Nötrofiller ve diğer bağışıklık hücreleri tarafından ekstrasellüler tuzakların salınımı doğuştan gelen bağışıklık ta önemlidir, ancak aynı zamanda inflamatuar patolojilerle de güçlü bir şekilde bağlantılıdır. Bu hücreler inflamatuar yanıtta kritik bir rol oynasa da makrofajlarda bu süreç hakkında çok az şey bilinmektedir. Bu protokol makrofajlar ekstrasellüler tuzak veya mast serbest birincil insan in vitro modeli sağlar.
Bu yapının potansiyel fizyolojik büyümesini in vivo olarak incelemek için bize bir model sağlar. Bu tekniğin en büyük avantajı, bu protokoldeki hücrelerin insan buffy kat preparatlarından izole edilmiş birincil hücreler olmasıdır. ThP-1 hücre hattı gibi diğer monosit hücre hattı ile tezat makrofajlar, monosit ayırt etmek için gerekli hiçbir astar adım yoktur.
Bu protokol izole nötrofil ve mikroglia dahil olmak üzere diğer bağışıklık hücrelerine kolayca uyarlanmıştır. Makrofajlar tarafından üretilen ekstrasellüler tuzak çok kırılgandır, bu nedenle lekeli tuzakların bütünlüğünü korumak için adım arasında özen verilmelidir. Steril koşullar altında, tam RPMI-1640 kültür ortamı, mililitre başına 20 nanogram konsantrasyonuna interferon gama ve mililitre başına bir mikrogram konsantrasyonuna lipopolisakkarit ekleyerek M1 priming orta hazırlamak.
Mililitre başına 20 nanogram konsantrasyonuna komple RPMI-1640 kültür ortamına interlökin 4 ekleyerek M2 priming ortamını hazırlayın. Steril koşullarda, HMDM içeren tohumlu ve kültürlü doku kültürü plaka kuyularından aspire ortamı. Dikkatle her kuyuiçine ekleyin, steril PBS bir mililitre önceden 37 santigrat dereceye ısıtılır.
PBS arabelleği çıkarın ve iki kez daha yıkayın. HMDM içeren her kuyuya bir mililitre M1 veya M2 astar lı ortam ekleyin. Bir hücre kuluçka makinesinde %5 karbondioksit varlığında hücreleri 37 derecede 48 saat kuluçkaya yatırın.
Steril koşullar altında, tam RPMI-1640 medya MET sürümü farklı uyarıcılar içeren kültür medya hazırlamak. Hipokloröz asit stimülasyon deneyleri için, 37 santigrat dereceönceden ısıtılmış olan HBSS ile falcon tüpünde 200 mikromolar hipokloröz asit hazırlayın. Polarizasyon tedavisinden sonra, her kuyudan hücre ortamını aspire edin ve hücreleri PMA, TNF alfa ve interlökin 8 stimülasyon veya hipokloröz asit stimülasyonu için HBSS için bir mililitre lik alquot ile dikkatlice yıkayın.
Son yıkama adımında PBS'yi çıkardıktan sonra, PMA, TNF alfa veya interlökin 8 içeren bir mililitre tam ortam ekleyin. TNF alfa stimülasyonu için altı saat ve PMA veya interlökin 8 stimülasyon için 24 saat boyunca bir hücre kuluçka makinesinde 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksit hücreleri kuluçka. Hipokloröz asit ile deneyler için, son yıkama adımında HBSS çıkardıktan sonra, taze hazırlanmış hipokloröz asit bir mililitre ekleyin.
Sonra hücreleri 15 dakika boyunca 37 derecede bir hücre kuvözde %5 karbondioksit varlığında kuluçkaya yatırın. Bundan sonra, dikkatlice hücrelerin supernatant aspire ve HBSS bir mililitre aliquots ile hücreleri üç kez yıkayın. HBSS'yi son yıkama adımından çıkardıktan sonra, bir mililitre tam RPMI-1640 kültür ortamı ekleyin.
Sonra hücreleri 24 saat boyunca 37 derecede bir hücre kuvözde %5 karbondioksit bulundurun. HBSS'de 40 mikromolar konsantrasyonda SYTOX yeşil boya hazırlayın. DOĞRUDAN HMDM içeren her kuyuya boya 25 mikrolitre ekleyin.
Karanlıkta 5 dakika oda sıcaklığında hücreleri kuluçkaya yatırın. Daha sonra HMDM'yi doku kültürü kuyularına yerleştirin ve görüntüleme için ters floresan mikroskobun mikroskobun mikroskop aşamasına yerleştirin. Geniş spektrumlu floresan ışık kaynağını, parlak alan ışık kaynağını ve yüksek çözünürlüklü renkli dijital fotoğraf makinesiyle yüklü ters mikroskobu açın.
Filtre tekerleğini yeşil floresan için iki numaralı konuma döndürün ve 504 nanometrede uyarma ve 523 nanometrede boyut. 5X hedefini kullanarak, görüntüyü kaba odakla odaklayın ve görüntü keskin, net ve odaklanmış görünene kadar ince odak lama ları mikroskoba odaklanın. Mikroskobu Kamera moduna geçirin.
İlişkili yazılımı başlatın. Görüntüyü önizlemek için Oynat düğmesini tıklatın ve görüntü net, net ve yazılım önizleme penceresinde odaklanana kadar mikroskoptaki ince odak düğmesini ayarlayın. Yakala düğmesini tıklatın.
Yazılım içinde Dosya'yı tıklatın. Gerekli görüntü dosyası türü olarak kaydedin. Mikroskopta, filtre tekerleğini parlak alan görüntüleme için beş numaralı konuma döndürün ve ilgili parlak alan görüntüsünü elde etmek için yakalama yordamlarını tekrarlayın.
HMDM'nin uyaranlara yanıt olarak morfolojik değişikliklerini gösteren parlak alan görüntüleri burada gösterilmiştir. M1-polarize makrofajlar HMDM ile interferon gama ve lipopolisakkarit maruz kalan bir uzamış ve iğ benzeri hücre şekli gösterdi. Karşılaştırma için, HMDM'nin interlökin 4'e 48 saat maruz kalmasından sonra M2-polarize makrofajların morfolojisi tipik olarak yuvarlak ve düzidi.
Farklılaştırılmış HMDM fenotiplerinin MET salgılayabilme yeteneği SYTOX yeşili ile canlı hücre floresan görüntülemesi ile görselleştirildi. Herhangi bir pro-inflamatuar uyaran yokluğunda 24 saat boyunca kuluçkaya yatırılanan her HMDM fenotipten elde edilen kontrol, çok sınırlı yeşil boyama gösterdi. Yeşil çizgiler olarak gösterilen MET'ler için pozitif boyama, M1-HMDM'lerin hipokloröz asit, PMA, interlökin 8 veya TNF alfaya maruz kalmasıyla elde edildi.
Hücrelerde belirgin bazı yeşil boyama varlığı hücre dışı tuzak salınımından bağımsız hücre ölümü sonucu ortaya çıkabilecek membran bütünlüğünün kaybını yansıtır. Interlökin 4'e maruz kalan M2-HMDM'lerle yapılan deneylerde, hücre dışı DNA iplikçiklerinin veya çizgilerin inanılarak belirtildiği gibi hücrelerden DNA salınımı yapılmadı. Ancak, hipokloröz asit ve TNF alfa ile yeşil floresan boya bazı hücresel alımı vardı.
Görüntülemeden önce lekelenmeyi aşırı maruz bırakabilecek doğrudan parlak ışıktan kaçınmak önemlidir. Hücre dışı DNA, hücre supernatantında bulunan nükleer ve mitokondriyal DNA üzerinde qPCR analizi ile ölçülebilir. Mast yapısının daha fazla karakterizasyonu ve HMDM kullanarak kronik inflamasyondaki rolleri diğer ölümsüzleştirilmiş hücre hattı makrofaj depolarına göre klinik olarak daha uygun olabilir.
