Bu protokol, nf-kappa-b luciferase muhabirini ifade eden hücrelerdeki NF-kappa-B aktivasyonundaki değişiklikleri belirlemek için yararlıdır. Bu tekniğin en büyük avantajı, NF-kappa-B aktivasyonunda değişikliklere yol açan faktörlerin veya koşulların yüksek iş yapma ekranını sağlamasıdır. NF-kappa-B çok çeşitli hücresel süreçler için bir transkripsiyon faktörüdür.
NF-kappa-B iyi bilinen bir fonksiyonu çeşitli sitokinler ve kemokinler ifade indükleyerek inflamatuar yanıtların indüksiyon olduğunu. Laboratuvarımız özellikle Salmonella tipimurium patojeninin indüklediği NF-kappa-B indüksiyonu ile ilgilenmektedir. Burada, bir NF-kappa-B luciferase muhabiri plazmid ile birlikte transfected HeLa hücre hattı nı kullanıyoruz.
Diğer bakteriler, hatta virüsler veya kimyasal bileşikler, NF-kappa-B aktivasyon çalışması için bu hücre hattında kullanılabilir. Eğer bu hücre hattında böyle bir NF-kappa-B luciferase muhabiri plazmid tanıtabilir eğer diğer hücre hatları da kullanılabilir. Birisi ilk kez bunu yaparken düzgün hücre kültürü ve bakteriyel çalışma için gerekli olan steril tekniği kullanarak sorunları olabilir.
Hücre stimülasyonundan bir gün önce, HeLa 57A hücrelerinin büyüme ortamını kaldırın. Hücreleri bir mililitre 0.05 tripsin EDTA ile yıkayın. Başka bir mililitre trippsin EDTA ile değiştirin ve şişeyi 5 dakika boyunca 37 santigrat derecelik bir kuluçka makinesine aktarın.
Hücreler şişeden ayrıldıktan sonra, 10 mililitre lik büyüme ortamıyla askıya alın. 10 mikrolitre hücre süspansiyonu ile Trypan mavisinin 10 mikrolitresini birleştirin, pipetleri yukarı ve aşağı karıştırArak karıştırın ve 10 mikrolitreyi bir hücre sayacı slaytına aktarın. Bir hücre sayacı kullanarak süspansiyon hücreleri saymak ve 50 mililitrekonik tüp mililitre başına beş hücre için 2,5 kat 10 nihai konsantrasyon hücreleri seyreltmek için büyüme ortamı kullanın.
48 kuyuluk bir plakanın her kuyuya 250 mikrolitre hücre süspansiyonu aktarın. Homojen bir hücre süspansiyonu sağlamak için konik tüpü periyodik olarak kapatın ve ters çevirin. Hücrelerin kuyularda düzgün bir şekilde dağdığından emin olmak için plakaya yan tarafta hafifçe dokunun.
Plakayı %5 karbondioksit kuvözde 37 dereceye aktarın ve hücrelerin bir gecede bağlanmasını ve büyümesini bekleyin. Tek koloniler üretmek için LB agar plakaları üzerine Salmonella Serisi dondurulmuş stokları. Plakaları 37 santigrat dereceye ayarlanmış bir kuluçka makinesine aktarın ve bir gecede büyümeye izin verin.
Ertesi gün, steril bakteri kültürü tüpleri lb üç mililitre ekleyin ve medyaya uygun antibiyotik ekleyin. Steril bir aşılama döngüsü kullanarak, çizgili bakteri kültürlerinden tek bir koloni seçin ve döngüyü LB ortamına dokunun. Aşı yaptıktan sonra tüpleri kaplayın ve döngüyü atın.
Tüpleri 37 santigrat derece ve 180 RPM'de sallanan bir kuluçka makinesine yerleştirin, sonra bakterilerin bir gecede büyümesine izin verin. Sabah, kuvözden bir gecede bakteri kültürlerini alın. Taze LB ve antibiyotikler üç mililitre ekleyerek alt kültür için tüpler hazırlayın.
Bir gecede hazırlanan bakteri kültürünün 30 mikrolitresini yeni hazırlanmış ortama aktarın. Tüpleri 37 derecede 37 derece lik bir kuvözsetine üç saat süreyle yerleştirin. Üç saat kuluçka sonra, boş olarak hizmet etmek için plastik bir cuvette içine steril LB suyu bir mililitre aktarın.
Numune analiziiçin kullanılacak diğer cuvettes içine LB 900 mikrolitre aktarın. 100 mikrolitre bakteriyel alt kültürü 900 mikrolitre LB içeren bir cuvette ve pipeti karıştırmak için birkaç kez yukarı ve aşağı aktarın. Her bakteriyel süspansiyon için bunu tekrarlayın.
600 nanometre dalga boyunda bakteri kültürlerinin optik yoğunluğunu ölçmek için spektrofotometreyi açın. Boşluğu spektrofotometreye yerleştirin. Oryantasyona dikkat edin.
Kapağı kapatın ve arka plan emiciliğini elde etmek için spektrofotometredeki boş düğmeye basın. Boş cuvette'yi aynı oryantasyonda bir örnek cuvette ile değiştirin ve okumaya basın. Bu örneklerin OD600 değerlerini kaydedin.
Seyreltme faktörlerini hesaba katmak için değeri 10 ile çarpın. Bir cuvette ve ölçü emici likte süspansiyonu 1'den 10'a seyreltin, bu da kabaca mililitre başına 9 CFU'ya 10 kata karşılık gelen yaklaşık 0,1 değeri vermelidir. Yeni bir tüp, bir inoculum olarak kullanılmak üzere mililitre başına sekiz CFU bir kez 10 bir süspansiyon elde etmek için taze LB seyreltilmiş alt kültür uygun bir hacim ekleyin.
Mililitre başına yaklaşık 100 CFU'luk son seyreltme yapılana kadar 450 mikrolitre steril PBS içeren bir tüpe 50 mikrolitre bakteriyel süspansiyon aktararak inokülün seri seyreltmelerini hazırlayın. Transfer 100 mikrolitre iki en düşük seyreltme, 100 ve 1000 CFU mililitre başına, iki LB agar plakaları, ve tek koloniler elde etmek için bir hücre yayıcı ile süspansiyon yayıldı. Bu plakaları 37 santigrat derecelik bir kuluçka makinesine aktarın ve bir gecede kuluçkaya yatırın.
Ertesi gün, kolonileri saymak ve gerçek inoculum konsantrasyonu belirlemek için ilk inoculum bakteri konsantrasyonu hesaplamak. Aynı gün, her kuyu için kullanılacak enfeksiyon koşullarına göre plakanın kapağını etiketlayın, her koşul triplicate olarak yapılmaktadır. Uygun kuyulara 10 mikrolitre inokül ekleyin ve enfekte olmayan kontrol kuyularına 10 mikrolitre steril LB ekleyin.
Enfeksiyon süresini senkronize etmek için, plakayı bir masa üstü santrifüjüne yerleştirin ve 500 kez G'de beş dakika boyunca döndürün, böylece plaka dengelenir. Sonra, enfekte hücreleri bir saat liğine 37 derecede %5 karbondioksit kuvöze aktarın. Bir sonraki adımda kullanılmak üzere 37 derece santigrat su banyosu hücre kültürü medya bir aliquot içeren 15 mililitrelik konik tüp yerleştirin.
Enfeksiyon zamanından bir saat sonra, su banyosundan hücre kültürü ortamı içeren 15 mililitrelik konik tüpü çıkarın ve %70 etanol ile dış yüzeyi silin. Doku kültürü plakalarını kuvözden biyogüvenlik kabinine aktarın. Kuyulardan ortam aspire etmek için steril ipuçları kullanın ve taze, sıcak hücre kültürü medya 250 mikrolitre ile değiştirin.
Plakaları 37 derecede %5 karbondioksit kuvöze dört saat daha geri getirin. Bundan sonra, karbondioksit inkübatör plakaları çıkarın ve kuyulardan medya aspire. Luciferase analizi için, kuyulara 1X hücre lisis tampon100 mikrolitre ekleyin.
Plakayı 80 derecelik negatif bir dondurucuya aktarın ve etkili hücre lisisi sağlamak için en az 30 dakika kuluçkaya yatırın. Daha sonra, dondurulmuş hücre lisatiçeren plakayı çözülmek için bir tezgahın üzerine yerleştirin ve üreticinin tavsiyelerine göre luciferase substrat reaktiflerini hazırlayın. Luciferase substrat reaktiflerin oda sıcaklığını dengelemesine izin verin.
Ardından, plaka okuyucuyu açın ve ilgili okuyucu programını açın. Makineyi parlaklığı ölçecek şekilde ayarlayın. Her hücrenin 10 mikrolitresini opak 96 kuyuluk bir kuyuya aktarın.
Çok kanallı bir pipet kullanarak, opak plakanın her kuyusuna 50 mikrolitre luciferase asay reaktifi ekleyin. Kuyuları karıştırmak için yan taraftaki tabağa hafifçe dokunun ve alt yüzeyin sıvıyla kaplandığından emin olun. Plakayı bir plaka okuyucuya yerleştirin ve okumayı başlatın.
Parlaklık değerlerini elektronik tablo programına kopyalayın ve sonuçları çizin. Bu protokol, transkripsiyon faktörü NF-kappa-B'nin HeLa hücrelerinin bir hattına doğru şaşıta bir NF-kappa-B bağımlı luciferase muhabiri kullanılarak aktivasyonuna odaklanır. Bu şekil, Salmonella tipphimurium suşları ile enfekte Olan HeLA 57A hücrelerinde NF-kappa-B bağımlı luciferase aktivasyonu ve IL6 gen ekspresyonunun temsili bir deneyini göstermektedir.
Yabani tip SL1344 suşu ile enfeksiyon hem RLU hem de IL6 ekspresyonunda güçlü bir luciferase sinyaline neden oldu, bu sinyalsipA sopB sopE2 üçlü mutant ile enfekte hücrelerde azaldı ve sipA sopB sopE2 sopE2 sopE2 sopE eple mutant ile kontrol seviyelerine düşürüldü. Seri seyreltme ve kaplama yaparken çok dikkatli oylanın. Bu, suşları arasında tutarlı bir inokül olmasını sağlayacaktır.
NF-kappa-B aktivasyonuna ve mRNA ekspresyonundaki downstream değişikliklere katkıda bulunan faktörler indikten sonra, protein ekspresyonundaki değişiklikleri tanımlamak için western blot tekniği kullanılabilir. Bu protokol, laboratuvarımızın sadece Salmonella tarafından indüklenen NF-kappa-B aktivasyonunu değil, NF-kappa-B aktivasyonuna neden olan diğer bileşikleri ve proteinleri de değerlendirmesini sağlamıştır. Salmonella typhimurium bir insan patojenidir.
Bu bakterilerle çalışırken uygun PPE'yi çalıştırın.
