Ce protocole est un moyen facile de générer les profils des modifications post-translationnelles d’ubiquitine et d’ubiquitine en identifiant et en semi-quantifiant des protéines spécifiques identifiées. Le principal avantage de cette technique est l’utilisation de lentivirus pour créer une ligne d’expression cellulaire stable en une semaine, et l’utilisation de deux étiquettes pour purifier spécifiquement les protéines. En fait, ce genre de modifications post-translationnelles sont impliqués dans la plupart des fonctions biologiques, et les altérations de ce mécanisme se trouvent dans la plupart des maladies.
Par conséquent, l’identification de ces altérations peut servir de pronostic et/ou de diagnostic et bien sûr de cibles moléculaires. L’ubiquitine est l’une des protéines les plus conservées dans les cellules eucaryotes et cette protéine essentielle à leur survie. Par conséquent, ce type de méthode pourrait être appliqué à n’importe quel modèle eucaryotique, des mammifères à la levure.
Cependant, notre système lentiviral est limité à l’étude des cellules. Puisque l’ensemble de la procédure est assez long avec parfois un long temps d’incubation, il est possible de le faire sur deux jours au lieu d’un. L’élitate des perles de nickel peut être congelé à moins 20 et avant d’ajouter les perles flag.
Ce protocole contient de nombreuses étapes parmi lesquelles certaines sont critiques afin de garantir le succès final de la purification, et donc l’établissement précis du profil de modification post-translationnelle. La démonstration de la procédure sera effectuée par Mirna Swayden et Aurélie Dobric, deux doctorantes du laboratoire. Pour commencer, ajouter 0,5 fois 10 à la sixième des cellules HEK 293T dans une plaque de six puits avec deux millilitres par puits de DMEM avec 10%FBS à semer, et incuber à 37 degrés Celsius, 5% de dioxyde de carbone, et 100% d’humidité.
Le lendemain, 50 à 70% de confluence est atteinte. Cotransfecter les cellules avec un mélange d’un microgramme de pCCL-6HF ubiquitine-like ou pCCL-GFP, un microgramme de PBS VG, et un microgramme de vecteurs delta helper en utilisant un réagentine transfection et le protocole pour la production de lentivirus. Après six heures de transfection, changer le milieu en un milieu frais correspondant au milieu des cellules à transduire.
Ensemencer les cellules à transduire dans une plaque de six puits avec leur média de culture standard afin d’obtenir 10 à 20% de confluence le lendemain. 24 heures après la transfection, récupérer le milieu contenant des particules lentivirales et filtrer à l’aide de filtres de 0,45 micron. Remplacer le milieu des cellules à transdire par le milieu filtré contenant des lentivirus.
Incuber les cellules avec des lentivirus pendant 24 à 72 heures dans un incubateur à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone, puis changer le milieu avec frais, standard. Vérifiez l’expression GFP à l’aide d’un microscope fluorescent inversé pour évaluer l’efficacité de la transduction. Si aucune fluorescence n’est détectée, attendez deux à trois jours de plus.
Si le contrôle GFP est positif avec la fluorescence verte, faire pousser toutes les cellules jusqu’à ce qu’elles en ont assez pour effectuer un contrôle d’expression de l’ubiquitine 6-His-FLAG-like par immunofluorescence, comme indiqué ici, et tache occidentale utilisant l’anticorps anti-FLAG. Après avoir cultivé les cellules dans des plats de 15 centimètres, lavez la vaisselle de culture au moins une fois avec de la solution saline tamponnée de phosphate à température ambiante. Pour commencer la lyse cellulaire, ajouter deux millilitres de tampon un dans chaque plat de 15 centimètres à température ambiante.
Utilisez un grattoir cellulaire pour récupérer tous les lysates dans des tubes de centrifugeuse conique de 50 millilitres. Sonicate les lystates trois fois pendant 30 secondes, séparés par une pause d’une minute. Centrifugeuse les lysates soniques à 15 000 fois g pendant 15 minutes.
Transférer le supernatant dans un nouveau tube à l’aide d’une passoire cellulaire de 40 microns. Il est très important de filtrer les lysates après la sonication et la centrifugation. Ne pas le faire peut entraîner la copurification de nombreuses protéines non spécifiques, augmentant ainsi l’arrière-plan et réduisant fortement la taille du profil PTM.
Transférer une quantité égale de protéines entre 50 et 100 milligrammes dans de nouveaux tubes Falcon. Ajouter des perles d’ion nickel NTA dans chaque tube avec la quantité de deux microlitres de perles par milligramme de protéines. Placer les tubes sur un rotateur pour tourner à 30 rpm pendant 2 1/2 heures à température ambiante.
Puis pelleter les perles à 500 fois g pendant cinq minutes. Lavez les perles avec un millilitre de tampon et transférez les échantillons dans un tube de microcentrifugeuse de 1,5 millilitre. Placez le tube sur la glace.
Lavez-les deux fois avec un millilitre de tampon glacé deux contenant de l’imidazole de dix millimlaires. Pour les protéines liées à l’épuute, ajouter 600 microlitres de tampon deux contenant de l’imidazole de 250 millimlaires, et tourner pendant deux heures à quatre degrés Celsius. Après avoir granulé les perles par centrifugation à 500 fois g pendant une minute, transférer le supernatant dans un nouveau tube pré-refroidi de 1,5 millilitre, et ajouter 50 microlitres de perles anti-FLAG M2 conjuguées aux anticorps.
Tournez à 30 rpm pendant 2 1/2 heures à quatre degrés Celsius. Ensuite, lavez-les deux fois avec 500 microlitres de tampon deux, puis deux fois avec 500 microlitres de tampon trois. Pour l’élitution finale, ajouter 100 microlitres de tampon trois contenant un peptide FLAG à 0,01 microgramme par microlitre, et tourner à quatre degrés Celsius pendant 1 1/2 heures.
Après centrifugation à 500 fois g pendant une minute, transférer le supernatant dans un nouveau tube pré-refroidi. Prenez 10 microlitres à charger sur SDS-PAGE, et effectuer une coloration d’argent du gel pour contrôler la qualité de purification. Si la purification semble bonne, analyser les 90% laissés par LC-MS.
Pour effectuer la normalisation, utilisez les formules pour normaliser les valeurs entre les cellules traitées par la drogue et les cellules non traitées pour l’ubiquitine et le GFP. Pour enlever l’arrière-plan, soustrayez les valeurs de l’échantillon de contrôle GFP des valeurs des échantillons d’ubiquitine, afin d’obtenir des valeurs spécifiques pour chaque protéine identifiée dans les deux conditions. Pour obtenir la variation de l’ubiquitination, obtenir un score entre moins 100 et plus 100 pour les variations positives et négatives des MNP induites par un médicament.
La différence entre les valeurs spécifiques des échantillons traités et non traités est divisée par la somme de toutes les valeurs, y compris celles dans le contrôle, et multipliée par 100. Les variations inférieures à moins 50, représentant la répression du PTM, ou au-dessus de 50, représentant l’induction de PTM, sont considérées comme significatives. Utilisez cette formule pour obtenir une valeur de confiance comprise entre zéro et 100%Les valeurs supérieures à 50 sont généralement considérées comme confiantes.
Pour obtenir une meilleure répartition des valeurs d’induction et de répression, et pour tenir compte à la fois des paramètres de variation et de confiance, utilisez cette formule pour multiplier les valeurs de variance et de confiance. Dans cette étude, la transduction des cellules mammifères de culture a été réalisée pour créer gfp et 6-histidine FLAG ubiquitine exprimant des cellules. L’efficacité de la transduction lentiviral a d’abord été contrôlée en examinant la fluorescence de GFP des cellules GFP-transduced.
L’expression de FLAG-ubiquitine a été faite par coloration d’immunofluorescence utilisant un anticorps anti-FLAG, qui montre le pourcentage de cellules transduced. Afin de contrôler le niveau d’expression de flag-ubiquitine exogène, des lysates des cellules transduced ont été analysés par SDS-PAGE suivi de la tache occidentale avec l’anticorps anti-FLAG. Après purification des protéines ubiquitinées, 10% de l’élitution finale a été utilisée pour contrôler la quantité et l’intégrité du matériel purifié par SDS-PAGE et la coloration argentée du gel.
Contexte La soustraction de l’échantillon GFP a identifié 364 protéines significativement ubiquitinées avec un score supérieur à 50%Une analyse d’enrichissement de ces protéines ubiquitinées a été effectuée afin de mettre en évidence les processus biologiques dans lesquels elles ont été impliquées. Réseaux d’interaction potentiels formés par des altérations induites par la gemcitabine de l’ubiquitination. Ceci a mené à l’identification des réseaux fonctionnels d’interaction fortement affectés par l’ubiquitination accrue ou diminuée des protéines impliquées.
Il a également été confirmé que l’ubiquitination de PCNA a augmenté après traitement de gemcitabine. Il est très important d’éviter le transfert de certaines perles après les deux étapes d’élitution, car il peut entraîner une augmentation significative de l’arrière-plan. Cette procédure générera des modifications post-translationnelles spécifiques qui, en comparant différentes conditions, permettront d’identifier des modifications spécifiques.
La première étape suivante sera de valider au moins les altérations d’intérêt basées sur des approches biochimiques. Nous avons développé cette méthode pour explorer les modifications post-translationnelles basées sur l’ubiquitine afin d’identifier de nouvelles façons et mécanismes des cellules cancéreuses pancréatiques. Depuis ce protocole et d’autres développés dans le monde entier ont été utilisés avec succès pour déchiffrer différents processus biologiques.
Les lentivirus doivent être utilisés au moins en laboratoire BL-2. Guanidine est un agent de dénaturation forte et doit être utilisé avec soin. Le sonicateur peut également être nocif pour les oreilles et doivent être utilisés selon les recommandations.
