Yazarlar Portekiz Bilim ve Teknoloji Vakfı (FCT), Avrupa Birliği, Quadro de Referência Estratégico Nacional (QREN), Fundo Europeu de Desenvolvimento Regional (FEDER) ve Programa Operacional Factores de Competitividade'ye (COMPETE) UnIC (UID/IC/00051/2013) araştırma birimini finanse ettiği için teşekkür ediyor. Bu proje FEDER tarafından COMPETE 2020 - Programa Operacional Competitividade E Internacionalização (POCI), DocNET (NORTE-01-0145-FEDER-000003), Norte Portugal bölgesel operasyonel programı (NORTE 2020) tarafından desteklenen, Portekiz 2020 ortaklık anlaşması kapsamında desteklenmiştir, Avrupa Bölgesel Kalkınma Fonu (ERDF), PROJE NETDIAMOND (POCI-01-0145-FEDER-016385), Avrupa Yapısal Ve Yatırım Fonları, Lizbon bölgesel operasyonel programı 2020 tarafından desteklenen. Patrícia Rodrigues FCT (SFRH/BD/96026/2013) ve João Almeida-Coelho tarafından finanse edildi Universidade do Porto/FMUP ve FSE-Fundo Social Europeu, NORTE 2020-Programa Operacional Regional do Norte, (NORTE-08-5369-FSE-000024-Programas Doutorais).

Tüm hayvan deneyleri Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu (NIH Yayın no. 85-23, revize 2011) ve Portekiz hayvan refahı yasasına (DL 129/92, DL 197/96; P 1131/97). Yetkili yerel makamlar bu deneysel protokolü onayladılar (018833).
1. Stok çözeltisi hazırlama (Tablo 1)
<ol><li>Tablo 2'dekitalimatları izleyerek kardiyomiyositlerin izolasyonu (RELAX-ISO) için 1.000 mL rahatlatıcı çözelti hazırlayın. Yukarıdaki reaktifi ≈500 mL olarak eritin ve koh ile pH'ı 7.0'a ayarlayın. Son hacmi 1000 mL'ye ayarlayın.<ol>
<li>RELAX-ISO'yi 50 mL tüplerhalinde dağıtın. -20 °C'de saklayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Tablo 3'tekiyönergeleri izleyerek 250 mL etkinleştirme çözeltisi hazırlayın. Yukarıdaki reaktifleri 100 mL ≈ ultra saf suda çözün. 15 °C'de 5 M KOH ile pH'ı 7,1'e ayarlayın. NOT: Genellikle istenilen pH'a ulaşmak için önemli miktarda KOH eklemek gerekir. Çözeltiyi 15 °C'ye kadar soğutmak için hacimbaliyi buzlu bir kutuya koyun.<ol>
<li>Son hacmi 250 mL'ye ayarlayın. Bu çözeltiyi rahatlatıcı çözeltiile karıştırma anına kadar manyetik karıştırıcı ile sürekli olarak karıştırın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Tablo 4'tekitalimatları izleyerek 100 mL rahatlatıcı çözelti hazırlayın. Yukarıdaki reaktifleri 50 mL ≈ ultra saf suda çözün. 15 °C'de KOH 5 M ile pH'ı 7,1'e ayarlayın. NOT: Genellikle, 7.1 bir pH ulaşmak için KOH önemli miktarda eklemek için gereklidir. Çözeltiyi 15 °C'ye kadar soğutmak için hacimbaliyi buz dolu bir kutuya yerleştirin. Ölçümler sırasında kullanılan çözeltilerin iyonik mukavemeti 180 mM olarak hesaplandı.<ol>
<li>Son hacmi 100 mL'ye ayarlayın. Bu çözeltiyi aktive solüsyonu yla karıştırma anına kadar manyetik karıştırıcı ile sürekli olarak karıştırın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>5.0 ile 6.0 arasında pCa çözeltisi elde etmek için Tablo 5'te sunulan oranlarda etkinleştirme ve rahatlatıcı çözümleri karıştırın.<ol>
<li>Her ikisini de karıştırırken her zaman rahatlatıcı ve aktive edici çözümler tutun.</li>
		<li>Aliquot her karışımı 2 mL mikrotüpler için. Tüm mikrotüpleri -20 °C'de saklayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Her protokol için farklı bir pCa çözeltisi (4,5 ila 6,0) hazırlayın.</li>
</ol>2. Kuvvet transdüserinin kalibrasyonu
NOT: Kuvvet dönüştürücüsünün kalibrasyonu, birkaç ayda bir veya kalibre edilmemiş olduğundan şüphelenilen rutin bir işlemdir. Kuvvet dönüştürücüsi son derece hassastır ve kolayca kırılır. Kalibrasyon, kardiyomiyosit yapıştırma ve temizlik dahil olmak üzere kullanımının her aşamasında nazikçe ele alınmalıdır.
<ol><li>Kuvvet dönüştürücüsünün diğer cihazdan ayrılması.</li>
	<li>Bir kelepçe yardımıyla, kuvvet transdüserini yatay olarak, iğnenin aşağıya doğru, kardiyomiyositin kuvvet geliştireceği yöne doğru işaret edecek şekilde yerleştirin. Bu bilinen ağırlıkları (elastik bant, dikiş veya pin) ile kitlelerin bir dizi asılı kolaylaştıracaktır. NOT: Ölçek faktörünün [mg/volt] kontrol etmek ve transdüser üzerinde aşırı ağırlıktan kaçınmak için bu adıma geçmeden önce kuvvet transdüserinin özelliklerini kontrol edin. Kuvvet transdüser modeli için, ölçek faktörü 50 (50 mg 1 volta karşılık gelir) ve biz 12.5 ve 250 mg arasında 5 ağırlıkkullanın.</li>
	<li>Kuvvet dönüştürücü açın ve 30 dakika boyunca ısınmaya bırakın.</li>
	<li>Kuvvet transdüserinin üzerine daha hafif kütleyi asarak ve FORCE OUT'ta ölçülen ilgili voltajı kaydederek başlayın.<ol>
<li>Bu yordamı en fazla beş ağırlık için tekrarlayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Kuvvet transdüserine (yük) uygulanan çizim kuvveti gerilime karşı ve doğrusalolup olup olup olduğunu kontrol edin.</li>
	<li>Doğrusallık yoksa, sıfırı ayarlayın ve transdüserin devre kartında potansiyometre kazanın. Daha fazla bilgi için kendi özel yönergesini kontrol edin.<ol>
<li>Çıkış gerilimi 0,0 V okuyana kadar sıfır potansiyometreyi çevirin.</li>
		<li>Transdüser iğneüzerinde orta ağırlık tave ilgili voltajı okumak için kazanç potansiyometresini ayarlayın (örneğin, 50 mg 1 V'e karşılık gelir). Ağırlığı çıkarın ve sıfır potansiyometresini 0,0'a yeniden ayarlayın.</li>
		<li>2.6.2 adımını ağırlıklı ve ağırlıksız çıkış doğru olana kadar tekrarlayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Kuvvet dönüştürücüsi aparata geri monte edin.</li>
</ol>3. Deneysel aparatın ayarlanması
<ol><li>Aktive edici, 4.5, 5.0, 5.2, 5.4, 5.6, 5.8, 6.0 ve rahatlatıcı çözeltilerin her birinin bir şişesini eritin ve buzüzerinde saklayın. NOT: ATP ve PCr soğuk sıcaklıklarda muhafaza edilmesi gereken labile bileşiklerdir.</li>
	<li>Mikroskobu, test cihazlarını ve ilgili bilgisayarı kullanıma hazırlayın (Şekil 1).</li>
	<li>Sıcaklığı, oda içi termometrenin 15 °C'yi okuyuyacak şekilde ayarlayın. Kiaz ve fosfataz kuluçkaları (20 °C) dışında tüm deneyleri bu sıcaklıkta gerçekleştirin.</li>
	<li>Kuvvet dönüştürücüve motoru açın.</li>
</ol>4. Derili kardiyomiyositlerin çıkarılması ve permeabilizasyonu
<ol><li>RELAX-ISO çözeltisinin 50 mL'lik buzunu çözün.</li>
	<li>Santrifüju açın ve 4 °C'ye kadar hızlı bir şekilde soğutun.</li>
	<li>2,5 mL RELAX-ISO çözeltisi içeren petri kabında 3-5 μg miyokardiyal numunenin çözülmesi.</li>
	<li>Bir neşter bıçak(Şekil 2)ile küçük parçalar halinde doku kesin. Gereksiz hücre hasarını önlemek için numuneyi kesin bir şekilde kesin olarak kesin olarak kesin.</li>
	<li>Relax-ISO çözeltisinin 2,5 mL'lik kısmını, kesilmiş pipet ucu kullanarak bir Potter-Elvehjem camına aktarın.</li>
	<li>Mekanik 30-40 rpm bir dönüş hızında bir öğütücü ile doku bozabilir. Iyi bir hücre süspansiyonu elde etmek için 2'şer s'lik için 3 kez dokuya basın.</li>
	<li>RELAX-ISO çözeltisinde %10 Triton (250 μL Triton, 2,25 mL RELAX-ISO) 15 mL'lik bir tüpte hazırlayın ve bu çözümü hücre süspansiyonuna ekleyin.</li>
	<li>Tüpü 3 kez ters çevirerek hafifçe karıştırın.</li>
	<li>1 dk ve buz üzerinde 4 dakika oda sıcaklığında kuluçka.</li>
	<li>15 mL'lik tüpün tepesine RELAX-ISO ekleyerek Triton'u yıkayın; yavaşça karıştırma (tüpün 3 katı ters çevirme) ve son olarak hücreleri açılı bir santrifüjde (348 x g'de1 dk) aşağı doğru döndürür. Hücre peletinin üzerinde 3 mL'ye kadar süpernatantı çıkarın. NOT: Hücre peletini rahatsız etmemek için süpernatant'ı hafifçe çıkarın. Yine de, supernatant bazı hücreler kaçınılmaz olarak kaybolur.</li>
	<li>Adım 4.10'u en az 4 kez veya Triton artıkları tarafından üretilen kabarcıklar gözlenenekadar tekrarlayın. NOT: Daha fazla yıkama adımları yapılır, daha fazla hücre atılır supernatant ile kaybolur.</li>
	<li>Son yıkamada, 5-10 mL hücre süspansiyonuna kadar süpernatantı çıkarın.</li>
</ol>5. Derili kardiyomiyositseçimi ve yapıştırma
<ol><li>Mikroskop kaydırağı tutucusundaki cam bir kaydıranın üzerine bir kapak kapağına hücre süspansiyonu damlası koyun (Şekil 1).</li>
	<li>İyi bir striation desen ve boyutu ile tek bir çubuk şeklinde kardiyomiyosit seçin(Şekil 2).</li>
	<li>Ters mikroskobun en düşük büyütmesini kullanarak kuvvet dönüştürücünün ve motorun iğne uçlarını bulun.</li>
	<li>Kapak kaymasını seçili kardiyomiyositi yatay olarak konumlandıracak şekilde döndürün, böylece uçları kuvvet transdüserinin ve motorun iğnesiyle hizalanır(Şekil 2).</li>
	<li>Bir bez ucu yardımı ile kapak kapağının yan tarafına ince bir tutkal hattı yerleştirin(Şekil 2).</li>
	<li>Her iki uç etrafında bir tutkal hale oluşturmak için kuvvet transdüser ve motor tutkal hattı içine iğne uçları batırın. NOT: 5.6 - 5.10 adımları motorlu mikropozisyonerlerin dikkatli kullanımı ile gerçekleştirilir.</li>
	<li>İğne uçlarını kardiyomiyositin odak düzlemine yakın bir şekilde hareket ettirin.</li>
	<li>Kuvvet transdüserinin iğne ucunu aşağı doğru hareket ettirin, böylece kardiyomiyositin bir kenarına yapıştırın.</li>
	<li>Motorucu ucu ve hücrenin diğer ekstremite ile bu işlemi tekrarlayın. NOT: Tutkal çok hızlı kür başlar gibi bu işlem az 2-3 dakika sürmelidir.</li>
	<li>5-8 dk sonra, hücreyi kapak kaymasına yapıştırmaktan kaçınmak için iğneleri ≈ 15 μm kaldırın. Bu aynı anda her iki mikromanipülörler yukarı hareket ederek yapılır.</li>
	<li>Tutkal tedavi etsin. Bu işlem tutkal türüne bağlı olarak 15 ila 45 dakika sürebilir. Bizim durumumuzda, kardiyomiyosit yeterli 15 dakika ≈ sonra yapıştırılmış.</li>
</ol>6. Aktif, pasif ve Ca2+ hassasiyetinin kayıt kuvveti ölçümleri
<ol><li>İlk deneysel kuyuyu rahatlatıcı solüsyon (deneysel cihazda 55-100 μL) ve ikinci deneysel kuyuyu da etkinleştirme solüsyonu ile doldurun.</li>
	<li>Kamera yazılımını kullanarak, ilgi alanını (ROI) kardiyomiyositin açık bir striasyon deseni ile bir alana yerleştirin. NOT: Kardiyak miyositlerde ameliyat sarcomere uzunluğu 1,8 ile 2,2 μm arasında değişir ve optimal sarcomere uzunluğu 2,15 μm civarındadır.</li>
	<li>Optimal sarcomere uzunluğu ayarlandıktan sonra kardiyomiyositin iki uç noktası arasındaki mesafeyi (motordan transdüser tutkal halesine, Şekil 3)ölçün (2,2 μm). Değeri yazılımdaki miyosit uzunluğu olarak kaydedin.</li>
	<li>Ölçü kardiyomiyosit genişliği ve derinliği, hücreye dik yerleştirilen bir prizma ayna yardımı ile ikinci. NOT: Prizma yoluyla hücreyi görselleştirmek için güçlü, harici bir ışık kaynağı gerekir. Prizma olmaması ve kardiyak hücrelerin eliptik bir şekle sahip olduğu varsayılsa kardiyomiyosit derinliği kardiyomiyosit genişliğinin %70'i olarak çıkarılabilir.</li>
	<li>Kardiyomiyositin eliptik bir şeklini varsayarak kesit alanını (CSA, mm2)hesaplayın. <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/60427/60427eq1.jpg"></li>
	<li>Mikroskop aşamasını yavaşça hareket ettirin, böylece hücre kapak kaymasından sahne nin arkasında rahatlatıcı bir çözüm içeren kuyuya hareket eder. NOT: Bu yordam hücreye kolayca zarar verebilir. Hücreyi hareket ettirmeden önce iğneleri hafifçe biraz daha yukarı doğru hareket ettirin. Hücreyi çözeltiden çıkarmaktan kaçının.</li>
	<li>Hücre Ca2+ çözeltisinde ve rahatlatıcı çözeltide ortaya çıktığında ortaya çıkacak olan iki hücre kısaltması (başlangıç uzunluğunun %80'i) içeren yazılımdaki protokolü seçin (Şekil 1, Ek Dosya). NOT: Hücrenin ilk "Bolluk" aktive çözeltisi içinde, ikinci "Bolluk" rahatlatıcı çözelti içinde yapılacaktır. Bunu yaparak, kullanıcı hücrenin toplam kuvvetini (Ftoplamı)1'inci sinden ve pasif kuvvetini (Fpasif)2'den hesaplayabilecektir. Aktif kuvveti hesaplamak için formülü kullanın, Faktif = Ftoplamı - Fpasif. Hücre, tüm çapraz köprülerkayıt kuvvetini ayırmak için %80 kısaltılmış.</li>
	<li>Mikroskop evresini hareket ettirerek isometrik daralmayı önbelirterek kardiyomiyositin rahatlatıcı çözeltiden aktive solüsyonuna doğru hareket etmesini sağlar (pCa=4.5(1)). NOT: Hücre işlevselse, hemen daralan.</li>
	<li>Kuvvet platosu'na ulaştıktan sonra, kuvvet verilerini kaydetmeye başlayın. NOT: Testler ayrı ayrı yapılabilir. Yazılıma bağlı olarak, Ca2+duyarlılık protokolü içinde farklı Ca2+ çözümlerine karşılık gelecek bir dizi test oluşturma imkanı vardır (Şekil 1, Ek Dosya).</li>
	<li>~10 s bekleyin ve sonra etkinleştirme çözeltisi batırılmış hücre değiştirin. NOT: Hücreyi rahatlatıcı bir solüsyona batırmadan önce 10 s beklemek önemlidir. Hücre çok erken hareket ettirilirse, hücrenin yeniden geliştirme kuvvetini hesaplamak için önemli veriler (ktr değeri) kaybolabilir.</li>
	<li>Kardiyomiyositin rahatlatıcı solüsyonun içine dalmasını sağlayacak şekilde sahneyi hızlıca hareket ettirin.</li>
	<li>Test durana kadar bekleyin.</li>
	<li>6.8 - 6.12 adımlarını tekrarlayın, böylece hücre etkinleştirme çözeltisinde iki kez etkinleştirilir (pCa=4.5(2)). NOT: Tipik olarak, ilk aktivasyondan sonra, kardiyomiyosit uçları iğne uçlarından biraz ayrılabilir, kardiyomiyosit uzunluğu, CSA ve/veya sarcomere uzunluğu değiştirilebilir. İstediğiniz sarcomere uzunluğuna yeniden ayarlayın ve yazılımda düzeltilmiş boyutları tanıtın.<ol>
<li>Ca2+ duyarlılık protokolü için 6.13.2 adımını almaya devam edin veya hücrenin pasif ve aktif kuvvet değerleri gerekli olan tek parametreyse ve hücreyi iğnelerden ayırıp yapıştırıcıyı çıkarmak için asetonla temizliyorsa, verileri kaydedin.</li>
		<li>Gerekirse hücrenin sarcomere uzunluğunu tekrar hafifçe gererek 2,2 μm'ye ayarlayın.</li>
		<li>Etkinleştirme çözeltisini bir sonraki Ca2+ çözeltisi (burada 55-100 μL) değiştirin. Adımları 6,8 - 6,12'yi tekrarlayın.</li>
		<li>Etkinleştirme çözümlerini bir sonraki Ca2+ çözeltisi (burada 55-100 μL) değiştirin ve tüm çözümler test edilene kadar (5.0, 5.2, 5.4, 5.6, 5.8, 6.0) 6.8 - 6.12 adımlarını tekrarlayın.</li>
		<li>Son olarak, etkinleştirme çözeltisi (pCa4.5(3)) ile hücreyi yeniden etkinleştirin. Adımları 6.8- 6.12'yi tekrarlayın.</li>
	</ol></li>
</ol>7. Kinaz ve fosfatazlarla kuluçka
<ol><li>Seçilen temel protokolü uyguladıktan sonra, kizaz/fosfataz'ı önerilen konsantrasyonda gevşetin çözeltisinde seyreltin. NOT: Deneyden önce bir doz-yanıt eğrisi nin kullanılması önerilir.</li>
	<li>Deneysel kuyuların sıcaklığını 20 °C'ye ayarlayın.</li>
	<li>Deneysel kuyuları kiaz/fosfataz, rahatlatıcı çözelti ve aktive solüsyonu (55-100 μL) ile doldurun.</li>
	<li>Mikroskop aşamasını yavaşça hareket ettirin, böylece hücre kiaz/fosfataz içeren kuyuya daldırılır.</li>
	<li>Kardiyomiyositi en az 30 dakika veya üreticilerin talimatlarına göre kizaz/fosfataz ile kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Seçili taban çizgisi protokolünü yineleyin.</li>
</ol>8. Deneyin sonuçlandırılması
<ol><li>Hücreyi gererek güç transdüserve motor uçlarından kardiyomiyositun yapıştırın.</li>
	<li>Aseton batırılmış pamuklu bir bez kullanarak iğne uçlarından tutkal halesini dikkatlice çıkarın.</li>
	<li>Ekipmanları kapatın.</li>
</ol>9. Verilerin analizi
<ol><li>Test edilen her kardiyomiyosit tüm dosyaları toplamak. NOT: Her test bir dosyaya karşılık gelecektir. Bu, her Ca2+ çözümü veya sarcomere uzunluğu için karşılık gelen bir dosya olacağı anlamına gelir.</li>
	<li>Tek bir kardiyomiyositin aktif ve pasif kuvvetlerini hesaplayın.<ol>
<li>İlk etkinleştirmeye karşılık gelen dosyayı (pCa=4.5(1)) elektronik tablo kullanarak açın(Şekil 3A, Ek A Ek Dosya). NOT: Analizi gerçekleştirmek için özel yapım bir program kullandık. Lütfen Ek Dosyadaki Ek A'ya bakın.</li>
		<li>Ortalama ≈60 değer önce ve ortalama ≈60 değerleri hücrenin 1st bolluk sonra (hücre Ca2 + çözeltisi batırılmış zaman). Bu 2 değer sırasıyla a ve b'ye karşılık gelir.</li>
		<li>Hücrenin2.bolluk için aynı analizi tekrarlayın (hücre rahatlatıcı çözeltiye daldırıldığında). Bu 2 değer sırasıyla c ve d'ye karşılık gelir.</li>
		<li>a ve b arasındaki farkı hesaplayın (toplam kuvvet, Ftoplamı).</li>
		<li>c ve d (pasif kuvvet, Fpasif)arasındaki farkı hesaplayın.</li>
		<li>Aktif kuvveti hesapla, Faktif = Ftoplamı - Fpasif.</li>
		<li>Toplam gerilim (Ttoplamı),pasif gerilim (Tpasif)ve aktif gerilim (Taktif)elde etmek için tüm kuvvet değerlerini CSA'ya normalleştirin (yukarıdaki formüle bakın).</li>
		<li>2. aktivasyon için 9.2.1 ile 9.2.5 adımını tekrarlayın (pCa=4.5(2)).</li>
		<li>Bu değerleri, analiz altında kardiyomiyositin Ttotal, Taktif ve Tpasifini temsil eden değerler olarak düşünün. NOT: PCa4.5(1) ile hücrenin ilk aktivasyonu genellikle hücre boyutlarındaki değişikliklerle ilişkilidir. Bu nedenle pCa4.5 ile 2.</li>
		<li>Her dosya/pCa test edilmiş çözümler için 9,2.1 ile 9.2.5 adımlarını tekrarlayın (5.0, 5.2, 5.4, 5.6, 5.8, 6.0, 4.5(3)).</li>
	</ol></li>
	<li>Tek bir kardiyomiyositin pCa50 ve nHill'ini hesaplayın. NOT: Bu çözümleme için, 4.5(2), 5.0, 5.2, 5.4, 5.6, 5.8, 6.0 ve 4.5(3) dosyalarındaki normalleştirilmeyen Fetkin değerlerini kullanın.<ol>
<li>Test edilen her Ca2+ çözümü (4,5(2),5.0, 5.2, 5.4, 5.6, 5.8, 6.0, 4.5(3)) için fetkinin normalleştirilmeyen tüm değerlerini elektronik tablo dosyasına yerleştirin.</li>
		<li>Düzeltme faktörlerini hesaplayın = Fetkin [4.5(2)] - Fetkin [4.5(3)] / 7.</li>
		<li>Her Ca2+ çözümü (5.0, 5.2, 5.4, 5.6, 5.8, 6.0) için Düzeltilmiş Fetkin değerlerini, Fetkin - düzeltme faktörlerini çıkararak hesaplayın.</li>
		<li>Her Ca2+ çözeltisi için göreli kuvveti (Fgöreli)her Fetkin değerlerini ilgili düzeltilmiş değere göre normalleştirerek hesaplayın. NOT: F bağı [4.5(3)] 1'e eşit olmalıdır. Her deneysel protokol, Ca2+ konsantrasyonu (pCa 4.5(2) ve 4.5(3)) ile başlayan ve kontrol aktivasyonu ile sona erer. Bu kuvvet normalleştirme ve maksimal Ca2 +aktif kuvvet (Fmax)değişikliklerin karşılaştırılması yoluyla preparatların özetinin değerlendirilmesi sağlar. Deneysel protokolün sonunda kardiyomiyosit ilk kasılmanın maksimum kuvvetinin en az %70'inden daha azını üretirse, bu hücre/ölçüm analizdışı edilmelidir.</li>
		<li>Aşağıdaki denklem F(Ca) = CanHill/ (Ca50nHill + CanHill)ile sigmoidal eğrisığacak şekilde Fbağıl ve ilgili pCa değerlerini kullanın.</li>
		<li>Yukarıda bahsedilen denklemden pCa ve nHill değerlerini tahmin edin.</li>
	</ol></li>
	<li>Tek bir kardiyomiyositin kuvvet yeniden geliştirme (ktr) oranını hesaplayın.<ol>
<li>1hücre bolluğundan hemen sonra değerlere karşılık gelen eğriye bir uyum gerçekleştirin.</li>
		<li>Eğrinin eğimini hesaplayın ve bu değer kuvvet yeniden geliştirme hızına karşılık gelecektir.</li>
		<li>Her Ca2+ çözümü için adım 9.4.1 ve 9.4.2'yi tekrarlayın. NOT: En düşük Ca-çözümleri için zayıf bir eğri uyumu elde edilecektir (R kare≤0.90).</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol>
	<li>Leite-Moreira, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stretch-induced+compliance:+a+novel+adaptive+biological+mechanism+following+acute+cardiac+load.">Stretch-induced compliance: a novel adaptive biological mechanism following acute cardiac load.</a> Cardiovascular Research. 114 (5), 656-667 (2018).</li><li>Falcao-Pires, I., Fontes-Sousa, A. P., Lopes-Conceicao, L., Bras-Silva, C., Leite-Moreira, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+myocardial+stiffness+by+&#946;-adrenergic+stimulation+-+its+role+in+normal+and+failing+heart.">Modulation of myocardial stiffness by &#946;-adrenergic stimulation - its role in normal and failing heart.</a> Physiological Research. 60 (4), 599-609 (2011).</li><li>Cokkinos, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Introduction to Translational Cardiovascular Research. , 371-387 (2015).</li><li>van der Velden, J., Stienen, G. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+Disorders+and+Pathophysiology+of+Sarcomeric+Proteins.">Cardiac Disorders and Pathophysiology of Sarcomeric Proteins.</a> Physiological Reviews. 99 (1), 381-426 (2019).</li><li>Garnier, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Attachment+procedures+for+mechanical+manipulation+of+isolated+cardiac+myocytes:+a+challenge.">Attachment procedures for mechanical manipulation of isolated cardiac myocytes: a challenge.</a> Cardiovascular Research. 28 (12), 1758-1764 (1994).</li><li>Brady, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+properties+of+isolated+cardiac+myocytes.">Mechanical properties of isolated cardiac myocytes.</a> Physiological Reviews. 71 (2), 413-428 (1991).</li><li>Falcao-Pires, I., Leite-Moreira, A. F., Cokkinos, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+20.">Chapter 20.</a> Introduction to Translational Cardiovascular Research. 20, 371-387 (2015).</li><li>Liang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Teaching+calcium-induced+calcium+release+in+cardiomyocytes+using+a+classic+paper+by+Fabiato.">Teaching calcium-induced calcium release in cardiomyocytes using a classic paper by Fabiato.</a> Advances Physiology Education. 32 (1), 1-10 (2008).</li><li>Roche, S. M., Gumucio, J. P., Brooks, S. V., Mendias, C. L., Claflin, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+Maximum+Isometric+Force+Generated+by+Permeabilized+Skeletal+Muscle+Fibers.">Measurement of Maximum Isometric Force Generated by Permeabilized Skeletal Muscle Fibers.</a> Journal of Visualized Experiments. (100), e52695 (2015).</li><li>Huxley, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle+structure+and+theories+of+contraction.">Muscle structure and theories of contraction.</a> Progress Biophysics and Biophysical Chemistry. 7, 255-318 (1957).</li><li>Sequeira, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergistic+role+of+ADP+and+Ca(2+)+in+diastolic+myocardial+stiffness.">Synergistic role of ADP and Ca(2+) in diastolic myocardial stiffness.</a> Journal Physiology. 593 (17), 3899-3916 (2015).</li><li>Edes, I. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rate+of+tension+redevelopment+is+not+modulated+by+sarcomere+length+in+permeabilized+human,+murine,+and+porcine+cardiomyocytes.">Rate of tension redevelopment is not modulated by sarcomere length in permeabilized human, murine, and porcine cardiomyocytes.</a> American Journal Physiology Regulatory Integrative Comparative Physiology. 293 (1), R20-R29 (2007).</li><li>King, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+intact+cardiac+myocyte+mechanics:+cross-bridge+and+titin-based+stress+in+unactivated+cells.">Mouse intact cardiac myocyte mechanics: cross-bridge and titin-based stress in unactivated cells.</a> Journal General Physiology. 137 (1), 81-91 (2011).</li><li>Hamdani, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocardial+titin+hypophosphorylation+importantly+contributes+to+heart+failure+with+preserved+ejection+fraction+in+a+rat+metabolic+risk+model.">Myocardial titin hypophosphorylation importantly contributes to heart failure with preserved ejection fraction in a rat metabolic risk model.</a> Circulation Heart Failure. 6 (6), 1239-1249 (2013).</li><li>Miranda-Silva, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+biventricular+alterations+in+myocardial+(reverse)+remodelling+in+aortic+banding-induced+chronic+pressure+overload.">Characterization of biventricular alterations in myocardial (reverse) remodelling in aortic banding-induced chronic pressure overload.</a> Scientific Reports. 9 (1), 2956 (2019).</li><li>Rodrigues, P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+myocardial+changes+induced+by+doxorubicin+in+the+nonfailing+dilated+ventricle.">Early myocardial changes induced by doxorubicin in the nonfailing dilated ventricle.</a> American Journal Physiology Heart Circulatory Physiology. 316 (3), H459-H475 (2019).</li><li>van der Velden, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alterations+in+myofilament+function+contribute+to+left+ventricular+dysfunction+in+pigs+early+after+myocardial+infarction.">Alterations in myofilament function contribute to left ventricular dysfunction in pigs early after myocardial infarction.</a> Circulation Research. 95 (11), e85-e95 (2004).</li><li>Wakili, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+potential+molecular+contributors+to+atrial+hypocontractility+caused+by+atrial+tachycardia+remodeling+in+dogs.">Multiple potential molecular contributors to atrial hypocontractility caused by atrial tachycardia remodeling in dogs.</a> Circulation: Arrhythmia Electrophysiology. 3 (5), 530-541 (2010).</li><li>Ait Mou, Y., le Guennec, J. Y., Mosca, E., de Tombe, P. P., Cazorla, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+contribution+of+cardiac+sarcomeric+proteins+in+the+myofibrillar+force+response+to+stretch.">Differential contribution of cardiac sarcomeric proteins in the myofibrillar force response to stretch.</a> Pflugers Archiv. 457 (1), 25-36 (2008).</li><li>Falcao-Pires, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diabetes+mellitus+worsens+diastolic+left+ventricular+dysfunction+in+aortic+stenosis+through+altered+myocardial+structure+and+cardiomyocyte+stiffness.">Diabetes mellitus worsens diastolic left ventricular dysfunction in aortic stenosis through altered myocardial structure and cardiomyocyte stiffness.</a> Circulation. 124 (10), 1151-1159 (2011).</li><li>Lim, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anthracyclines+induce+calpain-dependent+titin+proteolysis+and+necrosis+in+cardiomyocytes.">Anthracyclines induce calpain-dependent titin proteolysis and necrosis in cardiomyocytes.</a> Journal Biology Chemistry. 279 (9), 8290-8299 (2004).</li><li>Woulfe, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+Method+of+Isolating+Myofibrils+From+Primary+Cardiomyocyte+Culture+Suitable+for+Myofibril+Mechanical+Study.">A Novel Method of Isolating Myofibrils From Primary Cardiomyocyte Culture Suitable for Myofibril Mechanical Study.</a> Frontiers Cardiovascular Medicine. 6, 12 (2019).</li><li>Ait Mou, Y., Bollensdorff, C., Cazorla, O., Magdi, Y., de Tombe, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+cardiac+biophysical+properties.">Exploring cardiac biophysical properties.</a> Global Cardiology Science Practice. 2015, 10 (2015).</li></ol>

Yazarların çıkar çatışması yok.

Derili kardiyomiyositler kullanılarak kardiyak fonksiyonun in vitro değerlendirilmesi, fizyolojik (örn. esneme) ve patolojik bağlamda (örneğin, iskemi) kardiyomiyosit düzeyinde meydana gelen değişiklikleri açıklığa kavuşturmak için önemli bir tekniği temsil eder. Bu metodoloji, çözülmüş numunelerden elde edilen kardiyomiyositlerde fonksiyonu değerlendirmek için az miktarda miyokard igerektirecek gibi çeşitli avantajları vardır; türlerin geniş bir yelpazede kardiyomiyositler kullanarak (fareler13, sıçan1,14,15, tavşan16, domuz17, köpek18, kobay19 ve insan20) ve farklı kardiyak yerler, atria dahil, sol ve sağ ventriküller veya enfarktüs kalp belirli bir bölge. Ayrıca, bu teknik, kendi doğal yapılandırmasında düzenleyici ve kontraktil yapıların işlevini ölçerken Ca2 + ve enerji (ATP) belirli konsantrasyonları teslim sağlar.
Bu tekniğin basitliğine rağmen, bazı kritik adımlar vardır. Örnek toplama da dahil olmak üzere, başlangıçtan itibaren her adımın kalitesini garanti etmek esastır. Miyofilament proteinleri proteazlara duyarlıdır21. Bu nedenle numuneleri alındıktan hemen sonra sıvı nitrojende depolamak zorunludur. Daha önce dondurulmamış olan taze numuneler önemli ölçüde daha yüksek kuvvetler geliştirecektir, bu nedenle taze ve dondurulmuş numunelerde yapılan ölçümlerin aynı protokolde karıştırılması tavsiye edilmez. İkinci en kritik adım kardiyomiyositlerin çıkarılmasıdır. Bu işlem sırasında, çoğu zaman buz üzerinde örnek tutmak için çok önemlidir. Bir proteaz inhibitör kokteyl ekstraksiyon / permeabilizasyon sırasında protein bozulması riskini azaltmak için kullanılabilir22. Üçüncü olarak, bu adım göz ardı edildiğinde düşük kaliteli kardiyomiyositler belirttiğimiz için, numuneler hassas neşter hareketleri kullanılarak daha küçük parçalar halinde kesilmelidir. Triton yıkama arasında doğru dengeye sahip zor olduğu için başka bir kritik adım kardiyomiyosit yıkama olduğunu (hücre permeabilize ama ungluing teşvik) ve supernatant mümkün olduğunca çok sayıda hücre tutmak. Öncelikle her örnek, tür veya protokol için ekstraksiyon ve yıkama sayısını denemek önemlidir. Örneğin, elimizde, biz ZSF1 obez sıçan dokusu çıkarmalar yapıştırma sırasında bu hücreleri daha kaygan ama ölçmek için daha zor değil yapılan bir "yağlı" yönü olduğunu kaydetti. Bu sorunu aşmanın yolu, hayvan başına makul sayıda hücreye sahip olmak için daha fazla deney yapmaktı. Ayrıca, tutkal için iyi bir hücre seçmek için çok önemlidir, yani iyi bir striation ve makul uzunluğu ile. Kardiyomiyosit bu özelliklere sahip değilse, çoğunlukla iğne uçlarından kopacak veya no/düşük kuvvet geliştirecektir. Ayrıca kardiyomiyosit eki için doğru tutkal kullanmak önemlidir, yapıştırma zamanı ve iğne hücre yapıştırmak için etkinliğini göz önünde bulundurularak. Elimizde, silikon tutkal(Malzeme Tablosu)hızlı (10-15 dk) ve yeterince güçlü tedavileri. Son olarak, son kritik adım dikkatle hücre yapıştırma sonra kardiyomiyosit 5 dk kaldırma ile ilgilidir (coverslip hücre yapıştırma önlemek için) ve kuyulara taşımadan önce (mikroskop aşaması tarafından sürüklenen hücre önlemek için). Tablo 7, bu teknikle ilişkili sorun giderme olayını, altta yatan nedenleri ve sık karşılaşılan sorunların üstesinden gelmek için olası çözümleri özetler.
Bu yöntemin en önemli sınırlaması, miyofilament kontraktürünün ne kadar hızlı aktivhale/devre dışı bırakılamadığı gibi tüm soruları yanıtlayamamasıdır. In vivo ayarında, membran depolarizasyonu, hücre içi Ca2+ artışı ve miyofilamentlere difüzyonunun miyositlerin kasılması için gerçekleşmesi gerekirken, derili kardiyomiyositlerde Ca2+ miyofilamentlere difüzyon hücre Ca2+ çözeltisine batırıldığında hemen gerçekleşir. Ca2 + difüzyon Bu hızlı oranı aktivasyon / deaktivasyon analizi23miyofilamentler önyargı olacaktır.
Bu deneyler sıcaklık, çözelti pH, mekanik pertürbasyon (bolluk-re-stretch vs bolluk) ve hücre eki prosedürleri (pin kravat vs tutkal), tüm bu değişkenlerin ktr vekuvvetsarcomere uzunluğuna bağlı artış açısından literatür farklılıkları için muhasebe dahil olmak üzere farklı faktörler, etkilenir 4,12.
Tekniğin gelecekteki ilerlemesi, permeabilize kardiyomiyositler yerine sağlam fonksiyonel çalışmalar yapmayı içerir. Bu teknik kardiyomiyositler taze izole (daha önce dondurulmuş değil) güvenme dezavantajı vardır. Doğrudan bu metodoloji ile ilgili olmayan bir diğer önemli konu, ancak önemli ölçüde etkileyebilecek örnek dondurulmuş depolama maksimal dönemi ile ilgilidir. Özellikle, depo süresi boyunca miyofilament bozulma derecesini belirlemek zorunludur (yani, çıkarılan kardiyomiyositlerden elde edilen kaliteli fonksiyonel verileri sağlamak için dondurulmuş numunelerin ne kadar süreyle depolanabileceği).

Geleneksel olarak, miyokardiyal mekanik özelliklerin değerlendirilmesi papiller kaslar ve trabekülae1,2gibi çok hücreli preparatlar, çoğunlukla denenmiştir. Çok hücreli kardiyak kas şeritler hücrelerin heterojen bir nüfus içerir, oryantasyon ve kuvvet üretimi bilinmeyen bir desen ile kontraktil kardiyomiyositler de dahil olmak üzere, elektriksel aktivite ve stres / gerinim dağılımları yanı sıra çevreleyen bağ dokusu matris3,4. Kollajen olmadan bir hazırlık ve tek bir kardiyomiyosit içeren çok hassas ve kontrollü bir şekilde sarcomere uzunluğu ve çapraz köprü kontraktil özellikleri ölçümü sağlayacak5,6. Bu nedenle, son kırk yılda, çeşitli metodolojiler tek bir kardiyomiyositmekanik,kontraktil ve gevşeme özellikleri incelenmesine izin geliştirilmiştir 6,7. Bu hücrelerin kontraktil fonksiyonu kuvvetle sarcomere uzunluğu ve çapraz köprü bisiklet kinetikbağlıdır 3. Bu nedenle, sarcomere uzunluğu ve performansının yanı sıra çapraz köprü fonksiyonu ve kontraktil özelliklerinin değerlendirilmesine olanak sağladığı düşünüldüğünde, kas fonksiyonunu doğrudan tek izole kalp hücrelerinde araştırmak istenir. Ancak, μN düzeyinde kuvvet ölçümü kayıt ederken makul bir optik sarcomere çözünürlüğü ile fonksiyonel kardiyomiyositlerin izole edilmesi ve takılması hala zorlu ve gelişmekte olan3,6. Diğer zorluklar, kardiyomiyositleri yeni toplanan biyopsilerden ayırmak için kurulması gereken lojistiktir. Örneğin, insan biyopsilerinin tahmin edilemezliği deneylerin fizibilitesini tehlikeye atabilir.
Ayrıca, bilimsel prosedürler (3R ilkeleri) için hayvan deneyleri Değiştirme, Azaltma ve Arıtma ile ilgili etik kaygılar hücresel ve doku düzeyinde çalışma değişiklikleri teşvik var, tercihen insan biyopsileri, ya da küçük hayvan örnekleri. Gerçekten de karmaşıklığı daha küçük bir düzeyde in vitro kardiyak fonksiyon değerlendirmek için metodolojilerin ilerici bir arıtma tüm vücuda sonuçların uygun entegrasyonu sağlar ve klinik senaryo7bunları çevirmek . Kardiyomiyosit leri çıkarmak için -80 °C'de saklanan numunelerin kullanılması cazip bir alternatif olabilir.
Miyokardiyal doku küçük parçalar halinde kesilir ve bir havan ve bir havaneli ile homojenize edilir. Bu homojenizasyon sonucu sarkolemal hasar değişen derecelerde derili paketlenmiş ve izole hücrelerin bir süspansiyon, miyoplazm banyo ortamına maruz ve tüm hücresel bileşenlerin yıkanır nerede. Sarkoliden daha uzaktaki miyofibriller gibi yapılar korunur. Böylece, sarcomere kısaltma ve miyofibrillar cihaz ile ilişkili fonksiyonel özellikleri bozulmadan tutulur ve 8kaydedilebilir,9.
Kardiyomiyosit kuvvet ölçüm sistemi, kardiyomiyosit uzunluğunu ayarlamak için kullanılan bir elektromanyetik motor ve izometrik kardiyomiyosit daralmasını ölçen bir kuvvet dönüştürücüden oluşur. Geçirimli veya derili kardiyomiyosit, rahatlatıcı bir solüsyon ([Ca2+] < 10 nM) içeren deneysel bir odaya yerleştirilir ve biri motora, diğeri de kuvvet transdüserine bağlı silikon lu 2 iğneye yapıştırılır. Kardiyomiyosit morfolojisi ve sarcomere uzunluğunu belirlemek için optik sistem kullanılır. Deneysel protokol genellikle farklı Ca2+ konsantrasyonları içeren tampon çözeltiler üzerine bir dizi kuvvet kaydı, aktin-miyozin çapraz köprü kinetiklerinin belirlenmesi ve önceden tanımlanmış sarcomere uzunluklarında atlı kardiyomiyositlerin pasif geriliminin ölçülmesinden oluşur(Şekil 1). Permeabilize kardiyomiyositlerin sıvı nitrojende dondurulmuş miyokardiyal numunelerden (ve daha sonra -80 °C'de depolanan) izolasyonu, kesit alanı başına maksimum Ca2+aktif (aktif) kuvveti (Taktif, kN-m-2), Ca2+-ölçümü için hücresel mekanik ve protein biyokimyası kullanan bir tekniktir. bağımsız(pasif)gerilim (T pasif , kN¡m-2), miyofilamentler Ca2+duyarlılık (pCa50),miyofilamentler cooperativity (nHill), kuvvet yeniden geliştirme oranı (ktr) yanı sıra Taktifsarcomere uzunluk bağımlılıkları , Tpasif, pCa50, nHill ve ktr.
Bu protokolün amacı, kardiyomiyosit kuvvet ölçüm sisteminin potansiyelini, farklı türlerden gelen dondurulmuş numunelerden izole edilmiş tek derili kardiyomiyositlerin fonksiyonel mekanik özelliklerini değerlendirmek için güvenilir bir prosedür olarak göstermek ve özetlemektir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>34580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#8217;-triphosphate disodium salt hydrate (Na2ATP)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2383</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium carbonate (CaCO3)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.02067.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>VWR</td>
			<td>24720.157</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2.6H2O)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.05833.0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride solution (MgCl2 1M)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M1028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N-Bis(2-hydroxyethyl)taurine (BES)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B9879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphocreatine dissodium salt hydrate (Na2PCr)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride (KCl)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.04936.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hydroxide (KOH)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>8.14353.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propionic acid (C3H6O2)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>8.00605.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone Squeeze Tube</td>
			<td>Marineland</td>
			<td>31003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tritiplex (EGTA)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.08435.0025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton&#174; X-100 10%</td>
			<td>Merck</td>
			<td>648463</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue homogeneizer (GKH GT Motor Control)</td>
			<td>Terre Haute Glas-col</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Length Controller ( Model 315C-I)</td>
			<td>Aurora Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Force Transducer (Model 403 A)</td>
			<td>Aurora Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software ASI 600A</td>
			<td>Aurora Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sotware VSL (Model 900B)</td>
			<td>Aurora Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Microscope (IX51)</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro assessment of cardiac function using skinned cardiomyocytes

Bu makalede, tek bir geçirimli ("derili") kardiyomiyositi izole etmek ve fonksiyonel çalışmalar yapmak için bir kuvvet ölçme aparatı ve bir motora takmak için gereken adımları açıklıyoruz. Bu çalışmalar kardiyomiyosit sertliği ölçümü (pasif kuvvet) ve farklı kalsiyum (Ca2 +)içeren çözeltiler ile belirlenmesine olanak sağlayacak, diğerleri arasında: maksimum kuvvet gelişimi, myofilament Ca2+duyarlılık (pCa50),cooperativity (nHill) ve kuvvet yeniden geliştirme oranı (ktr). Bu yöntem aynı zamanda doğrudan miyofilamentler üzerinde etkili olan ilaçların etkilerinin belirlenmesini ve eksojen rekombinant proteinlerin kardiyomiyositlerin hem aktif hem de pasif özellikleri üzerine ekspresyonunun belirlenmesini sağlar. Klinik olarak, derili kardiyomiyosit çalışmaları birçok miyokardiyal hastalığın patofizyolojisini vurgulamakta ve miyofilamentleri hedef alan terapötik müdahalelerin etkisinin in vitro değerlendirilmesi ne olanak sağlar. Bu teknik, açık kalp veya nakil cerrahisi sırasında elde edilen hayvan modellerinde in vitro ve in vivo parametreleri ile insan dokusu arasındaki korelasyonları araştırarak kardiyak patofizyolojinin açıklığa kavuşturulmasını sağlar.

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Assessment of Cardiac Function Using Skinned Cardiomyocytes at JoVE.com

In Vitro Assessment of Cardiac Function Using Skinned Cardiomyocytes

Bu protokol, derili kardiyomiyositler kullanılarak kardiyak fonksiyonun ekstraksiyon ve değerlendirilmesi tekniğini adım adım tanımlamayı amaçlamaktadır. Bu metodoloji, farelerden erkeklere kadar farklı kardiyak yerlerden toplanabilen küçük dondurulmuş biyopsiler kullanarak miyofilament fonksiyonunun ölçülmesine ve akut modülasyonuna olanak sağlar.

Derili Kardiyomiyositler Kullanarak Kardiyak Fonksiyonun İn Vitro Değerlendirilmesi

In this article, we describe the steps required to isolate a single permeabilized (&#34;skinned&#34;) cardiomyocyte and attach it to a force-measuring ...

in-vitro-assessment-of-cardiac-function-using-skinned-cardiomyocytes

Research

JoVE Journal

Medicine

5.9K Görüntüleme.  Universidade do Porto. Bu protokol, derili kardiyomiyositler kullanılarak kardiyak fonksiyonun ekstraksiyon ve değerlendirilmesi tekniğini adım adım tanımlamayı amaçlamaktadır. Bu metodoloji, farelerden erkeklere kadar farklı kardiyak yerlerden toplanabilen küçük dondurulmuş biyopsiler kullanarak miyofilament fonksiyonunun ölçülmesine ve akut modülasyonuna olanak sağlar.

Video: In Vitro Assessment of Cardiac Function Using Skinned Cardiomyocytes

Assessment of Cardiac Function and Energetics in Isolated Mouse Hearts Using 31P NMR Spectroscopy

Bioengineered mouse models have become powerful research tools in determining causal relationships between molecular alterations and models of cardiovascular disease. Although molecular biology is necessary in identifying key changes in the signaling pathway, it is not a surrogate for functional significance. While physiology can provide answers to the question of function, combining physiology with biochemical assessment of metabolites in the intact, beating heart allows for a complete picture of cardiac function and energetics. For years, our laboratory has utilized isolated heart perfusions combined with nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy to accomplish this task. Left ventricular function is assessed by Langendorff-mode isolated heart perfusions while cardiac energetics is measured by performing 31P magnetic resonance spectroscopy of the perfused hearts. With these techniques, indices of cardiac function in combination with levels of phosphocreatine and ATP can be measured simultaneously in beating hearts. Furthermore, these parameters can be monitored while physiologic or pathologic stressors are instituted. For example, ischemia/reperfusion or high workload challenge protocols can be adopted. The use of aortic banding or other models of cardiac pathology are apt as well. Regardless of the variants within the protocol, the functional and energetic significance of molecular modifications of transgenic mouse models can be adequately described, leading to new insights into the associated enzymatic and metabolic pathways. Therefore, 31P NMR spectroscopy in the isolated perfused heart is a valuable research technique in animal models of cardiovascular disease.

Assessment of Cardiac Function and Energetics in Isolated Mouse Hearts Using 31P NMR Spectroscopy

Langendorff-mode isolated heart perfusion, in conjunction with 31P NMR spectroscopy, combines the fields of biochemistry and physiology into one experiment. The protocol allows for the dynamic measurement of high energy phosphate content and turnover in the heart while concurrently monitoring physiologic function. When performed correctly, this is a valuable technique in the assessment of cardiac energetics.

Kalp Fonksiyonu ve Enerji Kullanımı İzole Fare Kalpler Değerlendirilmesi 31 P NMR Spektroskopisi

Bioengineered mouse models have become powerful research tools in determining causal relationships between molecular alterations and models of ...

Tıp

Assessment of Cardiac Function and Myocardial Morphology Using Small Animal Look-locker Inversion Recovery (SALLI) MRI in Rats

Small animal magnetic resonance imaging is an important tool to study cardiac function and changes in myocardial tissue. The high heart rates of small animals (200 to 600 beats/min) have previously limited the role of CMR imaging. Small animal Look-Locker inversion recovery (SALLI) is a T1 mapping sequence for small animals to overcome this problem 1. T1 maps provide quantitative information about tissue alterations and contrast agent kinetics. It is also possible to detect diffuse myocardial processes such as interstitial fibrosis or edema 1-6. Furthermore, from a single set of image data, it is possible to examine heart function and myocardial scarring by generating cine and inversion recovery-prepared late gadolinium enhancement-type MR images 1.
	The presented video shows step-by-step the procedures to perform small animal CMR imaging. Here it is presented with a healthy Sprague-Dawley rat, however naturally it can be extended to different cardiac small animal models.

Assessment of Cardiac Function and Myocardial Morphology Using Small Animal Look-locker Inversion Recovery SALLI MRI in Rats

Contrast enhanced cardiac magnetic resonance (CMR) imaging allows comprehensive in vivo assessment of the heart in small animal models of cardiovascular disease. Here we detail the procedures to perform CMR imaging, reconstruction and analysis using Small Animal Lock-Locker Inversion Recovery (SALLI) in rats.

Küçük Hayvan Bak-soyunma Ters Kurtarma (SALLI) Sıçanlarda MRI kullanarak Kalp Fonksiyonu ve Miyokard Morfoloji Değerlendirilmesi

Small animal magnetic resonance  imaging is an important tool to study cardiac function and changes in myocardial  tissue. The high heart rates of small ...

Assessment of Right Ventricular Structure and Function in Mouse Model of Pulmonary Artery Constriction by Transthoracic Echocardiography

Emerging clinical data support the notion that RV dysfunction is critical to the pathogenesis of cardiovascular disease and heart failure1-3. Moreover, the RV is significantly affected in pulmonary diseases such as pulmonary artery hypertension (PAH). In addition, the RV is remarkably sensitive to cardiac pathologies, including left ventricular (LV) dysfunction, valvular disease or RV infarction4. To understand the role of RV in the pathogenesis of cardiac diseases, a reliable and noninvasive method to access the RV structurally and functionally is essential.
A noninvasive trans-thoracic echocardiography (TTE) based methodology was established and validated for monitoring dynamic changes in RV structure and function in adult mice. To impose RV stress, we employed a surgical model of pulmonary artery constriction (PAC) and measured the RV response over a 7-day period using a high-frequency ultrasound microimaging system. Sham operated mice were used as controls. Images were acquired in lightly anesthetized mice at baseline (before surgery), day 0 (immediately post-surgery), day 3, and day 7 (post-surgery). Data was analyzed offline using software.
Several acoustic windows (B, M, and Color Doppler modes), which can be consistently obtained in mice, allowed for reliable and reproducible measurement of RV structure (including RV wall thickness, end-diastolic&#160;and end-systolic dimensions), and function (fractional area change, fractional shortening, PA peak velocity, and peak pressure gradient) in normal mice and following PAC.
Using this method, the pressure-gradient resulting from PAC was accurately measured in real-time using Color Doppler mode and was comparable to direct pressure measurements performed with a Millar high-fidelity microtip catheter. Taken together, these data demonstrate that RV measurements obtained from various complimentary views using echocardiography are reliable, reproducible and can provide insights regarding RV structure and function. This method will enable a better understanding of the role of RV cardiac dysfunction.

Right ventricle (RV) dysfunction is critical to the pathogenesis of cardiovascular disease, yet limited methodologies are available for its evaluation. Recent advances in ultrasound imaging provide a noninvasive and accurate option for longitudinal RV study. Herein, we detail a step-by-step echocardiographic method using a murine model of RV pressure overload.

Transtorasik Ekokardiyografi ile Pulmoner Arter Konstrüksiyon Fare Modeli sağ ventrikül yapı ve fonksiyonlarının değerlendirilmesi

Emerging clinical data support the notion that RV dysfunction is critical to the pathogenesis of cardiovascular disease and heart failure1-3. Moreover, ...

Transcutaneous Assessment of Renal Function in Conscious Rodents

Glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard to assess overall kidney function. However, traditional methods to evaluate GFR are cumbersome and time-consuming. In addition, serial blood or urine samples are required, with the associated stress for the experimental animals. A recent technique significantly reduces the investment in time and resources, minimizing the invasiveness and the animal stress, but being equally valid as the traditional approaches. The method measures transcutaneously renal function. Using an optical device and the exogenous renal marker fluorescein isothiocyanate (FITC)-sinistrin, this technique is capable of measuring the elimination kinetics of the marker through the skin. With neither blood nor urine samples nor the associated laboratory assays needed, the results of the transcutaneous measurement are almost instantaneously available. The method has been already validated in different species and successfully applied in several models of renal pathology. Moreover, due to its minimally invasive characteristics, it is suitable for sequential measurements within the same animal. Here is provided a detailed protocol to carry out the transcutaneous assessment of renal function in rodents.

Determination of glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard to assess overall kidney function. However, traditional procedures to measure this parameter are cumbersome and require a large investment of time. Here we describe a faster and minimally invasive method to determinate GFR transcutaneously.

Bilinçli Kemirgenler Böbrek Fonksiyon Transkutanöz Değerlendirmesi

Glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard to assess overall kidney function. However, traditional methods to evaluate GFR are cumbersome and ...

Preparation and In Vitro Characterization of Magnetized miR-modified Endothelial Cells

To date, the available surgical and pharmacological treatments for cardiovascular diseases (CVD) are limited and often palliative. At the same time, gene and cell therapies are highly promising alternative approaches for CVD treatment. However, the broad clinical application of gene therapy is greatly limited by the lack of suitable gene delivery systems. The development of appropriate gene delivery vectors can provide a solution to current challenges in cell therapy. In particular, existing drawbacks, such as limited efficiency and low cell retention in the injured organ, could be overcome by appropriate cell engineering (i.e., genetic) prior to transplantation. The presented protocol describes the efficient and safe transient modification of endothelial cells using a polyethyleneimine superparamagnetic magnetic nanoparticle (PEI/MNP)-based delivery vector. Also, the algorithm and methods for cell characterization are defined. The successful intracellular delivery of microRNA (miR) into human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) has been achieved without affecting cell viability, functionality, or intercellular communication. Moreover, this approach was proven to cause a strong functional effect in introduced exogenous miR. Importantly, the application of this MNP-based vector ensures cell magnetization, with accompanying possibilities of magnetic targeting and non-invasive MRI tracing. This may provide a basis for magnetically guided, genetically engineered cell therapeutics that can be monitored non-invasively with MRI.

Preparation and In Vitro Characterization of Magnetized miR-modified Endothelial Cells

This manuscript describes the efficient, non-viral delivery of miR to endothelial cells by a PEI/MNP vector and their magnetization. Thus, in addition to genetic modification, this approach allows for magnetic cell guidance and MRI detectability. The technique can be used to improve the characteristics of therapeutic cell products.

Hazırlık ve<em&gt; İn Vitro</em&gt; Mıknatıslanmış karakterizasyonu Endotel Hücreleri miR-modifiye

To date, the available surgical and pharmacological treatments for cardiovascular diseases (CVD) are limited and often palliative. At the same time, gene ...

Assessment of Human Adipose Tissue Microvascular Function Using Videomicroscopy

While obesity is closely linked to the development of metabolic and cardiovascular disease, little is known about mechanisms that govern these processes. It is hypothesized that pro-atherogenic mediators released from fat tissues particularly in association with central/visceral adiposity may promote pathogenic vascular changes locally and systemically, and the notion that cardiovascular disease may be the consequence of adipose tissue dysfunction continues to evolve. Here, we describe a unique method of videomicroscopy that involves analysis of vasodilator and vasoconstrictor responses of intact small human arterioles removed from the adipose depot of living human subjects. Videomicroscopy is used to examine functional properties of isolated microvessels in response to pharmacological or physiological stimuli using a pressured system that mimics in vivo conditions. The technique is a useful approach to gain understanding of the pathophysiology and molecular mechanisms that contribute to vascular dysfunction locally within the adipose tissue milieu. Moreover, abnormalities in the adipose tissue microvasculature have also been linked with systemic diseases. We applied this technique to examine depot-specific vascular responses in obese subjects. We assessed endothelium-dependent vasodilation to both increased flow and acetylcholine in adipose arterioles (50 - 350 &#181;m internal diameter, 2 - 3 mm in length) isolated from two different adipose depots during bariatric surgery from the same individual. We demonstrated that arterioles from visceral fat exhibit impaired endothelium-dependent vasodilation compared to vessels isolated from the subcutaneous depot. The findings suggest that the visceral microenvironment is associated with vascular endothelial dysfunction which may be relevant to clinical observation linking increased visceral adiposity to systemic disease mechanisms. The videomicroscopy technique can be used to examine vascular phenotypes from different fat depots as well as compare findings across individuals with different degrees of obesity and metabolic dysfunction. The method can also be used to examine vascular responses longitudinally in response to clinical interventions.

Videomicroscopy systems are used to examine functional properties of isolated adipose tissue arterioles in response to physiological and pharmacological stimuli. This technique can be used to examine microvascular phenotypes in different adipose tissue domains in obese humans.

İnsan yağ dokusu mikrovasküler işlevini kullanarak Videomicroscopy değerlendirilmesi

While obesity is closely linked to the development of metabolic and cardiovascular disease, little is known about mechanisms that govern these processes. ...

Normothermic Ex Situ Heart Perfusion in Working Mode: Assessment of Cardiac Function and Metabolism

The current standard method for organ preservation (cold storage, CS), exposes the heart to a period of cold ischemia that limits the safe preservation time and increases the risk of adverse post-transplantation outcomes. Moreover, the static nature of CS does not allow for organ evaluation or intervention during the preservation interval. Normothermic ex situ heart perfusion (ESHP) is a novel method for preservation of the donated heart that minimizes cold ischemia by providing oxygenated, nutrient-rich perfusate to the heart. ESHP has been shown to be non-inferior to CS in the preservation of standard-criteria donor hearts and has also facilitated the clinical transplantation of the hearts donated after the circulatory determination of death. Currently, the only available clinical ESHP device perfuses the heart in an unloaded, non-working state, limiting assessments of myocardial performance. Conversely, ESHP in working mode provides the opportunity for comprehensive evaluation of cardiac performance by assessment of functional and metabolic parameters under physiologic conditions. Moreover, earlier experimental studies have suggested that ESHP in working mode may result in improved functional preservation. Here, we describe the protocol for ex situ perfusion of the heart in a large mammal (porcine) model, which is reproducible for different animal models and heart sizes. The software program in this ESHP apparatus allows for real-time and automated control of the pump speed to maintain desired aortic and left atrial pressure and evaluates a variety of functional and electrophysiological parameters with minimal need for supervision/manipulation.

Normothermic ex situ heart perfusion (ESHP), preserves the heart in a beating, semi-physiologic state. When performed in a working mode, ESHP provides the opportunity to perform sophisticated assessments of donor heart function and organ viability. Here, we describe our method for myocardial performance evaluation during ESHP.

Normothermic Ex Situ kalp perfüzyon çalışma modu: değerlendirme kardiyak fonksiyon ve metabolizma

The current standard method for organ preservation (cold storage, CS), exposes the heart to a period of cold ischemia that limits the safe preservation ...

Echocardiographic Assessment of Cardiac Anatomy and Function in Adult Rats

The use of experimental animal models has become crucial in cardiovascular science. Most studies using rodent models are focused on two-dimensional imaging to study the cardiac anatomy of the left ventricle and M-mode echo to assess its dimensions. However, this could limit a comprehensive study. Herein, we describe a protocol that allows an assessment of the heart chamber size, left ventricular function (systolic and diastolic) and valvular function. A conventional medical ultrasound machine was used in this protocol and different echo views were obtained through left parasternal, apical and suprasternal windows. In the left parasternal window, the long and short axis were acquired to analyze left chamber dimensions, right ventricle and pulmonary artery dimensions, and mitral, pulmonary and aortic valve function. The apical window allows the measurement of heart chamber dimensions and evaluation of systolic and diastolic parameters. It also allows Doppler assessment with detection and quantification of heart valve disturbances (regurgitation or stenosis). Different segments and walls of the left ventricle are visualized throughout all views. Finally, the ascending aorta, aortic arch, and descending aorta can be imaged through the suprasternal window. A combination of ultrasound imaging, Doppler flow and tissue Doppler assessment have been obtained to study cardiac morphology and function. This represents an important contribution to improve the assessment of cardiac function in adult rats with impact for research using these animal models.

A non-invasive protocol for transthoracic echocardiography assessment of cardiac anatomy and function for adult rats is presented in the current study. The heart valves, all four cardiac chambers and the ascending aorta, aortic arch and descending aorta are studied in detail.

Erişkin Sıçanlarda Kardiyak Anatomi ve Fonksiyonun Ekokardiyografik Değerlendirilmesi

The use of experimental animal models has become crucial in cardiovascular science. Most studies using rodent models are focused on two-dimensional ...

Using a Chemical Biopsy for Graft Quality Assessment

Kidney transplantation is a life-saving treatment for a large number of people with end-stage renal dysfunction worldwide. The procedure is associated with an increased survival rate and greater quality of patient&#8217;s life when compared to conventional dialysis. Regrettably, transplantology suffers from a lack of reliable methods for organ quality assessment. Standard diagnostic techniques are limited to macroscopic appearance inspection or invasive tissue biopsy, which do not provide comprehensive information about the graft. The proposed protocol aims to introduce solid phase microextraction (SPME) as an ideal analytical method for comprehensive metabolomics and lipidomic analysis of all low molecular compounds present in kidneys allocated for transplantation. The small size of the SPME probe enables performance of a chemical biopsy, which enables extraction of metabolites directly from the organ without any tissue collection. The minimum invasiveness of the method permits execution of multiple analyses over time: directly after organ harvesting, during its preservation, and immediately after revascularization at the recipient&#8217;s body. It is hypothesized that the combination of this novel sampling method with a high-resolution mass spectrometer will allow for discrimination of a set of characteristic compounds that could serve as biological markers of graft quality and indicators of possible development of organ dysfunction.

The protocol presents utilization of the chemical biopsy approach followed by comprehensive metabolomic and lipidomic analysis for quality assessment of kidney grafts allocated for transplantation.

Greft Kalite Değerlendirmesi için Kimyasal Biyopsi Kullanımı

Kidney transplantation is a life-saving treatment for a large number of people with end-stage renal dysfunction worldwide. The procedure is associated ...

Semi-Minimal Invasive Method to Induce Myocardial Infarction in Rats and the Assessment of Cardiac Function by an Isolated Working Heart System

Myocardial infarction (MI) remains the main contributor to morbidity and mortality worldwide. Therefore, research on this topic is mandatory. An easily and highly reproducible MI induction procedure is required to obtain further insight and better understanding of the underlying pathological changes. This procedure can also be used to evaluate the effects or potency of new and promising treatments (as drugs or interventions) in acute MI, subsequent remodeling and heart failure (HF). After intubation and pre-operative preparation of the animal, an anesthetic protocol with isoflurane was performed, and the surgical procedure was conducted&#160;quickly. Using a minimally invasive approach, the left anterior descending artery (LAD) was located and occluded by a ligature. The occlusion can be performed acutely for subsequent reperfusion (ischemia/reperfusion injury). Alternatively, the vessel can be ligated permanently to investigate the development of chronic MI, remodeling or HF. Despite common pitfalls, the drop-out rates are minimal. Various treatments such as remote ischemic conditioning can be examined for their cardioprotective potential pre-, peri- and post-operatively. The post-operative recovery was quick as the anesthesia was precisely controlled and the duration of the operation was short. Post-operative analgesia was administered for three days. The minimally invasive procedure reduces the risk of infection and inflammation. Furthermore, it facilitates rapid recovery. The &#8220;working heart&#8221; measurements were performed ex vivo and enabled precise control of preload, afterload and flow. This procedure requires specific equipment and training for adequate performance. This manuscript provides a detailed step-by-step introduction for conducting these measurements.

This article presents an efficient method to perform myocardial ischemia and subsequent chronic reperfusion in rats using a minimally invasive approach. In addition, left ventricular hemodynamic function of rats is assessed by echocardiography and isolated working heart methods.&#160;

Sıçanlarda Miyokard İnfarktüsü İndükleyen Yarı-Minimal İnvaziv Yöntem ve İzole Çalışan Kalp Sistemi Ile Kardiyak Fonksiyonun Değerlendirilmesi

Myocardial infarction (MI) remains the main contributor to morbidity and mortality worldwide. Therefore, research on this topic is mandatory. An easily ...