호중구 및 기타 면역 세포에 의한 세포 외 트랩의 방출은 타고난 면역에서 중요하지만 염증 성 병리학과 강하게 연결됩니다. 이 세포는 선동적인 반응에 있는 중요한 역할을 하기 때문에 아주 작은 대식세포에 있는 이 프로세스에 관하여 알려져 있습니다. 이 프로토콜은 대식세포 세포 외 트랩 또는 마스트 릴리스의 기본 인간 체외 모델을 제공합니다.
그것은 생체 내에서이 구조의 잠재적인 생리적 성장을 연구 하는 우리에 대 한 모델을 제공 합니다. 이 기술의 주요 장점은 이 프로토콜의 세포가 인간 버피 코트 제제로부터 분리된 1차 세포라는 것입니다. 단핵구를 대식세포로 분화하는 데 필요한 프라이밍 단계는 없으며, 이는 THP-1 세포주와 같은 다른 단세포 세포주와 대조된다.
이 프로토콜은 분리된 호중구 및 microglia를 포함하여 그밖 면역 세포에 쉽게 적응됩니다. 대식세포에 의해 생성된 세포외 트랩은 매우 깨지기 쉽기 때문에 스테인드 트랩의 무결성을 보존하기 위해 단계 사이에 주의를 기울여야 합니다. 멸균 조건하에서, 완전한 RPMI-1640 배양 배지, 인터페론 감마를 밀리리터당 20 나노그램의 농도로, 밀리리터당 1마이크로그램의 농도에 첨가하여 M1 프라이밍 배지를 준비한다.
밀리리터당 20나노그램의 농도에 완전한 RPMI-1640 배양 매체에 인터류신 4를 추가하여 M2 프라이밍 미디어를 준비한다. 멸균 조건하에서, HMDM을 포함하는 종자 및 배양 조직 배양 플레이트 우물에서 흡인 매체. 각 우물에 조심스럽게 추가, 멸균 PBS의 1 밀리리터는 섭씨 37도에 미리 따뜻하게.
PBS 버퍼를 제거하고 두 번 더 세척합니다. HMDM을 포함하는 각 웰에 M1 또는 M2 프라이밍 미디어의 밀리리터 1밀리리터를 추가합니다. 세포 인큐베이터에 이산화탄소 5%가 있는 경우 섭씨 37도에서 48시간 동안 세포를 배양합니다.
멸균 조건하에서, 완전한 RPMI-1640 미디어에 MET 방출의 다른 자극기를 포함하는 배양 매체를 준비합니다. 저혈당 자극실험을 위해, 37°C까지 예온된 HBSS를 가진 팔콘 튜브에 200개의 미세몰라 저혈당산을 준비하십시오. 편광 처리 후, 각 우물에서 세포 매체를 흡습하고 PMA, TNF 알파, 인터류키인 8 자극 또는 HBSS에 대한 멸균 PBS 중 하나의 밀리리터 알리쿼트로 세포를 세 번 세척하여 고압산 자극을 한다.
최종 세척 단계에서 PBS를 제거한 후 PMA, TNF 알파 또는 인터류빈 8을 포함하는 완전한 미디어의 1 밀리리터를 추가합니다. TNF 알파 자극을 위해 6시간 동안 세포 인큐베이터에서 37도 및 5%의 이산화탄소를 배양하고 PMA 또는 인터류키 8 자극을 위해 24시간 동안 세포를 배양합니다. 고염소산을 실험하기 위해, 마지막 세척 단계에서 HBSS를 제거한 후, 갓 준비된 하이포클로산 1밀리리터를 추가합니다.
그런 다음 세포 인큐베이터에 5 %의 이산화탄소가있는 경우 섭씨 37도에서 15 분 동안 세포를 배양합니다. 그 후, 조심스럽게 세포의 수퍼 내수를 흡인하고 HBSS의 1 밀리리터 알리쿼트로 세포를 세 번 세척합니다. 최종 세척 단계에서 HBSS를 제거한 후 완전한 RPMI-1640 배양 매체의 밀리리터 1밀리리터를 추가합니다.
그런 다음 세포 인큐베이터에서 5 %의 이산화탄소가있는 경우 섭씨 37도에서 24 시간 동안 세포를 배양합니다. 40 마이크로몰러의 농도로 HBSS에서 SYTOX 녹색 염료를 준비합니다. HMDM을 포함하는 각 우물에 25 마이크로리터의 염색기를 직접 추가합니다.
어둠 속에서 5 분 동안 실온에서 세포를 배양하십시오. 그런 다음 HMDM을 조직 배양 우물에 배치하여 이미징을 위한 반전형 형광 현미경의 현미경 단계에 놓습니다. 고해상도 컬러 디지털 카메라로 설치된 광스펙트럼 형광원, 밝은 광원 및 반전 현미경을 켭니다.
504 나노미터및 치수 523 나노미터에서 발산과 녹색 형광을위한 번호 2 위치로 필터 휠을 회전합니다. 5X 목표를 사용하여 이미지를 거친 초점으로 초점을 맞춘 다음 이미지가 선명하고 선명하며 초점을 맞출 때까지 현미경에 미세 초점 노브를 집중시합니다. 현미경을 카메라 모드로 전환합니다.
관련 소프트웨어를 시작합니다. Play 버튼을 클릭하여 이미지를 미리 보고 이미지가 소프트웨어 미리 보기 창에 선명하고 선명하게 표시될 때까지 현미경의 미세 초점 노브를 조정합니다. 캡처 버튼을 클릭합니다.
소프트웨어 내에서 파일을 클릭합니다. 필요한 이미지 파일 유형으로 저장합니다. 현미경에서 필터 휠을 밝은 필드 이미징을 위해 5번 위치로 회전하고 캡처 절차를 반복하여 해당 밝은 필드 이미지를 얻습니다.
자극에 대한 응답으로 HMDM의 형태학적 변화를 보여주는 밝은 필드 이미지가 여기에 표시됩니다. 인터페론 감마및 리포폴리사카라이드에 노출된 HMDM을 실험한 M1 편광 대식세포는 길쭉하고 스핀들 같은 세포 모양을 보였다. 비교를 위해, 48시간 동안 HMDM을 인터류빈 4에 노출한 후 M2 편광 대식파지의 형태는 전형적으로 둥글고 평평했다.
MDM 표현형을 방출하는 차별화된 HMDM 표현형의 능력은 SYTOX 그린을 통한 살아있는 세포 형광 이미징에 의해 시각화되었다. 어떤 프로 염증 자극의 부재에서 24 시간 동안 배양 각 HMDM 표현형에서 얻은 제어는 매우 제한된 녹색 염색을 보였다. 녹색 줄무늬로 표시된 MET에 대한 긍정적 인 염색은 고압산, PMA, 인터류키 8 또는 TNF 알파에 M1-HMDM을 노출하여 달성되었습니다.
세포에서 명백한 몇몇 녹색 염색의 존재는 세포 외 함정 방출의 독립적인 세포 죽음에서 유래할 수 있는 막 무결성의 손실을 반영합니다. 인터류빈 4에 노출된 M2-HMDM로 수행된 실험은 세포외 DNA의 가닥이나 줄무늬가 없는 것으로 나타난 세포로부터 DNA의 방출을 보여주지 않았다. 그러나, 저염산 및 TNF 알파를 가진 녹색 형광염염의 몇몇 세포 조리가 있었습니다.
이미징 전에 얼룩을 과열시킬 수 있는 직접적인 밝은 빛을 피하는 것이 중요합니다. 세포외 DNA는 세포 상수체에 존재하는 핵 및 미토콘드리아 DNA에 대한 qPCR 분석을 통해 정량화될 수 있다. HMDM을 이용한 만성 염증의 마스 구조 및 그 역할의 추가 특성화는 다른 불멸의 세포주 대식세포 매장에 비해 임상적으로 더 관련이 있을 수 있다.
