Этот протокол является простым способом для создания профилей убиквитина и убиквитина, как пост-трансляционных модификаций путем выявления и полу-количественной конкретных выявленных белков. Основным преимуществом этого метода является использование лентивирусов для создания стабильной клеточной линии выражения в течение недели, а также использование двух тегов для специальной очистки белков. На самом деле, такого рода пост-трансляционные изменения участвуют в большинстве биологических функций, и изменения этого механизма находятся в большинстве заболеваний.
Таким образом, выявление этих изменений может служить в качестве прогностический и / или диагностики и, конечно, в качестве молекулярных целей. Убиквитин является одним из самых консервативных белков в эукариотических клетках, и это необходимо для их выживания. Таким образом, этот метод может быть применен к любой эукариотической модели, от млекопитающих до дрожжей.
Тем не менее, наша лентивирусная система ограничивается изучением клеток. Так как вся процедура довольно длинная с иногда долгим инкубационный период, можно сделать это в течение двух дней, а не один. Элуат из никеля шарики могут быть заморожены при температуре минус 20 и перед добавлением флага бисера.
Этот протокол содержит много шагов, некоторые из которых имеют решающее значение для того, чтобы гарантировать окончательный успех очищения, и, таким образом, точное создание профиля пост-трансляционной модификации. Демонстрацию процедуры будут выполнять Мирна Суэйден и Аурели Добрич, два аспиранта лаборатории. Для начала добавьте 0,5 раза 10 к шестой части heK 293T клеток в шесть хорошо пластины с двумя миллилитров на колодец DMEM с 10%FBS семян, и инкубировать при 37 градусов по Цельсию, 5%углекислого газа, и 100% влажности.
На следующий день достигается от 50 до 70% слияния. Сотрансфект клеток с сочетанием одного микрограмма pCCL-6HF убиквитин-как или pCCL-GFP, один микрограмм PBS VG, и один микрограмм дельта-помощник векторов с использованием трансинфекционных реагентов и протокол для производства лентивируса. После шести часов трансфекции, изменить среду на новую, соответствующую средствам массовой информации клеток, которые будут трансуцированы.
Семя клетки, которые будут трансуцированы в шесть хорошо пластины с их стандартной культуры средств массовой информации для того, чтобы получить от 10 до 20% слияния на следующий день после этого. Через 24 часа после трансфекции, восстановить среды, содержащие лентивирусные частицы, и фильтр с помощью 0,45-микрон фильтров. Замените среду клеток, которые будут трансуцированы фильтрованной средой, содержащей лентивирусы.
Инкубировать клетки с лентивирусами в течение 24 до 72 часов в инкубаторе при 37 градусах по Цельсию и 5%углекислого газа, а затем изменить среду со свежим, стандартный. Проверьте выражение GFP с помощью перевернутого флуоресцентного микроскопа для оценки эффективности трансдукции. Если флуоресценция не обнаружена, подождите еще два-три дня.
Если контроль GFP положительный с зеленой флуоресценцией, расти все клетки, пока не достаточно, чтобы выполнить контроль выражения 6-His-FLAG убиквитин-как по иммунофторесценции, как показано здесь, и западной пятно с использованием анти-FLAG антитела. После выращивания клеток в 15-сантиметровых блюдах, мыть посуду культуры по крайней мере один раз с фосфат-буфером солевого раствора при комнатной температуре. Чтобы начать клеточныйлиз, добавьте два миллилитров буфера по одному в каждое 15-сантиметровое блюдо при комнатной температуре.
Используйте сотовый скребок, чтобы восстановить все лисаты в 50-миллилитровые конические центрифуги труб. Sonicate lystates три раза в течение 30 секунд, разделенных на одну минуту паузы. Центрифуга sonicated лисирует при 15 000 раз г в течение 15 минут.
Перенесите супернатант в новую трубку через 40-микрон-клеточный ситечко. Очень важно фильтровать лисаты после звуковой и центрифугации. Не делать этого может привести к копурификации многих неспецифических белков, тем самым увеличивая фон и сильно уменьшая размер профиля PTM.
Перенесите равное количество белка между 50 и 100 миллиграммами в новые трубки Falcon. Добавьте никель-ионный бисер NTA в каждую трубку с количеством двух микролитров бисера на один миллиграмм белка. Поместите трубки на ротатор, чтобы повернуть при 30 об/мин в течение 2 1 / 2 часа при комнатной температуре.
Затем гранулы бисера на 500 раз г в течение пяти минут. Вымойте бусины одним миллилитровом буфера и перенесите образцы в 1,5-миллилитровую микроцентрифугную трубку. Поместите трубку на лед.
Вымойте дважды с одним миллилитров ледяного буфера два, содержащие десять миллимолярный имидазол. Чтобы улют-связанных белков, добавить 600 микролитров буфера два, содержащие 250-миллимолярный имидазол, и вращаться в течение двух часов при четырех градусах по Цельсию. После гранулирования бисера центрифугой при 500 г в течение одной минуты, перенесите супернатант в новую предварительно охлаждено 1,5-миллилитровую трубку и добавьте 50 микролитров антител анти-FLAG M2.
Поверните при 30 об/мин в течение 2 1 /2 часов при четырех градусах по Цельсию. Затем мыть дважды с 500 микролитров буфера два, а затем дважды с 500 микролитров буфера три. Для окончательного элюции добавьте 100 микролитров буфера 3, содержащих пептид FLAG по 0,01 микрограмма на микролитер, и поверните при четырех градусах Цельсия в течение 1 1/2 часов.
После центрифугации в 500 раз г в течение одной минуты, перенесите супернатант в новую предварительно охлажденую трубку. Возьмите 10 микролитров для загрузки на SDS-PAGE, и выполнить серебряное окрашивание геля для контроля качества очистки. Если очистка выглядит хорошо, проанализируйте 90%, оставленные LC-MS.
Для выполнения нормализации используйте формулы для нормализации значений между обработанными наркотиками клетками и необработанными клетками для убиквитина и GFP. Чтобы удалить фон, вычесть значения в контрольной выборке GFP из значений в образцах убиквитина, чтобы получить конкретные значения для каждого идентифицированного белка в обоих условиях. Чтобы получить вариацию убиквитина, получить балл от минус 100 до плюс 100 для положительных и отрицательных вариаций ПТМ, вызванных препаратом.
Разница между конкретными значениями обработанных и необработанных образцов делится на сумму всех значений, включая те, которые находятся под контролем, и умножается на 100. Существенные считаются вариации ниже минус 50, представляющие собой подавление PTM, или выше 50, представляющие индукцию PTM. Используйте эту формулу, чтобы получить значение доверия между нулем и 100%Значения выше 50, как правило, считаются уверенными.
Чтобы получить более хорошее распределение индукционных и репрессийных значений, а также рассмотреть как параметры изменения, так и параметры доверия, используйте эту формулу, чтобы умножить различия и значения доверия. В этом исследовании, трансдукция клеток млекопитающих культуры была достигнута для создания GFP и 6-гистидин FLAG убиквитин экспрессии клеток. Эффективность лентивирусной трансдукции была впервые контролируется путем глядя на GFP флуоресценции GFP-трансдуцированных клеток.
Выражение FLAG-убиквитина было сделано путем окрашивания иммунофлюоресценции с помощью антитела анти-FLAG, которое показывает процент трансдуцированных клеток. Для того, чтобы контролировать уровень экспрессии экзогенного FLAG-убиквитина, лизаты из трансдуцированных клеток были проанализированы SDS-PAGE с последующим западным пятном с антителами анти-FLAG. После очищения убиквитинированных белков, 10% окончательного элауляции было использовано для контроля количества и целостности очищенного материала SDS-PAGE и окрашивания геля серебром.
Фон GFP образца вычитания определены 364 белков значительно ubiquitinated с баллом выше 50%A гена набор обогащения анализ этих убиквитинированных белков было выполнено для того, чтобы подчеркнуть биологические процессы, в которых они были вовлечены. Потенциальные взаимодействующие сети, образованные гемцитабин-индуцированными изменениями убиквитина. Это привело к выявлению функциональных взаимодействующих сетей, сильно пострадавших от увеличения или снижения убиквитинации участвующих белков.
Было также подтверждено, что убиквитина ПХНА увеличилось после лечения гемцитабином. Это очень важно, чтобы избежать передачи некоторых шариков после обоих шагов elution, так как это может привести к значительному увеличению фона. Эта процедура приведет к конкретным пост-трансляционным изменениям, которые, сравнивая различные условия, позволят идентифицировать конкретные изменения.
Первым следующим шагом будет проверка по крайней мере изменений интереса, основанных на биохимических подходах. Мы разработали этот метод для изучения убиквитин основе, после перевода модификаций для того, чтобы определить новые способы и механизмы раковых клеток поджелудочной железы. С тех пор этот протокол и другие разработанные во всем мире были успешно использованы для расшифровки различных биологических процессов.
Лентивирусы должны быть использованы по крайней мере в лаборатории BL-2. Гуанидин является сильным денатурации агента и должен быть использован тщательно. Соникатор также может быть вредным для ушей и должны быть использованы в соответствии с рекомендациями.
