Bu hücrelere elektromekanik stimülasyon uygulamak için bir yöntemdir. Bir hücre popülasyonu üzerindeki etkilerini incelemek için birden fazla uygulaması vardır, in vivo doğum için ön eğitim, ve hücre olgunlaşması. Bunun avantajı, steril viral bozulmadan tutarken aynı cihazla tek tek veya aynı anda elektriksel ve mekanik uyaranların uygulanabilmesidir.
Bu teknik tedavimize dolaylı bir yaklaşımdır. Hücre tedavisi elektromekanik uyarılmış hücreler intro-miyokardiyum tedavisinde ilginç bir hücre popülasyonu olabilir kabul edilir. Bu yöntem genellikle kardiyovasküler alana ait, ama aynı zamanda sinir sistemine uygulanabilir.
Bu sabır gerektiren kolay bir tekniktir. En zor kısmı, küçük parçalar ile çalışan olacak ve boyunca sterilite tutmak. Manipülasyon un açıklaması zor olan küçük ayrıntılar vardır, bu nedenle görsel gösteri gerçekten yararlıdır.
12 temizlenmiş PDMS yapısını steril 10 santimetre plakaya aktararak başlayın. Tam sterilizasyon sağlamak için plakaları beş dakika UV ışığına maruz bırakın. Sonra ayrı bir 35 milimetrelik hücre kültür plakası, ya da hemen hücre tohumlama için 6-iyi plakalar her yapı aktarın.
Hücre tohumlamaya başlamak için, ilk 1x PBS beş mililitre ile kardiyak ATDPCs bir confluent T75 şişesi yıkayın. Hücreleri ayırmak için, 0.05% tripsin-EDTA bir mililitre ekleyin. Ve 5 dakika boyunca 37 derecede kuluçkaya yat.
Sonra, tripsin-EDTA inaktive etmek için tam orta beş mililitre ekleyin. 15 mililitrelik bir tüp tüm müstakil hücreleri toplamak. Kalan hücreleri toplamak için hücre camı beş mililitre PBS ile iki kez yıkayın ve 15 mililitrelik tüp ekleyebilirsiniz.
Santrifüj 230 g'da 22 santigrat derecede beş dakika. Supernatant çıkarın ve tam orta iki mililitre hücreleri yeniden askıya ve hemositometre ile saymak. PDMS ile her plaka içine kardiyak ATDPC'lerin tohum 200 mikrolitre ertesi gün hücreler tarafından kapsanan tohumlama yüzeyinin yaklaşık% 80 elde etmek için oluşturur.
37 santigrat derecede kuluçkaya yat, ve %5 CO2. Yavaşça plaka başına önceden ısıtılmış tam orta 2 mililitre ekleyin. Hücreleri 37 santigrat derecede ve %5 CO2 gecede yapılarla kuluçkaya yatırın.
Bu prosedüre başlamadan önce, elektromekanik stimülasyon için 12 yapıdan altısını atayın ve uyarılmayan kontroller için altı tane bulundurun. Stimülasyon ünitesini temizlemek için %70 etanol kullanın. Stimülasyon ünitesini, steril elektrotları ve cımbızları akış kabininin içine yerleştirin.
Elektrotları ve yapıları kolayca manipüle etmek için, her hücre kültür plakasından ortamın %90'ını çıkarın. Hem sabit hem de mobil mıknatıslar arasında manyetik çekim sağlamak için PDMS yapılarını mıknatısa doğru doğru konuma yerleştirin. Hücrenin tohumlu PDMS yapılarını ve elektrotları manipüle ettiğiniz bu önceki iki adım, süreç boyunca steriliteyi tutarken en kritik olandır.
Daha sonra platin teli elektrot konektörlerine bağlayın. PDMS yapılarında belirlenen alanlarda elektrotların PTFE kısmını yönlendirin. Her yapıya 2,5 mililitre taze, önceden ısıtılmış komple orta ekleyin.
Tüm PDMS yapıları yerleştirildikten ve platforma elektriksel olarak bağlandıktan sonra, platformu 37 santigrat dereceye ve %5 CO2 kuluçka makinesine geri yerleştirin. Sonra elektrik ve mekanik kaynağı bağlayın. Stimülasyon programını yapılandırmak için, elektriksel uyarıcının kullanıcı arayüzleri ve mekanik stimülasyonun kontrol ettiği uygulama aracılığıyla elektriksel ve mekanik stimülasyon rejimlerini belirleyin.
Senkronizasyonu ayarlamak için elektrik uyarıcısını açın ve ana menünün ekranda görünmesini bekleyin. Ardından ikinci seçeneği, sırayı ve Enter'u seçin. Sıra menüsünü düzenlemek için, artı"yı tıklatarak geçerliyi seçmek için mod sekmesini kullanın ve "Dönem İçin" tuşuna basarak, artı/eksi ile 1000"i seçin ve tetik modu sekmesine basın, yazılımla harici seçeneğini belirleyin ve "Genlik sekmesi için" enter tuşuna basın, artı/eksi ile 1"i seçin ve Enter tuşuna basın"Sonra, ana menüde"Sonra, seçenek 4'ü seçin ve sonra sıra yı oluşturun ve kontrol uygulama panelinin mekanik stimülasyon bölümünde "Girin" tuşuna basın, önce artı dönem metin kontrolünde 10000 yazın."
Sonra mekanik darbe süresini ayarlamak için, ON zaman metin kontrolü 500 "yazın. Son olarak, %10 yapı uzaması sağlamak için gezi metin kontrolüne 2000"i yazın. Hücre ortamını, önce eski medyayı kaldırarak ve ardından PDMS desteğinin kenarlarına sıcak, taze ortam ekleyerek değiştirin.
Yedinci günde, deneyin sonunda, el yazmasında açıklandığı gibi örnekleri toplayın. Elektromekanik olarak uyarılmış kardiyak ATDPC'ler kardiyomiyojenik potansiyellerini artırdılar. Bu durum, özellikle kardiyak transkripsiyon faktörü GATA-4, yapısal marker beta-miyozin ağır zincir ve kalsiyuma bağlı gen Connexin43'ün erken ve geç kardiyak genlerin artan ekspresyonu gösteren gerçek zamanlı PCR ile endikeedildi.
Aktin liflerine karşı phalloidin boyama hücrelerin in çoğunluğu dikey desen göre hizalanmış olduğunu gösterdi. Connexin43 dağılımı çoğunlukla sitoplazmada ve plazma zarında, boşluk kavşakları aracılığıyla hücre içi iletişime katkıda bulundu. Kardiyak ATDPC'lerde çekirdeklerde MEF2 ve GATA-4 transkripsiyon faktörleri saptadı.
Ancak subkutan ATDPC'lerde GATA-4 saptanmadı. Sitoplazmik belirteçler SERCA2, ve sarkoerik alfa-aktin, kardiyomiyositler için tipik olgun bir sarcomere organizasyon göstermedi. Ve dayak kontrol ve uyarılmış hücre popülasyonları gözlenmedi.
Bu protokolün başında sağlıklı bir hücre monolayer ve prosedür boyunca sterilite tutmak çok önemlidir. Örnek toplama dan sonra standart genom protein ekspresyonu teknikleri yapılabilir. Bu teknik, hücre elektriksel ve/veya mekanik uyaranların etkisini daha iyi anlamamıza yardımcı olur.
Yakın zamana kadar, her iki stimülasyon için aynı cihazı kullanmak mümkün değildi, hangi sonuçları karşılaştırmak zor yaptı.
