Bu pratik ve tekrarlanabilir yöntem, sağlam bir fare içinde lökosit işe yol endotel lökosit etkileşimleri görselleştirmek için kullanılabilir. Bu teknik aynı zamanda lökosit işe in vivo içinde fizyolojik ve patofizyolojik süreçlerin izlenmesi için güçlü bir araç sunuyor. Yöntem farklı inflamatuar ve septik modellerde uygulanabilir.
Örneğin, son zamanlarda abartılı kas lökosit infiltrasyonu içeren kas çalışmaları alaka vurgulamıştır. Bu tekniği kullanmayı düşünen bilim adamlarına önerimiz, yöntemin küçük sapmalara karşı çok hassas olduğu kadar mümkün olduğunca çok pratik deneyim elde etmektir. Prosedürü gösteren Simon Kranig, benim laboratuarımdan bir klinisyen ve kıdemli bilim adamı olacak.
Anesteziye tabi deneysel hayvanayak tutam yanıt eksikliği doğruladıktan sonra, bir 37 derece Santigrat ısıtma yastığı üzerinde bir dorsal recumbent pozisyonda fare düzeltmek ve ön dişler etrafında basit bir döngü rüzgar için bir absorbe edilemez steril 6-0 dikiş kullanın. Sütürün birleştirme uçlarını ısıtma yastığına bantlayın ve orta hattaki deriyi hafifçe kaldırmak için cımbız kullanın. Daha sonra, boyun ve üst toraks üzerinde dairesel bir 1-2 santimetre çapında kesi yapmak ve dikkatle çevreleyen kas, yağ ve bağ dokuları incelemek için cımbız kullanın.
Nefes borusuna bir dikiş koy. Trakea içine yaklaşık 1,3 milimetre enine kesim yapmak ve üst hava yollarını güvenli hale getirmek için trakea kaudal ucuna bir polietilen tüp tanıtmak için küçük cerrahi makas kullanın. Tek bir dairesel düğüm sütür ile bulunan tüp düzeltmek ve trakea sağ tarafında karotis arter bulmak.
Karotis arter duvarından çevredeki dokuyu inceleyin ve arterin altına iki parça dikiş geçirin. İlk kranial sütür proksimalini karotis arterlerin çatallanmasına bağlayın ve ikinci sütürü ilk dikişten yaklaşık 5-8 milimetre distal olarak bağlamadan yerleştirin. Daha sonra, tuzlu su ile dolu bir mililitreşökum iğnesine 30 santimetrelik polietilen tüp takın ve karotis arteri ikinci dikişe distal olarak bağlamak için yedi milimetrelik bir damar klipsi kullanın.
Karotis arterde yaklaşık 0,5 milimetrelik enine kesim yapın ve steril polietilen tüpü artere tanıtılın. Tüpü ikinci dikişle sabitle ve damar klibini çıkarın. Sonra yavaşça damar içine salin floş şırınga piston bastırmak.
Cremaster kas hazırlamak için, mikroskop aşamasına bakan skrotum ile özel yapılmış plastik mikroskop çerçeve için fare transfer ve dikkatle cımbız ile en distal ucunda testis torbası kavramak. Skrotumyavaşça çekerek, skrotal deri tuzlu ile iyi sulu açık doku tutarak skrotal deri yaklaşık beş milimetre çapında bir dairesel bölümü kaldırın. Gevşek bağ dokusu incelemek ve her iki testis bulmak için iki cımbız kullanın.
Bir testis distal kavramak ve yavaşça adım adım çevreleyen bağ dokuları kaldırarak üreme dokusu çekerek başlar. Testis dışlandıktan sonra, dokunun distal ucunu sahneyi çevreleyen kauçuk halkaya sabitle ve dokuyu tuzlu su ile nemlendirin. Daha sonra, dikkatle altta yatan cremaster kas zarar vermeden bağ dokusu kaldırın.
Bu altta yatan cremaster kas zarar vermeden bulanık görüntüler neden olur bağ dokusunun tüm kaldırmak için önemlidir. Tüm doku çıkarıldığında, doku proksimal sonuna kadar çok distal bir longitudinal kesi yapmadan önce cremaster kas açmak için bir milimetre lik enine kesi yapmak. Kas larbirer gibi açılmalı.
Dikkatle cam sahne üzerinde kas yayıldı ve dokunmak veya dokunun merkezi bölgeye zarar değil dikkat ederek kauçuk halka kas pin. Daha sonra kalan testisleri yan tarafa sabitleyip ilgi bölgesine erişim sağlamak ve pss ile dokuyu nemlendirin. Kas vaskülatür intravital görüntüleme için, dik mikroskop monte cremaster kas yerleştirin ve 40X hedefi seçin.
35-37 derece Santigrat PSS ile sürekli superfüzyon altında kayıtları gerçekleştirmek kas ve doku aşağı objektif aşağı objektif yanında PSS sürekli damlama izin mikroskop dik hedefine bantlanmış olan küçük bir boru parçası ile. Post-kılcal damarları tanımlayın. 20 ila 40 mikrometre çapında venüller üzerinde mikrosirkülasyon ölçün.
Daha sonra 30 saniyelik bir süre boyunca cremaster kas mikrosirkülasyon yüksek çözünürlüklü görüntüleri kayıt sürekli kas dokusunun daralma ve gevşeme hafif değişiklikler nedeniyle odak ayarlayarak. Aşırı bağ dokusu bulanık mikroskobik görüntülere yol açabilir. Bu temsili mikroskobik görüntüde, çapı 20 ila 40 mikrometre arasında olması gereken post-kılcal venüler iki küçük damarın birleşmesi ile tespit edilebilir.
Yapışık ve yuvarlanan lökositler sirkülasyon yaparken görüntülenebilir, ancak kaydedilen videoların yavaş çekim tekrarında izlenebilir. Çok sayıda parametre kardiyak çıkış, damar çapı, merkez çizgisi hızı, duvar kesme hızı ve sirkülasyon lökosit sayısı da dahil olmak üzere in vivo lökosit alımını etkileyebilir. Merkez hattı hızının kardiyak çıkış, periferik vasküler direnç ve intravasal hacimden etkilendiğini unutmayın.
Örneğin, karotis kateter ile verilen rhodamine veya diğer deneysel madde büyük bir hacim post-kapiller merkez hattı hızını artırır ve lökosit yakalama ve haddeleme inhibe. Aksine, kardiyak yetmezlik, derin anestezi veya hipotermi post-kılcal akışı azaltabilir. Merkez hattı nın hızını belirlemek için serbestçe dolaşan floresan lökositler kullanılabilir veya lökositler Rhodamine gibi floresan reaktiflerle boyalanmalıdır.
Yabani tip suşların fizyolojik farklılık gösterebileceğini unutmayın. Örneğin, C57BL/6 fareleri C57BL/10ScSn hayvanlarına kıyasla açıkça gelişmiş lökosit haddeleme, yapışma ve transmigration göstermektedir. Planlama ve standardizasyon aşamaları özellikle mikroskopi için cremaster kas hazırlanması sırasında tekniği mastering için önemlidir.
Lökosit alımını görselleştirmek için diğer yöntemler ek bilgi sağlamak ve lökositlerin ve endotel hücrelerinin işe alım basamaklarına bireysel katkısının incelenmesine yardımcı olmak için yapılabilir. Bu teknik farmakolojik meditasyoncular ve yeni immün modülatör maddelerin klinik öncesi değerlendirilmesi için bir platform sağlar.
