このプロトコルは、特定の同定されたタンパク質を同定し、半定量化することによってユビキチンおよびユビキチン様翻訳後修飾のプロファイルを生成する簡単な方法です。この技術の主な利点は、レンチウイルスを使用して1週間以内に安定した細胞発現ラインを作り出し、タンパク質を特異的に精製するための2つのタグを使用することです。実際、この種の翻訳後修飾はほとんどの生物学的機能に関与しており、このメカニズムの変化はほとんどの疾患に見られる。
したがって、これらの変化を同定することは、予後および/または診断として、そしてもちろん分子標的として役立つかもしれない。ユビキチンは真核細胞の中で最も保存されたタンパク質の一つであり、その生存のために不可欠です。したがって、この種の方法は、哺乳類から酵母まで、あらゆる真核生物モデルに適用することができます。
しかし、私たちのレンチウイルスシステムは細胞の研究に限定されています。全体の手順は、時には長い潜伏時間とかなり長いので、1の代わりに2日間にわたってそれを行うことができます。ニッケルビーズからの溶出は、マイナス20で、フラグビーズを追加する前に凍結することができます。
このプロトコルには、精製の最終的な成功を保証するために重要なステップが多数含まれているため、翻訳後修飾プロファイルを正確に確立します。この手順のデモンストレーションは、ミルナ・スウェイデンとアウレリー・ドブリック(研究室の博士課程の2人の学生)によって行われます。まず、播種するDMEMのウェルあたり2ミリリットルの6ウェルプレートにHEK 293T細胞の6番目に0.5倍の10を加え、摂氏37度、炭酸ガス5%、湿度100%でインキュベートします。
翌日、50~70%合流が達成される。pCCL-6HFユビキチン様またはpCCL-GFPの1マイクログラム、PBS VGの1マイクログラム、レンチウイルス産生のためのトランスフェクション試薬とプロトコルを使用したデルタヘルパーベクターの1マイクログラムを組み合わせて細胞をコトランスフェクトする。トランスフェクションの6時間後、トランスフェックされる細胞の培地に対応する新鮮なものに培地を変更する。
その翌日に10~20%の合流を得るために、標準的な培養培地を用いて6ウェルプレートに導入する細胞をシードします。トランスフェクションの24時間後、レンチウイルス粒子を含む培地を回収し、0.45ミクロンフィルターを用いて濾過する。レンチウイルスを含む濾過培地によって導入される細胞の培地を交換する。
レンチウイルスを含む細胞を摂氏37度と5%の二酸化炭素のインキュベーターで24〜72時間インキュベートし、新鮮で標準的な1つで培地を交換します。反転蛍光顕微鏡を用いてGFPの発現をチェックし、トランスダクションの効率を評価します。蛍光が検出されない場合は、さらに2〜3日待ちます。
GFPコントロールが緑色蛍光で陽性の場合、ここに示すように、免疫蛍光による6-His-FLAGユビキチン様の発現制御を行うのに十分になるまで全ての細胞を増殖させ、抗FLAG抗体を用いてウェスタンブロットを使用する。15センチメートルの皿で細胞を成長させた後、リン酸緩衝生理食塩水で培養皿を室温で少なくとも1回洗う。細胞のリシスを開始するには、室温で各15センチメートル皿にバッファー1の2ミリリットルを追加します。
セルスクレーパーを使用して、すべてのライセートを50ミリリットル円錐形遠心分離管に回収します。ライステイトを30秒間3回超音波処理し、1分間の休止で区切ります。15,000回gで超音波処理されたライセートを15分間遠心分離する。
40ミクロンの細胞ストレーナーを介して新しいチューブに上清を移します。超音波処理と遠心分離後にライセートをフィルタリングすることは非常に重要です。これを行わない場合、多くの非特異的タンパク質の共精製が行われ、それによってバックグラウンドが増加し、PTMプロファイルのサイズが大きく低下する可能性があります。
新しいファルコンチューブに50と100ミリグラムの間のタンパク質の同量を転送します。各チューブに、1ミリグラムのタンパク質につき2マイクロリットルのビーズの量でニッケルイオンNTAビーズを加えます。チューブを回転器の上に置き、室温で2時間半回転させます。
その後、5分間500回gでビーズをペレット化する。1ミリリットルのバッファー1でビーズを洗い、サンプルを1.5ミリリットルのマイクロ遠心分離チューブに移します。チューブを氷の上に置きます。
10ミリモルルイミダゾールを含む氷冷緩衝液2の1ミリリットルで2回洗浄します。タンパク質を溶出させるには、250ミリモルイミダゾールを含むバッファ2の600マイクロリットルを加え、摂氏4度で2時間回転させます。500回gで1分間遠心分離してビーズをペレット化した後、上清を新しい予め冷却した1.5ミリリットルチューブに移し、抗FLAG M2抗体共役ビーズを50マイクロリットル加えます。
摂氏4度で2時間半30rpmで回転させます。その後、バッファー2の500マイクロリットルで2回洗浄し、その後、バッファー3の500マイクロリットルで2回洗浄します。最終的な溶出のために、1マイクロリットル当たり0.01マイクログラムでFLAGペプチドを含むバッファ3の100マイクロリットルを加え、1 1/2時間摂氏4度で回転させる。
500回gで1分間遠心した後、上清を新しい予冷チューブに移します。SDS-PAGEにロードするために10マイクロリットルを取り、精製品質を制御するためにゲルの銀染色を行います。精製が良く見える場合は、LC-MSが残した90%を分析してください。
正規化を実行するには、ユビキチンと GFP の薬物処理細胞と未処理の細胞の間の値を正規化する式を使用します。背景を除去するために、ユビキチンサンプル中の値からコントロールサンプルGFPの値を減算し、両方の条件で同定された各タンパク質に対して特定の値を得た。ユビキチン化の変動を得るために、薬物によって誘発されるPTMの正および負の変動に対してマイナス100と100の間のスコアを得る。
処理されたサンプルと未処理サンプルの特定の値の差は、コントロール内の値を含むすべての値の合計で除算され、100 を掛けます。PTMの抑制を表すマイナス50以下の変動、またはPTMの誘導を表す50以上は有意であると考えられる。この数式を使用して、50 を超える 0 ~ 100%の値の間の信頼値を得る場合は、通常、信頼できると見なされます。
誘導値と抑圧値のより良い分布を得るために、および変動と信頼度の両方のパラメータを考慮するには、この式を使用して分散値と信頼度値を乗算します。本研究では、哺乳動物細胞の培養細胞の導入が達成され、GFPおよび6-ヒスチジンFLAGユビキチン発現細胞を作成した。レンチウイルス導入の有効性は、GFP導入細胞のGFP蛍光を見て最初に制御された。
FLAG-ユビキチンの発現は、トランスデューシングされた細胞の割合を示す抗FLAG抗体を用いた免疫蛍光染色法によって行われた。外因性FLAG-ユビキチンの発現量を制御するために、トランスデューセ細胞からのライセートをSDS-PAGEによって分析し、続いて抗FLAG抗体を用いてウェスタンブロットを分析した。ユビキチン化タンパク質の精製後、最終溶出の10%を使用して、ゲルのSDS-PAGEおよび銀染色による精製物質の量および完全性を制御した。
バックグラウンドGFPサンプル減算は、50%を超えるスコアで有意にユビキチン化された364個のタンパク質を同定し、これらのユビキチン化タンパク質の遺伝子セット濃縮分析を行い、それらが関与した生物学的プロセスを強調するために行った。ジェムシタビン誘発性ユビキチン化による潜在的相互作用ネットワーク。これは、関与するタンパク質のユビキチン化の増加または減少によって強く影響を受ける機能的相互作用ネットワークの同定につながった。
また、ゲムシタビン治療後にPCNAのユビキチン化が増加することも確認された。両方の溶出ステップの後に、背景の大幅な増加をもたらす可能性があるため、いくつかのビーズの転送を避けることは非常に重要です。この手順では、異なる条件を比較することによって、特定の変更の識別を可能にする特定の翻訳後の変更を生成します。
最初の次のステップは、少なくとも生化学的アプローチに基づいて関心の変化を検証する。膵臓がん細胞の新しい方法とメカニズムを特定するために、ユビキチンベースの翻訳後修飾を探求するこの方法を開発しました。このプロトコルやその他の世界的に開発されて以来、異なる生物学的プロセスを解読するためにうまく採用されてきました。
レンチウイルスは、少なくともBL-2実験室で使用されなければならない。グアニジンは強力な変性剤であり、慎重に使用する必要があります。超音波処理器はまた耳に有害であり、次の推奨事項を使用する必要があります。
