La liberación de trampas extracelulares por neutrófilos y otras células inmunitarias es importante en la inmunidad innata, pero también fuertemente relacionada con patologías inflamatorias. Se sabe muy poco sobre este proceso en macrófagos aunque estas células juegan un papel crítico en la respuesta inflamatoria. Este protocolo proporciona un modelo primario in vitro humano de trampa extracelular de macrófagos o liberación de mástil.
Proporciona un modelo para estudiar un crecimiento fisiológico potencial de esta estructura in vivo. La principal ventaja de esta técnica es que las células de este protocolo son células primarias aisladas de las preparaciones de capa de pulsála humana. No se requiere un paso de cebado para diferenciar el monocitos en macrófagos, lo que contrasta con otra línea celular de monocitos como la línea celular THP-1.
Este protocolo se adapta fácilmente a otras células inmunitarias, incluyendo neutrófilos aislados y microglia. La trampa extracelular producida por los macrófagos es muy frágil, por lo que se deben tener cuidado entre el paso para preservar la integridad de las trampas manchadas. En condiciones estériles, preparar el medio de cebado M1 añadiendo a los medios de cultivo RPMI-1640 completos, interferón gamma a la concentración de 20 nanogramos por mililitro y lipopolisacárido a la concentración de un microgramo por mililitro.
Prepare los medios de cebado M2 añadiendo interleucina 4 a los medios de cultivo RPMI-1640 completos a la concentración de 20 nanogramos por mililitro. En condiciones estériles, aspirar medios de los pozos de placas de cultivo de tejido cultivados y de semillas que contienen HMDM. Agregue cuidadosamente en cada pozo, un mililitro de PBS estéril precalentó a 37 grados Celsius.
Retire el tampón PBS y lávelo dos veces más. Agregue un mililitro de los medios de cebado M1 o M2 a cada pozo que contenga el HMDM. Incubar las células durante 48 horas a 37 grados centígrados en presencia de 5% de dióxido de carbono en una incubadora celular.
En condiciones estériles, prepare los medios de cultivo que contienen diferentes estimuladores de la liberación de MET para los medios RPMI-1640 completos. Para experimentos con estimulación de ácidos hipoclorosos, prepara 200 micromolares de ácido hipocloroso en un tubo Falcon con HBSS que ha sido precalegado a 37 grados Celsius. Después del tratamiento de polarización, aspirar los medios celulares de cada pozo y lavar cuidadosamente las células tres veces con un mililitro alícuotas alícuotas de PBS estéril para PMA, TNF alfa, e interleucina 8 estimulación o HBSS para la estimulación de ácido hipocloroso.
Después de retirar el PBS en el paso de lavado final, agregue un mililitro de medios completos que contengan PMA, TNF alfa o interleucina 8. Incubar las células a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono en una incubadora celular durante seis horas para la estimulación alfa TNF y 24 horas para la estimulación de PMA o interleucina 8. Para experimentos con ácido hipocloroso, después de eliminar el HBSS en el paso de lavado final, agregue un mililitro de ácido hipocloroso recién preparado.
Luego incubar las células durante 15 minutos a 37 grados Celsius en presencia de 5% de dióxido de carbono en una incubadora celular. Después de eso, aspira cuidadosamente el sobrenadante de las células y lavó las células tres veces con un mililitro alícuotas de HBSS. Después de retirar el HBSS del paso de lavado final, agregue un mililitro de medios de cultivo RPMI-1640 completos.
Luego incubar las células durante 24 horas a 37 grados Celsius en presencia de 5% de dióxido de carbono en una incubadora celular. Preparar el tinte verde SYTOX en HBSS a una concentración de 40 micromolares. Añadir directamente 25 microlitros del tinte a cada pozo que contenga HMDM.
Incubar las células a temperatura ambiente durante 5 minutos en la oscuridad. A continuación, coloque el HMDM en pozos de cultivo de tejidos en la etapa del microscopio de un microscopio fluorescente invertido para la toma de imágenes. Encienda una fuente de luz fluorescente de amplio espectro, una fuente de luz de campo brillante y un microscopio invertido instalado con una cámara digital a color de alta resolución.
Gire la rueda de filtro a la posición número dos para la fluorescencia verde con excitación a 504 nanómetros y dimensión a 523 nanómetros. Usando el objetivo 5X, enfoque la imagen con el enfoque grueso y luego las perillas de enfoque fino en el microscopio hasta que la imagen aparezca nítida, clara y enfocada. Cambie el microscopio al modo Cámara.
Inicie el software asociado. Haga clic en el botón Reproducir para obtener una vista previa de la imagen y ajustar la perilla de enfoque fino en el microscopio hasta que la imagen aparezca nítida, clara y enfocada en la ventana de vista previa del software. Haga clic en el botón Capturar.
Dentro del software, haga clic en Archivo. Guardar como el tipo de archivo de imagen necesario. En el microscopio, gire la rueda de filtro a la posición número cinco para la imagen de campo brillante y repita los procedimientos de captura para obtener la imagen de campo brillante correspondiente.
Aquí se muestran imágenes de campo brillante que muestran los cambios morfológicos del HMDM en respuesta a estímulos. Los macrófagos polarizados M1 de experimentos con HMDM expuestos a la gamma de interferón y lipopolisacárido mostraron una forma celular alargada y similar al husillo. Para comparar, la morfología de los macrófagos polarizados M2 después de la exposición de HMDM a la interleucina 4 durante 48 horas eran típicamente redondas y planas.
La capacidad de los fenotipos HMDM diferenciados para liberar METs se visualizó mediante imágenes de fluorescencia de células vivas con verde SYTOX. El control obtenido de cada fenotipo HMDM incubado durante 24 horas en ausencia de estímulos proinflamatorios mostró una tinción verde muy limitada. La tinción positiva de los MET, mostrada como vetas verdes, se logró con la exposición de M1-HMDM al ácido hipocloroso, PMA, interleucina 8 o TNF alfa.
La presencia de alguna tinción verde aparente en las células refleja la pérdida de integridad de la membrana que puede resultar de la muerte celular que es independiente de la liberación de trampa extracelular. Los experimentos realizados con M2-HMDM expuestos a la interleucina 4 no mostraron ninguna liberación de ADN de las células, como lo indica la ausencia de las hebras o rachas de ADN extracelular. Sin embargo, hubo alguna absorción celular de tinte fluorescente verde con el ácido hipocloroso y alfa TNF.
Es importante evitar la luz brillante directa que puede sobreexponecer la tinción antes de tomar imágenes. El ADN extracelular se puede cuantificar mediante análisis de qPCR sobre ADN nuclear y mitocondrial presente en el sobrenadante celular. La caracterización adicional de la estructura del mástil y sus funciones en la inflamación crónica utilizando HMDM pueden ser más relevantes clínicamente en comparación con otras tiendas de macrófagos de línea celular inmortalizada.
