Este protocolo é uma maneira fácil de gerar os perfis de ubiquitina e modificações pós-translacionais semelhantes à ubiquidade, identificando e semi-quantificando proteínas identificadas específicas. A principal vantagem dessa técnica é o uso de lentivírus para criar uma linha de expressão celular estável dentro de uma semana, e o uso de duas tags para purificar especificamente proteínas. De fato, esse tipo de modificações pós-translacionais estão envolvidas na maioria das funções biológicas, e alterações desse mecanismo são encontradas na maioria das doenças.
Portanto, a identificação dessas alterações pode servir como prognóstico e/ou diagnóstico e, claro, como alvos moleculares. A ubiquitina é uma das proteínas mais conservadas em células eucarióticas e isso é essencial para sua sobrevivência. Portanto, esse tipo de método poderia ser aplicado a qualquer modelo eucariótico, de mamíferos a leveduras.
No entanto, nosso sistema lentiviral está restrito ao estudo das células. Como todo o procedimento é bastante longo com tempo de incubação às vezes longo, é possível fazê-lo ao longo de dois dias em vez de um. O elunato de contas de níquel pode ser congelado a menos 20 e antes de adicionar as contas de bandeira.
Este protocolo contém muitas etapas entre as quais alguns são críticos para garantir o sucesso final da purificação e, portanto, o estabelecimento preciso do perfil de modificação pós-translacional. A demonstração do procedimento será realizada por Mirna Swayden e Aurelie Dobric, duas alunas de doutorado do laboratório. Para começar, adicione 0,5 vezes 10 ao sexto das células HEK 293T em uma placa de seis poços com dois mililitros por poço de DMEM com 10% de FBS à semente, e incubar a 37 graus Celsius, 5% de dióxido de carbono e 100% de umidade.
No dia seguinte, 50 a 70% de confluência é alcançada. Cotransfeito as células com uma mistura de um micrograma de pCCL-6HF semelhante a ubiquitina ou pCCL-GFP, um micrograma de PBS VG, e um micrograma de vetores de ajudante delta usando um reagente de transfecção e protocolo para produção de lentivírus. Após seis horas de transfecção, mude o meio para um novo correspondente à mídia das células a serem transduzidas.
Semear as células a serem transduzidas em uma placa de seis poços com seus meios de cultura padrão, a fim de obter confluência de 10 a 20% no dia seguinte. 24 horas após a transfecção, recupere o meio contendo partículas lentivirais e filtre usando filtros de 0,45 mícrons. Substitua o meio das células a serem transduzidas pelo meio filtrado contendo lentivírus.
Incubar as células com lentivírus por 24 a 72 horas em uma incubadora a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono, e depois alterar o meio com um fresco e padrão. Verifique a expressão GFP usando um microscópio fluorescente invertido para avaliar a eficiência da transdução. Se não for detectada fluorescência, espere mais dois ou três dias.
Se o controle GFP for positivo com fluorescência verde, cresça todas as células até ter o suficiente para realizar um controle de expressão de ubiquitina 6-His-FLAG por imunofluorescência, como mostrado aqui, e mancha ocidental usando anticorpo anti-FLAG. Depois de cultivar as células em pratos de 15 centímetros, lave os pratos da cultura pelo menos uma vez com soro fisco tamponado a temperatura ambiente. Para começar a lise celular, adicione dois mililitros de tampão um em cada prato de 15 centímetros à temperatura ambiente.
Use um raspador de células para recuperar todos os linfits em tubos de centrífuga cônica de 50 mililitros. Sonicar os estados três vezes por 30 segundos, separados por uma pausa de um minuto. Centrifugar os lises sônicas a 15.000 vezes g durante 15 minutos.
Transfira o supernante para um novo tubo através de um coador de células de 40 mícrons. É muito importante filtrar lises após sônica e centrifugação. Não fazer isso pode resultar na copurificação de muitas proteínas não específicas, aumentando assim o fundo e reduzindo fortemente o tamanho do perfil PTM.
Transfira uma quantidade igual de proteína entre 50 e 100 miligramas para novos tubos Falcon. Adicione contas de íons de níquel em cada tubo com a quantidade de dois microliters de contas por um miligrama de proteína. Coloque os tubos em um rotador para girar a 30 rpm durante 2 horas e meia em temperatura ambiente.
Em seguida, pelota as contas a 500 vezes g por cinco minutos. Lave as contas com um mililitro de tampão um, e transfira as amostras para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro. Coloque o tubo no gelo.
Lave duas vezes com um mililitro de tampão gelado dois contendo imidazol de dez milimiliar. Às proteínas ligadas ao elto, adicione 600 microliters de tampão dois contendo imidazol de 250 mililitros, e gire por duas horas a quatro graus Celsius. Depois de pelotizar as contas por centrifugação a 500 vezes g por um minuto, transfira o supernante para um novo tubo pré-resfriado de 1,5 mililitro, e adicione 50 microliters de contas conjugadas anti-FLAG M2.
Gire a 30 rpm por 2 horas e meia a quatro graus Celsius. Em seguida, lave duas vezes com 500 microliters de tampão dois, depois duas vezes com 500 microliters de buffer três. Para a eluição final, adicione 100 microliters de buffer três contendo um peptídeo FLAG a 0,01 micrograma por microliter, e gire a quatro graus Celsius por 1 1/2 horas.
Após centrifugação a 500 vezes g por um minuto, transfira o supernatante para um novo tubo pré-refrigerado. Leve 10 microliters para carregar no SDS-PAGE, e realize uma coloração prateada do gel para controlar a qualidade da purificação. Se a purificação parecer boa, analise os 90% deixados pela LC-MS.
Para realizar a normalização, use as fórmulas para normalizar valores entre células tratadas com drogas e células não tratadas para ubiquitina e GFP. Para remover o fundo, subtraia valores na amostra de controle GFP de valores nas amostras de ubiquitina, para obter valores específicos para cada proteína identificada em ambas as condições. Para obter a variação da ubiquização, obtenha um escore entre menos 100 e mais 100 para variações positivas e negativas de PTMs induzidos por uma droga.
A diferença entre os valores específicos das amostras tratadas e não tratadas é dividida pela soma de todos os valores, incluindo os do controle, e multiplicada por 100. Variações abaixo de menos 50, representando a repressão do PTM, ou acima de 50, representando a indução do PTM, são consideradas significativas. Use esta fórmula para obter um valor de confiança entre zero e 100% Valores acima de 50 são geralmente considerados confiantes.
Para obter uma distribuição mais agradável dos valores de indução e repressão, e considerar tanto os parâmetros de variação quanto de confiança, use essa fórmula para multiplicar os valores de variância e confiança. Neste estudo, a transdução de células de mamíferos culturais foi alcançada para criar células de ubiquitina GFP e 6-histidinas. A eficácia da transdução lentiviral foi primeiramente controlada olhando para a fluorescência GFP das células transduzidas pelo GFP.
A expressão da FLAG-ubiquitina foi feita por manchas de imunofluorescência usando um anticorpo anti-FLAG, que mostra a porcentagem de células transduzidas. Para controlar o nível de expressão da exógena FLAG-ubiquitina, os lysates de células transduzidas foram analisados por SDS-PAGE seguido de mancha ocidental com anticorpo antiflamato. Após a purificação das proteínas ubiquitinadas, 10% da elução final foi utilizada para controlar a quantidade e integridade do material purificado pela SDS-PAGE e pela coloração de prata do gel.
Subtração amostra GFP de fundo identificou 364 proteínas significativamente ubiquitinadas com pontuação acima de 50%Uma análise de enriquecimento de conjunto genético dessas proteínasubiquitinadas foi realizada para destacar os processos biológicos em que estavam envolvidos. Potenciais redes de interação formadas por alterações induzidas por gemcitabina de ubiquização. Isso levou à identificação de redes de interação funcional fortemente afetadas pelo aumento ou diminuição da ubiquização das proteínas envolvidas.
Também foi confirmado que a ubiquização da PCNA aumentou após o tratamento gemcitabina. É muito importante evitar a transferência de algumas contas após ambas as etapas de eluição, uma vez que pode resultar em um aumento significativo de fundo. Este procedimento gerará modificações pós-translacionais específicas que, ao comparar diferentes condições, permitirão a identificação de alterações específicas.
O primeiro próximo passo será validar pelo menos as alterações de interesse com base em abordagens bioquímicas. Desenvolvemos este método para explorar modificações pós-translacionais baseadas em ubiquína, a fim de identificar novas formas e mecanismos de células cancerígenas pancreáticas. Desde este protocolo e outros desenvolvidos em todo o mundo têm sido empregados com sucesso para decifrar diferentes processos biológicos.
Os lentivírus devem ser usados pelo menos no laboratório BL-2. Guanidine é um agente forte de desnaturação e tem que ser usado com cuidado. O sonicator também pode ser prejudicial para os ouvidos e deve ser usado seguindo recomendações.
