هذا البروتوكول هو وسيلة سهلة لتوليد ملامح من كل مكان و في كل مكان مثل التعديلات ما بعد الترجمة من خلال تحديد وشبه الكمي بروتينات محددة محددة. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي استخدام فيروسات العدس لإنشاء خط تعبير خلية مستقر في غضون أسبوع ، واستخدام اثنين من العلامات لتنقية البروتينات على وجه التحديد. في الواقع ، وهذا النوع من التعديلات بعد الترجمة تشارك في معظم الوظائف البيولوجية ، والتغيرات في هذه الآلية وجدت في معظم الأمراض.
ولذلك، فإن تحديد هذه التعديلات قد يكون بمثابة تشخيص و/أو تشخيص، وبالطبع كأهداف جزيئية. يوبيكيتين هو واحد من البروتين الأكثر حفظا في الخلايا eukaryotic وهذا ضروري لبقائهم. لذلك، يمكن تطبيق هذا النوع من الأسلوب على أي نموذج eukaryotic، من الثدييات إلى الخميرة.
ومع ذلك، يقتصر نظامنا العدتي فيروسي لدراسة الخلايا. منذ الإجراء كله طويل جدا مع وقت الحضانة في بعض الأحيان طويلة، فمن الممكن أن تفعل ذلك على مدى يومين بدلا من واحد. يمكن تجميد الـ eluate من حبات النيكل عند ناقص 20 وقبل إضافة حبات العلم.
يحتوي هذا البروتوكول على العديد من الخطوات التي من بينها بعض حاسمة من أجل ضمان النجاح النهائي لتنقية، وبالتالي إنشاء دقيق لملف تعريف التعديل ما بعد الترجمة. سيتم إجراء إثبات الإجراء من قبل ميرنا سوايدن وأوريلي دوبريك، وهما طالبان دكتوراه في المختبر. للبدء، إضافة 0.5 مرات 10 إلى السادسة من خلايا HEK 293T في لوحة ستة جيدا مع اثنين من ملليلتر في بئر من DMEM مع 10٪ FBS إلى البذور، واحتضان في 37 درجة مئوية، 5٪ ثاني أكسيد الكربون، والرطوبة 100٪.
في اليوم التالي، يتم تحقيق التقاء 50 إلى 70٪. Cotransfect الخلايا مع مزيج من ميكروغرام واحد من pCCL-6HF في كل مكان مثل أو pCCL-GFP، ميكروغرام واحد من برنامج تلفزيوني VG، وم ميكروغرام واحد من ناقلات مساعد دلتا باستخدام كاشف transfection وبروتوكول لإنتاج فيروس العدس. بعد ست ساعات من التهيّم، غيّر الوسيط إلى واحد جديد يقابل وسائل الخلايا التي سيتم تحويلها.
بذور الخلايا التي سيتم تحويلها في لوحة ستة جيدا مع وسائل الإعلام الثقافة القياسية من أجل الحصول على 10 إلى 20٪ التقاء في اليوم التالي. بعد 24 ساعة من عملية التنا نقل المواليد، استرجع الوسيط الذي يحتوي على جزيئات العدسي، وتصفية باستخدام مرشحات 0.45 ميكرون. استبدال وسط الخلايا التي سيتم تحويلها بواسطة المتوسطة المصفاة التي تحتوي على فيروسات العدسية.
احتضان الخلايا مع فيروسات العدس لمدة 24 إلى 72 ساعة في حاضنة في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون، ومن ثم تغيير المتوسطة مع الطازجة، واحدة القياسية. تحقق من تعبير GFP باستخدام مجهر فلوري مقلوب لتقييم كفاءة النقل. إذا لم يتم الكشف عن الفلوريس، انتظر لمدة يومين إلى ثلاثة أيام إضافية.
إذا كان التحكم في GFP إيجابيًا مع الفلورس الخضراء ، قم بزراعة جميع الخلايا حتى يكون لديها ما يكفي لتنفيذ تحكم تعبير 6-THE-FLAG ubiquitin-like بواسطة الفلوروسين المناعي ، كما هو موضح هنا ، واللطخة الغربية باستخدام الأجسام المضادة لـ FLAG. بعد زراعة الخلايا في أطباق 15 سنتيمترًا ، اغسل أطباق الثقافة مرة واحدة على الأقل مع محلول ملحي مؤقت بالفوسفات في درجة حرارة الغرفة. لبدء تحلل الخلايا، إضافة ملليلتر اثنين من العازلة واحدة في كل طبق 15 سنتيمترا في درجة حرارة الغرفة.
استخدام مكشطة الخلية لاسترداد جميع lysates في أنابيب أجهزة الطرد المركزي المخروطية 50 ملليلتر. Sonicate lystates ثلاث مرات لمدة 30 ثانية ، مفصولة وقفة لمدة دقيقة واحدة. الطرد المركزي في lysates سونيكات في 15، 000 مرات ز لمدة 15 دقيقة.
نقل المُنَتَكّير إلى أنبوب جديد من خلال مُزاج خلايا 40 ميكرون. من المهم جدا لتصفية lysates بعد صوتنة والطرد المركزي. عدم القيام بذلك قد يؤدي إلى copurification من العديد من البروتينات غير محددة، وبالتالي زيادة الخلفية وتقليل بقوة حجم ملف PTM.
نقل كمية مساوية من البروتين بين 50 و 100 ملليغرام إلى أنابيب فالكون الجديدة. إضافة النيكل أيون NTA الخرز في كل أنبوب مع كمية من اثنين microliters من الخرز لكل ملليغرام واحد من البروتين. ضع الأنابيب على دوار لتدويرها عند 30 دورة في الدقيقة لمدة ساعتين ونصف في درجة حرارة الغرفة.
ثم بيليه الخرز في 500 مرات ز لمدة خمس دقائق. غسل الخرز مع ملليلتر واحد من واحد العازلة، ونقل العينات إلى أنبوب microcentuge 1.5 ملليلتر. ضع الأنبوب على الجليد.
غسل مرتين مع ملليلتر واحد من الجليد الباردة العازلة اثنين تحتوي على 10 ملليمتر imidazole. إلى البروتينات المرتبطة بالليوتي، أضف 600 ميكرولترات من العازلة الثانية التي تحتوي على إيميدازول 250 ملليمولار، وتدوير لمدة ساعتين في أربع درجات مئوية. بعد حنية الخرز عن طريق الطرد المركزي في 500 مرة ز لمدة دقيقة واحدة، ونقل supernatant إلى أنبوب جديد قبل تبريد 1.5 ملليلتر، وإضافة 50 ميكرولترات من الخرز المضادة للأجسام المضادة للجسم M2 العلم.
تدوير في 30 دورة في الدقيقة لمدة 2 1/2 ساعة في أربع درجات مئوية. ثم يغسل مرتين مع 500 ميكرولترات من العازلة اثنين، ثم مرتين مع 500 ميكرولترات من العازلة ثلاثة. ل elution النهائي، إضافة 100 ميكرولترات من العازلة ثلاثة تحتوي على ببتيد FLAG في 0.01 ميكروغرام لكل ميكرولتر، وتدوير في أربع درجات مئوية لمدة 1 1/2 ساعة.
بعد الطرد المركزي في 500 مرة ز لمدة دقيقة واحدة، ونقل عظمى إلى أنبوب جديد قبل التبريد. اتخاذ 10 ميكرولترات لتحميل على SDS-PAGE، وتنفيذ تلطيخ الفضة من هلام للسيطرة على جودة تنقية. إذا كانت تنقية تبدو جيدة، وتحليل 90٪ اليسار من قبل LC-MS.
لتنفيذ التطبيع، استخدم الصيغ لتطبيع القيم بين الخلايا المعالجة بالعقاقير والخلايا غير المعالجة في كل مكان وGFP. لإزالة الخلفية، اطرح القيم في عينة التحكم GFP من القيم في عينات ubiquitin، للحصول على قيم محددة لكل بروتين محدد في كلتا الحالتين. للحصول على اختلاف في كل مكان، الحصول على درجة بين ناقص 100 زائد 100 للتغيرات الإيجابية والسلبية من PTMs الناجمة عن المخدرات.
يتم تقسيم الفرق بين القيم المحددة للعينات المعالجة وغير المعالجة على مجموع جميع القيم، بما في ذلك تلك الموجودة في عنصر التحكم، ويتم ضربها في 100. الاختلافات تحت ناقص 50، تمثل قمع PTM، أو فوق 50، تمثل تحريض PTM، تعتبر كبيرة. استخدم هذه الصيغة للحصول على قيمة ثقة بين صفر و100٪ القيم فوق 50 عادة ما تعتبر واثقة.
للحصول على توزيع أفضل لقيم الحث والقمع، وللحصول على المعلمات المختلفة والثقة، استخدم هذه الصيغة لمضاعفة قيم التباين والثقة. في هذه الدراسة، تم تحقيق نقل الخلايا الثديية الثقافة لإنشاء GFP و 6-الهستيدين العلم في كل مكان التعبير عن الخلايا. تم التحكم في فعالية عملية نقل فيروسات العدسي لأول مرة من خلال النظر إلى الفلورية GFP للخلايا المستحثة بواسطة GFP.
تم التعبير عن FLAG-ubiquitin عن طريق تلطيخ الفلوروس المناعي باستخدام جسم مضاد لـ FLAG ، مما يظهر النسبة المئوية للخلايا المستحثة. من أجل السيطرة على مستوى التعبير من خارجية FLAG-ubiquitin، تم تحليل lysates من الخلايا المستحثة من قبل SDS-PAGE تليها لطخة الغربية مع الأجسام المضادة العلم. بعد تنقية البروتينات في كل مكان، تم استخدام 10٪ من elution النهائي للسيطرة على كمية وسلامة المواد النقية من قبل SDS-PAGE والفضة تلطيخ الجل.
خلفية GFP عينة الطرح حددت 364 البروتينات في كل مكان بشكل ملحوظ مع درجة أعلى من 50٪ تم إجراء تحليل إثراء مجموعة الجينات من هذه البروتينات في كل مكان من أجل تسليط الضوء على العمليات البيولوجية التي كانت تشارك فيها. شبكات التفاعل المحتملة التي شكلتها التغييرات التي يسببها gemcitabine في كل مكان. وأدى ذلك إلى تحديد الشبكات التفاعلية الوظيفية التي تتأثر بشدة بزيادة أو نقصان انتشار البروتينات المعنية.
كما تم التأكيد على أن انتشار PCNA ازداد بعد العلاج gemcitabine. من المهم جدا تجنب نقل بعض الخرز بعد كل من الخطوات elution، لأنه قد يؤدي إلى زيادة كبيرة في الخلفية. وسيولد هذا الإجراء تعديلات محددة بعد تحويلها، مما يتيح، بمقارنة الظروف المختلفة، تحديد تعديلات محددة.
وستكون الخطوة التالية الأولى هي التحقق من صحة تغيرات الاهتمام على الأقل استناداً إلى النهج الكيميائية الحيوية. لقد طورنا هذه الطريقة لاستكشاف التعديلات القائمة على أساس ubiquitin ، بعد الترجمة من أجل تحديد طرق وآليات جديدة للخلايا السرطانية البنكرياس. منذ هذا البروتوكول وغيرها من المتقدمة في جميع أنحاء العالم وقد استخدمت بنجاح لفك العمليات البيولوجية المختلفة.
يجب استخدام فيروسات العدس على الأقل في مختبر BL-2. غوانيدين هو وكيل denaturing قوية ويجب استخدامها بعناية. يمكن أن تكون أيضا sonicator ضارة للآذان ويجب أن تستخدم بعد التوصيات.
