Yazarlar, bu çalışma boyunca değerli tartışmalar ve yardım için Cirillo laboratuvar üyelerine teşekkür ederiz. Biz bu protokolün çekimler sırasında Dr Joshua Hill ve Dr James Samuel laboratuvar yardım için teşekkür ederim. Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri Bill &amp; Melinda Gates Vakfı ve hibe AI47866 hibe 48.523 tarafından finanse edildi.

1. Intratrakeal Entübasyon tarafından Akciğer Enfeksiyonu <ol><li> Fareler tartılır ve isteğe bağlı olarak, işaretleri kulaklara kolay tanımlanması için yapılabilir. </li><li> Intraperitoneal inokülasyon ile fareler anestezi ketamin (g fare kilo başına 100 mikrogram) ve xylazine (farenin ağırlığının gramı başına 10 mikrogram). </li><li> Tam anestezi kadar kafeslere yerleştirin fareler. Pedal refleks kontrol etmek için onların ayak pedleri sıkıştırın. Fare azaltılmış ya da herhangi bir refleks reaksiyon göstermesi gerekir. </li><li> Sırtında uzanan entübasyon standı üzerinde fare yerleştirin. </li><li> Entübasyon durmak için bir lastik bant saptamak ve sonra farenin üst kesici dişlerin altına koyun. Entübasyon standı üzerine bacaklar ve kollar düzeltmek için bant kullanın. </li><li> Forseps kullanarak ağız hafifçe dışarı tougue taşıyın. </li><li> Ağız içinde octoscope spekulum yerleştirin ve gırtlak açılması görülene kadar orofarinks içine bakmak. </li><li> Catether hub kadar trakea içine kateteri ile kaplı Advance kılavuz tel kesiciler. Kılavuz teli çıkarın. Göğüs genişlemesi gözlemlemek ve doğru entübasyon onaylamak için, kateteri içine hava koyun. </li><li> 50 mcL bakteriyel 1 ml şırınga kullanarak kateteri yoluyla çözüm (Bacillus Calmette Guerin (BCG) laboratuvarında inşa tıklayın böceği kırmızı lusiferaz (CBRLuc), ifade kullanılır, ancak herhangi bir ışıldayan bakteri suşunun kullanılabilir gösterilir görüntüleri) enjekte edilir. </li><li> Fare bir kafes yerleştirin ve anestezi kurtarma sırasında gözlemlemek. </li></ol> 2. Hayvan Anesthetization ve Biyoparlaklık Görüntüleme Hazırlık Fareler XGI-8 Gaz Aneshesia Sistemi kullanılarak izofluran anestezisi. <ol><li> XGI-8 anestezi sistemi çalıştırmadan önce, her bir kömür filtre spreyi tartmak ve ağırlığı ve tarih yazmak. 50 gram ağırlığı başlangıç ​​ağırlığının üzerinde ise, yeni bir teneke kutu ile değiştirin. </li><li> Buharlaştırıcı izofluran seviyesini kontrol edin ve gerekirse doldurun. </li><li> XGI-8 anestezi sistemi ön tahliye pompası açın ve 8 lpm (minuite litre) olarak ayarlanır. </li><li> , Yüksek basınçlı silindir oksijen kaynağı açın ve 55 psig olarak ayarlayın. </li><li> XGI-8 anestezi sistemi ön geçiş oksijen (yeşil) açın. </li><li> Gaz akışı seviyesini ayarlamak için görüntüleme odasına gaz akışını açın. 0.25 lpm ayarlayın ve ardından gaz akışı kapatın. </li><li> Gaz akışı seviyesini ayarlamak için anestezi indüksiyonu odasına gaz akışını açın. 1.5 lpm ayarlayın ve ardından gaz akışı kapatın. </li><li> Buharlaştırıcı ve yüzde 2-2.5 seti ile izofluran açın. Izofluran düzeyde kullanılan hayvanların ve kilo sayısına bağlı olarak ayarlanabilir. </li><li> Indüksiyon odasına fareler koyun ve kapağını kapatın. Indüksiyon odasına gaz akışını açın. 5 oda yerleştirin fareler - 10 minuites tamamen uyutmak kadar. </li><li> Gözlerin optik fare görüntüleme sırasında gözleri korumak ve görüntüleme odasında fareler anestezi manifoldunun üzerine burun konileri biri yere merhem sürün. Fareler arasındaki ışık baffle bitişik hayvan konular üzerine ışık yansımalarını önlemek için kullanın. </li><li> Intraperitoneal inokülasyon ile luciferase (150 mikrogram / gram vücut ağırlığı) enjekte edilir. </li></ol> 3. Biyoparlaklık Görüntüleme <ol><li> Yaşayan Görüntüleme Yazılımı başlatın. </li><li> Sistemi başlatılmadı ise, IVIS Görüntüleme sistemi başlatmak. </li><li> IVIS satın alma kontrol paneli sıra kurulum tıklayarak görüntüleme parametreleri ayarlayın. Görüntüleme Modu lüminesans ve fotoğraf seçin. DLIT 3D rekonstrüksiyon yürütmek için seçenek istenirse, görüntü dizisinin bir parçası olarak, fotoğraf, parlak ve yapısal ışık görüntüleri seçin. Pozlama süresi 0.5 saniye ile 10 dakika arasında ayarlayın. Set binning ve F / örnek beklenen parlaklık dayalı duracaktır. Sadece belirli dalga boylarında ışık elde etmek için planlama sürece, açmak için blok ve filtre emisyon filtre uyarma ayarlayın. DLIT 3D anayasa durumda, farklı dalga boylarında birden fazla emisyon kaynağı doğru lokalizasyon izin filtreleri ayarlayabilirsiniz. Fare ya da hayvan bölgeye yansıması sayısına göre A&#39;dan D&#39;ye kadar FOV ayarlayın. 4-5 fareler için 1 fare, C ve D 2-3 fareler için A ve B seçin. </li><li> Resim Sihirbazı, Kazanç Kontrol Paneli sıra kurulum eklemek için ekle düğmesine tıklayın. </li><li> Elde tıklayarak görüntüleme sırası başlayın. DLIT 3D inşaat halinde, Işıklı görüntüler, farklı dalga boylarında birden fazla emisyon filtreler için alınacaktır. Fotografik ve yapılandırılmış ışık görüntüleri de kazanılmış olacaktır. </li><li> Satın alma sırasında görüntü ve görüntü seviyeleri paneller düzenlemek görünür olacaktır. Sonraki zamanlarda görüntüleri kolay takibi sağlamak ve görüntüleri kaydetmek için resim düzenleme her bir deney için mümkün olduğunca ayrıntılı bilgi olarak doldurun. </li><li> IVIS görüntüleme odasının fareler ReRemove ve onları kendi kafeslerine geri. Bir kurtarma dikkatfareler sağlamak için esthesia yordam tarafından önemli ölçüde etkilenmemiştir. Hayvanlar sürekli tam anestezi kurtarmak (genellikle 1-2 dakika) kadar izlenmelidir. </li></ol> 4. ex vivo Görüntüleme ve Akciğerler Bakterilerin Niceleme CFU Analizi <ol><li> Ötenazi hemen önce, görüntüleme için aynı şekilde luciferase intraperitoneal farelere enjekte edilir. </li><li> Luciferase enjeksiyondan sonra 100 mg / kg pentobarbitol 5 dakika intraperitoneal fareler Euthanize. </li><li> Steril forseps ve makas kullanılarak steril Petri-yemekleri fareler ve yerden akciğerlere Eksplant. </li><li> Yeri Petri yemek görüntüleme odasında eksplante organı içeren ve tüm fare için aynı şekilde biyoparlaklık görüntüler elde. </li><li> Görüntüleme sonra, steril forseps kullanılarak petri eksplante organı kaldırmak ve 1 mL PBS içinde homojenize. </li><li> Dilüsyonları ve plaka dokusu uygun seçici besiyerleri olun. Homojenize doku yeniden kaplama için gerekli olmalıdır -80 ° C saklanabilir. Alternatif olarak, homojen doku RNA veya DNA ekstraksiyonu qPCR bakteri sayıları ölçmek için kullanılabilir. </li></ol> 5. Lüminesans Görüntüleme Analizi <ol><li> &quot;Yaşayan Görüntüleme Yazılımı&quot; Başlat ve görüntü dosyalarını taramak. </li><li> Görüntüleri ayarlamak için &quot;Aracı Paleti &#39;kullanın. Görüntü düzeltme / ayarlar ve ayrı renk ölçekler için min / max filtreleme değiştirmek için tıklayın ayarlayın. </li><li> Işık şiddetinin ölçülmesi için açılan listesinde ROI araçlarını kullanın. ROI şekli seçin, sayısı ve boyutu. Drag ROI resmin üzerine ilgi bölgeye çerçevesi. Tüm yatırım getirisi aynı boyut ve şekil olduğundan emin olun. Tıklayın yatırım getirisini ölçme ve kaydetme, kopyalama ve / veya nicel veri ihracat. </li><li> DLIT 3D rekonstrüksiyonlar durumunda, yapısal ışık görüntü de dahil olmak üzere görüntü sırası yükleyin. Platte Aracı yüzey topoğrafyası tıklayın. Açılan listesinde, yüzey topoğrafyasını oluşturmak için yeniden yapılandırma sekmesini tıklatın. Bir yüzey karışıklık sonra pencerede görünecektir. </li><li> Aracı Platte DLIT 3D rekonstrüksiyon seçin. Açılan listesinde, doku özellikleri ve kaynak spektrumu ayarlamak için Özellikler sekmesini tıklatın. Kas, pek çok koşulda tavsiye edilir. Analiz için dalga boyu seçmek için açılan listesinde, analiz sekmesini tıklatın. Parametre sekmesini tıklatın ve varsayılan değerleri onaylamak veya gerekirse DLIT parametrelerini ayarlamak. 3D analiz başlatmak için Yeniden İnşa sekmesini tıklayın. </li><li> 3D rekonstrüksiyon bittiğinde, 3D görünümü 3 boyutlu rekonstrüksiyon sonuçları gösterecektir. Foton yoğunluğu, vokseller ve DLIT algoritma parametreleri için analiz verileri görmek için sonuçları sekmesine tıklayın. </li><li> Kaydet ve / veya 3 boyutlu rekonstrüksiyon analizlerin sonuçları ihracat rakamları ve veri dosyalarının içine. </li></ol> 6. Temsilcisi Sonuçlar: Bulaşmamış bir fare kontrolü ile birlikte bioluminescent bakteri ile enfekte farelerde biyoparlaklık görüntüleri Şekil 1&#39;de gösterilmiştir. Bioluminescent bakteri ile enfekte farelerde pulmoner akciğerler (Şekil 1) önemli bir sinyal üretir. Lüminesans yoğunluğu içinde toplam akı bir yatırım getirisi (ilgi bölgesi) (Şekil 2) olarak belirlendi. Işık şiddeti için nicel veri sinyal bioluminescent bakteri elde edilir ve negatif kontrol ile karşılaştırıldığında onaylamak için akciğerlere elde edilen bakteri koloni oluşturan birim (CFU) için normalize. Sinyal konumu ve yoğunluğu daha da fare yüzeyinin 11 tomografi lüminesans kaynak DLIT 3D rekonstrüksiyon ile analiz edilebilir. Bu analizler, üretilen bioluminescent sinyal ölçümlerini ve lokalizasyonu izin verir. Işıklı enfekte farelerde kaynağı 3D rekonstrüksiyon sonuçları o ışık fare akciğerler (Şekil 3) elde edilir göstermektedir. Bu lüminesans teyit çıkan fare akciğerlerin ex vivo görüntüleri oldukça yakından yan yana bazı diğer doku ya da organ (Şekil 2C) daha akciğerlere yayılan. <img src="/files/ftp_upload/2547/2547fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1. CBRluc tagged with bioluminescent bakteriler ile pulmoner bulaşmış farelerin Lüminesans görüntüleme. Bulaşmamış kontrolü fare solda ve sağda iki enfekte olmuş fareler vardır. Fareler intratrakeal yolla CBRluc (n = 2) ifade bakteri ile enfekte edildi. Sırt, karın, sol tarafında ve sağ tarafında luciferase enjeksiyondan sonra 10 dakika, 4 pozisyon az 10 dakika lüminesans görüntüleri elde edildi. <img src="/files/ftp_upload/2547/2547fig2.jpg" alt="Şekil 2" /> Şekil 2. CBRluc ifade bakteri ile enfekte farelerden alınan kantitatif ışık şiddeti (A, B) ROI analizi ve dorsal ve ventral pozisyonda ROI ışık sayısal toplam akı Lüminesans görüntüleri, sırasıyla. Bulaşmamış fareler solda ve sağda iki enfekte olmuş fareler vardır. Akciğerler o Lüminesans görüntüler elde edilmiştirf fareler bulaşmamış CBRlux ile enfekte (n = 2). Akciğerler etrafında ışık yoğunluğu ROI analizi ile belirlendi. C) bulaşmamış (üstte) ve enfekte (alt akciğerlerin iki takım) farelerden alınan akciğerlerin ex vivo görüntüleri. Sonra önce ötanazi ve görüntüleri elde edildi luciferase 5 miniuts enjekte edildi. CFU sayısal değerler normalize edilir. <img src="/files/ftp_upload/2547/2547fig3.jpg" alt="Şekil 3" /> Şekil 3. Pulmoner enfekte fare biyoparlaklık kaynak (lar) 3D rekonstrüksiyon fare CBRluc intratrakeal enjeksiyon yoluyla ifade bakteri ile enfekte oldu. Görüntü sırası seri 540 nm ila 700 nm dalga boylarında farklı emisyon filtreler kullanılarak elde edilmiştir. Bir görüntü dizisi lüminesans kaynağı için yapılandırılmış bir imag içeren hayvan konularda 3D sulandırıldıktan için kullanılmıştır. A) fare tomografi farklı pozisyonlarda gösterilen: ön, arka, sağ ve sol. Işık kaynakları, yeniden yapılanma tarafından belirlendiği gibi akciğer içinde yer vokseller (3D fare içinde kırmızı kutu) olarak gösterilir. B) ölçülen ve simüle edilmiş veri Foton densiy harita. Ölçülen ve simüle foton yoğunluğu eğrileri yeniden inşa kalitesi bilgi vermek karşılaştırılması. Benzer ölçülen ve simüle foton yoğunlukları kaliteli rekonstrüksiyonlar sonucudur.

<ol>
	<li>Wilson, T., Hastings, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioluminescence.">Bioluminescence.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 14, 197-230 (1998).</li><li>Contag, C. H., Bachmann, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+in+vivo+bioluminescence+imaging+of+gene+expression.">Advances in in vivo bioluminescence imaging of gene expression.</a> Annu Rev Biomed Eng. 4, 235-260 (2002).</li><li>Hutchens, M., Luker, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+bioluminescence+imaging+to+the+study+of+infectious+diseases.">Applications of bioluminescence imaging to the study of infectious diseases.</a> Cell Microbiol. 9, 2315-2322 (2007).</li><li>Doyle, T. C., Burns, S. M., Contag, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+bioluminescence+imaging+for+integrated+studies+of+infection.">In vivo bioluminescence imaging for integrated studies of infection.</a> Cell Microbiol. 6, 303-317 (2004).</li><li>Wood, K. V., Lam, Y. A., Seliger, H. H., McElroy, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complementary+DNA+coding+click+beetle+luciferases+can+elicit+bioluminescence+of+different+colors.">Complementary DNA coding click beetle luciferases can elicit bioluminescence of different colors.</a> Science. 244, 700-702 (1989).</li><li>Wet, J. R. d. e., Wood, K. V., Helinski, D. R., DeLuca, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+of+firefly+luciferase+cDNA+and+the+expression+of+active+luciferase+in+Escherichia+coli.">Cloning of firefly luciferase cDNA and the expression of active luciferase in Escherichia coli.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 82, 7870-7873 (1985).</li><li>Hastings, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemistries+and+colors+of+bioluminescent+reactions:+a+review.">Chemistries and colors of bioluminescent reactions: a review.</a> Gene. 173, 5-11 (1996).</li><li>Zhao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emission+spectra+of+bioluminescent+reporters+and+interaction+with+mammalian+tissue+determine+the+sensitivity+of+detection+in+vivo.">Emission spectra of bioluminescent reporters and interaction with mammalian tissue determine the sensitivity of detection in vivo.</a> J Biomed Opt. 10, 41210-41210 (2005).</li><li>Rice, B. W., Cable, M. D., Nelson, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+light-emitting+probes.">In vivo imaging of light-emitting probes.</a> J Biomed Opt. 6, 432-440 (2001).</li><li>Contag, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photonic+detection+of+bacterial+pathogens+in+living+hosts.">Photonic detection of bacterial pathogens in living hosts.</a> Mol Microbiol. 18, 593-603 (1995).</li><li>Kuo, C., Coquoz, O., Troy, T. L., Xu, H., Rice, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+reconstruction+of+in+vivo+bioluminescent+sources+based+on+multispectral+imaging.">Three-dimensional reconstruction of in vivo bioluminescent sources based on multispectral imaging.</a> J Biomed Opt. 12, 024007-024007 (2007).</li><li>Weissleder, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+clearer+vision+for+in+vivo+imaging.">A clearer vision for in vivo imaging.</a> Nat Biotechnol. 19, 316-317 (2001).</li></ol>

Hayvanlar üzerinde yapılan çalışmalar, Texas A &amp; M Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından belirlenen kurallara ve yönetmeliklere uygun olarak yapıldı.

Bu protokoller genellikle yüksek kaliteli görüntüler neden olmakla birlikte, bu görüntüleme çalışmalarından elde edilen doğru ve tutarlı verilerin elde etmek için birkaç temel sorunları dikkate almak önemlidir. Lüminesans görüntü sinyali arka plan üzerinde ve kamera doymuş değildir sağlamak için 600 ila 60.000 sayımlar elde edilmelidir. Elde edilen sinyal 600 den az ise maruz kalma koşullarını sayımı artırmak için ayarlanabilir olmalıdır. 60.000 &#39;den fazla elde edilen sinyal ise, ...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Isoflurane</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VETONE</td>
<td>501027 </td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ketamine </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Butler animal health supply</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Xylazine </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MP Biomedical</td>
<td>158307</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Luciferin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>GMT</td>
<td>LUCK-100</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fetal plus solution</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VOR tech pharmaceutical</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cathether (22G x 1&#x201D;)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>TERUMO</td>
<td>OX2225CA</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Guide wire </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hallowell EMC</td>
<td>210A3491</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Octocope with speculum </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hallowell EMC</td>
<td>000A3748</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Xenogen IVIS system</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Caliper Life Sciences</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>XGI-8-gas Anesthsia System</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Caliper Life Sciences</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Living Imaging Software</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Caliper Life Sciences</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Transparent nose cones</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Caliper Life Sciences</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Light baffle divider </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Caliper Life Sciences</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

using luciferase to image bacterial infections in mice

Görüntüleme biyolojik süreçleri izlemek için kullanılan değerli bir tekniktir. Özellikle, kanser hücreleri, kök hücreleri, spesifik immün hücre tipleri, viral patojenler, parazit ve bakterilerin varlığı hayvanlar 1-2 yaşam içinde gerçek zamanlı olarak takip edilebilir. Patojenlerin çalışmaya biyoparlaklık görüntüleme Uygulama 3-4 hayvan modellerinde enfeksiyon analiz için geleneksel stratejiler kıyasla avantajları vardır. Enfeksiyonlar, zamanla patojenin yerini ve miktarını belirlemek için ötenazi gerektirmeden bireysel hayvanlar içinde görüntülenir olabilir. Optik görüntüleme, daha önce enfekte olduğu bilinen sitelerin örnekleme yerine, tüm doku ve organları kapsamlı inceleme sağlar. Buna ek olarak, belirli dokulara aşılama doğruluğunu doğrudan başarısız tüm deney boyunca ekildi önce ileri hayvanları taşıyan belirlenir. Görüntüleme, her hayvan ayrı ayrı takip edilmesi gereken hayvanlar arasında değişkenlik, kontrol edilebilir. Görüntüleme çünkü yeteneği 3-4 patojen yükü belirlemek için örnek dokulara kalmadan birçok noktadan veri elde etmek için gereken hayvan sayısının büyük ölçüde azaltma potansiyeli vardır. Bu protokol, canlı hayvanlarda enfeksiyonlara lusiferaz ifade rekombinant bakteri suşları için biyoparlaklık görüntüleme kullanarak görselleştirmek için yöntemler anlatılmaktadır. Tıklayın böceği (CBRLuc) ve ateşböceği luciferases (FFluc) bir substrat luciferase 5-6 olarak kullanmaktadır. CBRluc ve FFluc tarafından üretilen ışık, canlı hayvan modelleri 7-9 optik görüntüleme için bu luciferases mükemmel gazetecilere, 500 nm&#39;den 700 nm&#39;ye kadar geniş bir dalga boyu vardır. 600 nm&#39;den daha fazla ışık dalga boyu, hemoglobin tarafından emilimini önlemek ve böylece verimli memeli doku yoluyla seyahat etmek gereklidir, çünkü bu öncelikle. Lusiferaz genetik ışık sinyali üretmek için 10 bakteri girmiş. Fare akciğer enfeksiyonları gerçek zamanlı olarak izlenmesine olanak intratrakeal bioluminescent bakteri inoküle. Luciferase enjeksiyondan sonra, görüntüler IVIS Görüntüleme Sistemi kullanılarak elde edilir. Görüntüleme sırasında, fare XGI-8 Gaz Anethesia Sistemi kullanılarak izofluran anestezisi. Görüntüler, yerelleştirme ve sinyal kaynağını, sırasıyla, bakteriyel enfeksiyon site (ler) ve sayı temsil eden ölçmek için analiz edilebilir. Görüntüleme sonra, CFU belirlenmesi bakteri varlığını doğrulamak için homojenize dokusu üzerinde yapılır. Bakterilerin çeşitli dozlarda lüminesans bakteri sayısı ilişkilendirmek için kullanılır. Görüntüleme patogenezi ve antibakteriyel bileşikler ve aşıların etkinliğini değerlendirme çalışması yapılabilir.

Watch this Scientific Journal Video about Using Luciferase to Image Bacterial Infections in Mice at JoVE.com

Using Luciferase to Image Bacterial Infections in Mice

Yaşayan hayvanların bakteriyel enfeksiyonlar biyoparlaklık görüntüleme yöntemleri açıklanmıştır. Patojenler, canlı hayvanlarda enfeksiyon optik tüm vücut görüntüleme sağlayan lusiferaz ifade etmek için modifiye edilmiştir. Hayvan modelleri lusiferaz ifade patojenler ile enfekte olan ve hastalık ortaya çıkan ders biyoparlaklık görüntüleme ile gerçek zamanlı olarak görüntülenebilmekte.

Farelerde Görüntü Bakteriyel Enfeksiyonlar Lusiferaz Kullanımı

Imaging is a valuable technique that can be used to monitor biological processes.  In particular, the presence of cancer cells, stem cells, specific ...

using-luciferase-to-image-bacterial-infections-in-mice

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

20.3K Görüntüleme.  Texas A&M Health Science Center. Yaşayan hayvanların bakteriyel enfeksiyonlar biyoparlaklık görüntüleme yöntemleri açıklanmıştır. Patojenler, canlı hayvanlarda enfeksiyon optik tüm vücut görüntüleme sağlayan lusiferaz ifade etmek için modifiye edilmiştir. Hayvan modelleri lusiferaz ifade patojenler ile enfekte olan ve hastalık ortaya çıkan ders biyoparlaklık görüntüleme ile gerçek zamanlı olarak görüntülenebilmekte.

Video: Using Luciferase to Image Bacterial Infections in Mice

Assessing Stomatal Response to Live Bacterial Cells using Whole Leaf Imaging

Stomata are natural openings in the plant epidermis responsible for gas exchange between plant interior and environment. They are formed by a pair of guard cells, which are able to close the stomatal pore in response to a number of external factors including light intensity, carbon dioxide concentration, and relative humidity (RH). The stomatal pore is also the main route for pathogen entry into leaves, a crucial step for disease development. Recent studies have unveiled that closure of the pore is effective in minimizing bacterial disease development in Arabidopsis plants; an integral part of plant innate immunity. Previously, we have used epidermal peels to assess stomatal response to live bacteria (Melotto et al. 2006); however maintaining favorable environmental conditions for both plant epidermal peels and bacterial cells has been challenging. Leaf epidermis can be kept alive and healthy with MES buffer (10 mM KCl, 25 mM MES-KOH, pH 6.15) for electrophysiological experiments of guard cells. However, this buffer is not appropriate for obtaining bacterial suspension. On the other hand, bacterial cells can be kept alive in water which is not proper to maintain epidermal peels for long period of times. When an epidermal peel floats on water, the cells in the peel that are exposed to air dry within 4 hours limiting the timing to conduct the experiment. An ideal method for assessing the effect of a particular stimulus on guard cells should present minimal interference to stomatal physiology and to the natural environment of the plant as much as possible. We, therefore, developed a new method to assess stomatal response to live bacteria in which leaf wounding and manipulation is greatly minimized aiming to provide an easily reproducible and reliable stomatal assay. The protocol is based on staining of intact leaf with propidium iodide (PI), incubation of staining leaf with bacterial suspension, and observation of leaves under laser scanning confocal microscope. Finally, this method allows for the observation of the same live leaf sample over extended periods of time using conditions that closely mimic the natural conditions under which plants are attacked by pathogens.

We have developed a simple and reproducible protocol to access stomatal response to live bacteria. This method minimizes wounding and manipulation of the leaf as compared to the use of epidermal peels reported previously.

Tüm Yaprak Görüntüleme kullanarak Bakteriyel Hücreler Live Stoma Tepki Değerlendirilmesi

Stomata are natural openings in the plant epidermis responsible for gas exchange between plant interior and environment. They are formed by a pair of ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes (Listeria) is a Gram-positive facultative intracellular pathogen1. Mouse studies typically employ intravenous injection of Listeria, which results in systemic infection2. After injection, Listeria quickly disseminates to the spleen and liver due to uptake by CD8&alpha;+ dendritic cells and Kupffer cells3,4. Once phagocytosed, various bacterial proteins enable Listeria to escape the phagosome, survive within the cytosol, and infect neighboring cells5. During the first three days of infection, different innate immune cells (e.g. monocytes, neutrophils, NK cells, dendritic cells) mediate bactericidal mechanisms that minimize Listeria proliferation. CD8+ T cells are subsequently recruited and responsible for the eventual clearance of Listeria from the host, typically within 10 days of infection6.
Successful clearance of Listeria from infected mice depends on the appropriate onset of host immune responses6	. There is a broad range of sensitivities amongst inbred mouse strains7,8. Generally, mice with increased susceptibility to Listeria infection are less able to control bacterial proliferation, demonstrating increased bacterial load and/or delayed clearance compared to resistant mice. Genetic studies, including linkage analyses and knockout mouse strains, have identified various genes for which sequence variation affects host responses to Listeria infection6,8-14. Determination and comparison of infection kinetics between different mouse strains is therefore an important method for identifying host genetic factors that contribute to immune responses against Listeria. Comparison of host responses to different Listeria strains is also an effective way to identify bacterial virulence factors that may serve as potential targets for antibiotic therapy or vaccine design.
We describe here a straightforward method for measuring bacterial load (colony forming units [CFU] per tissue) and preparing single-cell suspensions of the liver and spleen for FACS analysis of immune responses in Listeria-infected mice. This method is particularly useful for initial characterization of Listeria infection in novel mouse strains, as well as comparison of immune responses between different mouse strains infected with Listeria. We use the Listeria monocytogenes EGD strain15 that, when cultured on blood agar, exhibits a characteristic halo zone around each colony due to &beta;-hemolysis1 (Figure 1). Bacterial load and immune responses can be determined at any time-point after infection by culturing tissue homogenate on blood agar plates and preparing tissue cell suspensions for FACS analysis using the protocols described below. We would note that individuals who are immunocompromised or pregnant should not handle Listeria, and the relevant institutional biosafety committee and animal facility management should be consulted before work commences.

Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes is a model organism for studying immune responses and genetic susceptibility to intracellular bacteria in mice. This method enables one to measure bacterial load and generate single-cell suspensions of the liver and spleen from mice for FACS analysis to determine changes in immune cells due to Listeria infection.

Ile Enfekte Fare Bakteriyel Yük ve Bağışıklık Yanıtları Ölçüm Listeria monocytogenes</em

Listeria monocytogenes (Listeria) is a Gram-positive facultative intracellular pathogen1. Mouse studies typically employ intravenous injection of ...

4D Multimodality Imaging of Citrobacter rodentium Infections in Mice

This protocol outlines the steps required to longitudinally monitor a bioluminescent bacterial infection using composite 3D diffuse light imaging tomography with integrated &mu;CT (DLIT-&mu;CT) and the subsequent use of this data to generate a four dimensional (4D) movie of the infection cycle. To develop the 4D infection movies and to validate the DLIT-&mu;CT imaging for bacterial infection studies using an IVIS Spectrum CT, we used infection with bioluminescent C. rodentium, which causes self-limiting colitis in mice. In this protocol, we outline the infection of mice with bioluminescent C. rodentium and non-invasive monitoring of colonization by daily DLIT-&mu;CT imaging and bacterial enumeration from feces for 8 days.
The use of the IVIS Spectrum CT facilitates seamless co-registration of optical and &mu;CT scans using a single imaging platform. The low dose &mu;CT modality enables the imaging of mice at multiple time points during infection, providing detailed anatomical localization of bioluminescent bacterial foci in 3D without causing artifacts from the cumulative radiation. Importantly, the 4D movies of infected mice provide a powerful analytical tool to monitor bacterial colonization dynamics in vivo.

4D Multimodality Imaging of Citrobacter rodentium Infections in Mice

Multi-modality imaging is a valuable approach for studying bacterial colonization in small animal models. This protocol outlines infection of mice with bioluminescent Citrobacter rodentium and the longitudinal monitoring of bacterial colonization using composite 3D diffuse light imaging tomography with &mu;CT imaging to create a 4D movie of C. rodentium infection.

4D modelli Görüntüleme<em&gt; Citrobacter rodentium</emFarelerde&gt; Enfeksiyonlar

This protocol outlines the steps required to  longitudinally monitor a bioluminescent bacterial infection using composite 3D diffuse light imaging ...

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

A mouse model of chronic airway infection is a key asset in cystic fibrosis (CF) research, although there are a number of concerns regarding the model itself. Early phases of inflammation and infection have been widely studied by using the Pseudomonas aeruginosa agar-beads mouse model, while only few reports have focused on the long-term chronic infection in vivo. The main challenge for long term chronic infection remains the low bacterial burden by P. aeruginosa and the low percentage of infected mice weeks after challenge, indicating that bacterial cells are progressively cleared by the host.
This paper presents a method for obtaining efficient long-term chronic infection in mice. This method is based on the embedding of the P. aeruginosa clinical strains in the agar-beads in vitro, followed by intratracheal instillation in C57Bl/6NCrl mice. Bilateral lung infection is associated with several measurable read-outs including weight loss, mortality, chronic infection, and inflammatory response. The P. aeruginosa RP73 clinical strain was preferred over the PAO1 reference laboratory strain since it resulted in a comparatively lower mortality, more severe lesions, and higher chronic infection. P. aeruginosa colonization may persist in the lung for over three months. Murine lung pathology resembles that of CF patients with advanced chronic pulmonary disease.
This murine model most closely mimics the course of the human disease and can be used both for studies on the pathogenesis and for the evaluation of novel therapies.

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

We describe the agar-beads method to establish persistent long-term chronic Pseudomonas aeruginosa airway infection in the mouse model.

Uzun Vadeli Kronik<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</emFarelerde&gt; Havayolu Enfeksiyon

A mouse model of chronic airway infection is a key asset in cystic fibrosis (CF) research, although there are a number of concerns regarding the model ...

Humanized Mouse Model to Study Bacterial Infections Targeting the Microvasculature

Neisseria meningitidis causes a severe, frequently fatal sepsis when it enters the human blood stream. Infection leads to extensive damage of the blood vessels resulting in vascular leak, the development of purpuric rashes and eventual tissue necrosis. Studying the pathogenesis of this infection was previously limited by the human specificity of the bacteria, which makes in vivo models difficult. In this protocol, we describe a humanized model for this infection in which human skin, containing dermal microvessels, is grafted onto immunocompromised mice. These vessels anastomose with the mouse circulation while maintaining their human characteristics. Once introduced into this model, N. meningitidis adhere exclusively to the human vessels, resulting in extensive vascular damage, inflammation and in some cases the development of purpuric rash. This protocol describes the grafting, infection and evaluation steps of this model in the context of N. meningitidis infection. The technique may be applied to numerous human specific pathogens that infect the blood stream.

Neisseria meningitidis is a human specific pathogen that infects blood vessels. In this protocol human microvessels are introduced into a mouse by grafting human skin onto immunocompromised mice. Bacteria adhere extensively to the human vessels, leading to vascular damage and development of the purpuric rash typically observed in human cases.

Insanlaşmış Fare Modeli mikrovaskülatürde Hedefleme Bakteriyel Enfeksiyonlar Eğitim için

Neisseria meningitidis causes a severe, frequently fatal sepsis when it enters the human blood stream. Infection leads to extensive damage of the blood ...

Assessing Bacterial Invasion of Cardiac Cells in Culture and Heart Colonization in Infected Mice Using Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes is a Gram-positive facultative intracellular pathogen that is capable of causing serious invasive infections in immunocompromised patients, the elderly, and pregnant women. The most common manifestations of listeriosis in humans include meningitis, encephalitis, and fetal abortion. A significant but much less documented sequelae of invasive L. monocytogenes infection involves the heart. The death rate from cardiac illness can be up to 35% despite treatment, however very little is known regarding L. monocytogenes colonization of cardiac tissue and its resultant pathologies. In addition, it has recently become apparent that subpopulations of L. monocytogenes have an enhanced capacity to invade and grow within cardiac tissue. This protocol describes in detail in vitro and in vivo methods that can be used for assessing cardiotropism of L. monocytogenes isolates. Methods are presented for the infection of H9c2 rat cardiac myoblasts in tissue culture as well as for the determination of bacterial colonization of the hearts of infected mice. These methods are useful not only for identifying strains with the potential to colonize cardiac tissue in infected animals, but may also facilitate the identification of bacterial gene products that serve to enhance cardiac cell invasion and/or drive changes in heart pathology. These methods also provide for the direct comparison of cardiotropism between multiple L. monocytogenes strains.

Assessing Bacterial Invasion of Cardiac Cells in Culture and Heart Colonization in Infected Mice Using Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes causes fetal infections in pregnant women and meningitis in susceptible populations. Subpopulations of bacteria can colonize cardiac tissue, causing myocarditis in patients and laboratory animals. Here we present a protocol that describes how to assess L. monocytogenes cardiac cell invasion in vitro and cardiac colonization in infected animals.

Listeria monocytogenes Kullanarak Enfekte Farelerde Kültür ve Kalp Kolonizasyonunda Kardiyak Hücrelerin Bakteriyel İstilasının Değerlendirilmesi

Listeria monocytogenes is a Gram-positive facultative intracellular pathogen that is capable of causing serious invasive infections in immunocompromised ...

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence factors, which can subvert and manipulate key host functions. The study of host/pathogen interactions is therefore extremely important to understand bacterial infections and develop alternative strategies to counter infectious diseases. This approach however, requires the development of new high-throughput assays for the unbiased, automated identification and characterization of bacterial virulence determinants. Here, we describe a method for the generation of a GFP-tagged mutant library by transposon mutagenesis and the development of high-content screening approaches for the simultaneous identification of multiple transposon-associated phenotypes. Our working model is the intracellular bacterial pathogen Coxiellaburnetii, the etiological agent of the zoonosis Q fever, which is associated with severe outbreaks with a consequent health and economic burden. The obligate intracellular nature of this pathogen has, until recently, severely hampered the identification of bacterial factors involved in host pathogen interactions, making of Coxiella the ideal model for the implementation of high-throughput/high-content approaches.

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Coxiella burnetii is an obligate intracellular Gram-negative bacterium responsible for the zoonotic disease Q fever. Here we describe methods for the generation of Coxiella fluorescent transposon mutants as well as the automated identification and analysis of the resulting internalization, replication and cytotoxic phenotypes.

Üretim ve Çok fenotipik Yüksek içerik Eleme<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; Transposon Mutantlar

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence ...

Human Placental and Decidual Organ Cultures to Study Infections at the Maternal-fetal Interface

The placenta shows a large degree of interspecies anatomic variability. To best understand biology and pathophysiology of the human placenta, it is imperative to design experiments using human cells and tissues. An advantage of organ culture is maintenance of three-dimensional (3D) structural organization and extracellular matrix. The goal of the method described here is successful establishment of ex vivo human gestational tissue organ cultures and their healthy culture maintenance for 72-96 hr. The protocol details the immediate processing of research-consented, placental and decidual specimens fresh from the operating suite. These are abundant specimens that would otherwise be discarded. Detailed instructions on the sterile collection of these samples, including morphologic details on how to select appropriate tissues to establish 3D organ cultures, is provided. Placental villous and decidual tissues are microdissected into 2-3 mm3 pieces and placed separately on matrix-lined transwell filters and cultured for several days. Villous and decidual organ cultures are well suited for the study of human host-pathogen interaction. As compared to other model organisms, these human cultures are particularly advantageous to examine mechanism of infection for pathogens that demonstrate variable patterns of host specificity. As an example, we demonstrate infection of placental and decidual organ cultures with the clinically relevant, facultative intracellular bacterial pathogen Listeria monocytogenes.

A simple method to establish primary human placental (villous) and decidual organ cultures is described. Villous and decidual organ cultures are invaluable tools for studying pathogenesis at the human maternal-fetal interface. Infection with the facultative intracellular bacterium Listeria monocytogenes is demonstrated.

İnsan Plasental ve Desidual Organ Kültürleri Maternal-Fetal Arayüz de Enfeksiyonlar Eğitim için

The placenta shows a large degree of interspecies anatomic variability. To best understand biology and pathophysiology of the human placenta, it is ...

Using the Protozoan Paramecium caudatum as a Vehicle for Food-borne Infections in Zebrafish Larvae

Due to their transparency, genetic tractability, and ease of maintenance, zebrafish (Danio rerio) have become a widely-used vertebrate model for infectious diseases. Larval zebrafish naturally prey on the unicellular protozoan Paramecium caudatum. This protocol describes the use of P. caudatum as a vehicle for food-borne infection in larval zebrafish. P. caudatum internalize a wide range of bacteria and bacterial cells remain viable for several hours. Zebrafish then prey on P. caudatum, the bacterial load is released in the foregut upon digestion of the paramecium&#160;vehicle, and the bacteria colonize the intestinal tract. The protocol includes a detailed description of paramecia maintenance, loading with bacteria, determination of bacterial degradation and dose, as well as infection of zebrafish by feeding with paramecia. The advantage of using this method of food-borne infection is that it closely mimics the mode of infection observed in human disease, leads to more robust colonization compared to immersion protocols, and allows the study of a wide range of pathogens. Food-borne infection in the zebrafish model can be used to investigate bacterial gene expression within the host, host-pathogen interactions, and hallmarks of pathogenicity including bacterial burden, localization, dissemination and morbidity.

Using the Protozoan Paramecium caudatum as a Vehicle for Food-borne Infections in Zebrafish Larvae

Zebrafish (Danio rerio) are becoming a widely-used vertebrate animal model for microbial colonization and pathogenesis. This protocol describes the use of the protozoan Paramecium caudatum as a vehicle for food-borne infection in zebrafish larvae. P. caudatum readily internalizes bacteria and get taken up by larval zebrafish through natural preying behavior.

Protozoon Terliksi Hayvan caudatum zebra balığı larva gıda kaynaklı enfeksiyonlar için bir araç olarak kullanma

Due to their transparency, genetic tractability, and ease of maintenance, zebrafish (Danio rerio) have become a widely-used vertebrate model for ...

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing activity by assessing the ability of antibodies in serum to bind to bacteria and activate complement. This complement activation results in the lysis and killing of the target bacteria. These assays are valuable because they go beyond quantifying antibody production to elucidate the biological functions that these antibodies have, allowing researchers to study the role that antibodies may play in preventing infection. SBAs have been used to study immune responses for many human pathogens, but there is no widely accepted methodology for Shigella at present. Historically, SBAs have been very labor-intensive, requiring many time-consuming steps to accurately quantify surviving bacteria. This protocol describes a simple, robust, and high-throughput assay that measures functional antibodies specific for Shigella in serum in vitro. The method described here offers many advantages over traditional SBAs, including the use of frozen bacterial stocks, 96 well assay plates, a micro-culture system, and automated colony-counting. All of these modifications make this assay less labor-intensive and more high-throughput. This protocol is simpler and faster to perform than traditional SBAs while still using simple technologies and readily available reagents. The protocol has been successfully applied in multiple independent laboratories and the assay is robust and reproducible. The assay can be used to assess immune responses in pre-clinical as well as clinical studies. Quantifying shigellacidal antibody titers both before and after antigen exposure (either by immunization or infection) allows for a broader understanding of how functional antibody responses are generated and their contribution to protective immunity. The development of this standardized, well-characterized assay may greatly facilitate Shigella vaccine design.

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

Here we present a protocol to measure Shigellacidal activity of antibodies in serum. Serum is mixed with bacteria and exogenous complement, incubated, and the reaction mixture is plated on agar plates. Viable bacteria form colonies which are counted, using an automated colony enumerator, and used to determine the bactericidal titer.

Bir yüksek-den geçerek Shigella-belirli bakterisidal tahlil

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing ...