonas aeruginosa, an opportunistic Gram-negative bacterial pathogen, can overproduce an exopolysaccharide alginate resulting in a unique phenotype ...

A Delayed Inoculation Model of Chronic Pseudomonas aeruginosa Wound Infection

Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) is a major nosocomial pathogen of increasing relevance to human health and disease, particularly in the setting of chronic wound infections in diabetic and hospitalized patients. There is an urgent need for chronic infection models to aid in the investigation of wound pathogenesis and the development of new therapies against this pathogen. Here, we describe a protocol that uses delayed inoculation 24 hours after full-thickness excisional wounding. The infection of the provisional wound matrix present at this time forestalls either rapid clearance or dissemination of infection and instead establishes chronic infection lasting 7&#8211;10 days without the need for implantation of foreign materials or immune suppression. This protocol mimics a typical temporal course of post-operative infection in humans. The use of a luminescent P. aeruginosa strain (PAO1:lux) allows for quantitative daily assessment of bacterial burden for P. aeruginosa wound infections. This novel model may be a useful tool in the investigation of bacterial pathogenesis and the development of new therapies for chronic P. aeruginosa wound infections.

A Delayed Inoculation Model of Chronic Pseudomonas aeruginosa Wound Infection

We describe a delayed inoculation protocol for generating chronic wound infections in immunocompetent mice.

Kronik Pseudomonas aeruginosa Yara Enfeksiyonu Gecikmiş Aşılama Modeli

Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) is a major nosocomial pathogen of increasing relevance to human health and disease, particularly in the setting of ...