Bu protokol, yabancı madde implantasyonu veya immün baskılama gerek kalmadan kronik Pseudomonas aeruginosa yara enfeksiyonu için bir model açıklar, çünkü önemlidir. Pseudomonas aeruginosa ile gecikmiş aşılama 24 saat sonra tam kalınlıkta eksizyonel yara prostalls hızlı açıklık ve bakteri yayılması, 7 ila 10 gün süren bir enfeksiyon oluşturur. Bu benzersiz model bakteriyel patogenez intifaları, konak patojen etkileşimleri ve kronik Pseudomonas aeruginosa yara enfeksiyonları için yeni tedavilerin geliştirilmesi için yararlı bir araç olacaktır.
Prosedürün bir gösterisinde bana yardımcı olan Dan Liu, Bollyky Laboratuvarı'ndan bir tıp öğrencisi olacak. İşleme başlamadan önce, temel ağırlık elde etmek ve fareyi eğilimli konuma getirmek için sekiz ila 12 haftalık bir fareyi tartın. Pedal refleksine yanıt eksikliğini doğruladıktan sonra, fareye her kanadında önceden ısıtılmış steril %0,9 sodyum klorür 250 mikrolitre sodyum klorür enjekte edin.
Farenin sırt alanından saç kaldırmak ve maruz kalan cilde piliç krem ince bir tabaka uygulamak için bir elektrikli tıraş makinesi kullanın. 20 ila 60 saniye sonra, ılık suda nemlendirilmiş gazlı bez ile saç ve aşırı losyonu çıkarın. Tam kalınlıkta eksizyonel yara cerrahisi için, ilk deri altı farenin orta dorsal alanda sürekli salınım buprenorfin kilogram başına 0,6 ila bir miligram enjekte etmek için 25 gauge iğne kullanın ve üç alternatif steril Betadine ve alkol bezleri ile dairesel bir şekilde cerrahi site silmek.
Cerrahi site nin üzerine plastik bir yapışkan şal drap yerleştirin ve caudally cilt gergin germek. Cilt kuruduğunda, sol dorsal epidermis ile ilk kesi yapmak için steril altı milimetre çapında deri biyopsisi yumruk kullanın, sağ dorsal epidermis üzerinde ikinci bir kesi takip. Sol özetlenen yara alanının merkezinden cildi çadır ve epidermal ve dermal katmanları çıkarmak için makas kullanın forceps kullanın.
Simetrik eksizyonel yaralar oluşturmak için sağ daki yara bölgesinde kesi tekrarladıktan sonra her iki yarayı 50 mikrolitre steril salin ile yıkayın. Cerrahi bölge ve çevresindeki cilt kuruduğunda, yaraları ve dorsum şeffaf bir film pansum ile kapatın ve fareyi tam recumbency kadar izleme ile bir ısıtma yastığı üzerinde temiz bir kafese yerleştirin. Ameliyattan 24 saat sonra, yeniden anestezi li fareyi tekrar tartın ve hayvana her iki tarafta da 250 mikrolitre önceden ısıtılmış steril klorür enjekte edin.
Daha sonra, 27 gauge iğne ile donatılmış 500 mikrolitre tüberkülin emniyet kapağı şırınga içine parlak P.aeruginosa gerinim süspansiyon 100 mikrolitre yük ve her yara içine şeffaf film pansuman yoluyla bakteri süspansiyon 40 mikrolitre enjekte. Bakteriyel süspansiyonun iyi bir şekilde karıştırıldığından ve şeffaf pansumanın sağlam olduğundan emin olun. Şeffaf pansumanı iğne çerçevesi yan tarafı yukarı doğru sadece bir kez deldiğinizden emin olun.
Daha sonra izleme ile bir ısıtma sayfasında kendi kafese fare dönmek ve kafesin zemin üzerinde gıda pelet arasında sandviç yüksek kalorili besin takviyesi yapıştırmak sağlar. Bir LB agar plaka üzerinde kalan inoculum plaka ve uygulanan bakteri sayısını doğrulamak için koloniler saymak. Enfekte yaraların canlı görüntülemesinde, farelerin görüntüleme aletine taşınması için biyo güvenlik seviyesi iki koruma protokolünü uygulayın ve anestezili fareyi görüntüleme odası içinde yatkın konuma yerleştirin.
Görüntüleme yazılımında, pozlama süresini, binning, f-stop'u ve görüş alanını deney için uygun olarak ayarlayın. Daha sonra, yara yerinde ilgi bir bölge oluşturmak ve saniyede fotonlar ortalama algılanan akı ölçmek. Arka planı ölçmek için, görüntüleme platformunda rasgele bir alan üzerinde ilgi alanı oluşturun ve saniyede fotonların arka plan numarasını çıkarın.
Deneyin sonunda, bir biyo güvenlik kabininde, yara yataklarını çıkarmak için steril makas ve çömeçler kullanın ve her yatağı 1,5 mililitrelik polipropilen tüpe bir mililitre steril PBS'ye yerleştirin. Makasla yara dokusunu doğrama ve doku parçalarını iki saat boyunca dakikada 300 dönüşte dört derece santigrat derecede bir çalkalayıcıya katarak. Kuluçka sonunda, girdap 10 saniye boyunca seri PBS bakteriyel atık seyreltilmiş ve lb agar üzerinde seyreltilmiş bakteriyel atık kaplama önce 10 saniye boyunca bakteriyel yükü ölçmek için.
Görüntüleme optik sistemi kullanılarak elde edilen bu temsili görüntü, bu modelin tespit edilebilir parlaklık la sonuçverdiğini göstermektedir. Bu deneyde, enfeksiyon gün üç post aşılama doruğa ve biyolüminesans ve koloni sayıları hem dayalı yedi gün sonrası aşılama devam etti. Yaradan izole edilen bakterilerin kültürü, yara başına oluşan ölçülebilir koloni nin tespit edilen lüminesansla ilişkili olduğunu daha da göstermektedir.
Enjeksiyondan hemen sonra ilk hızlı kilo kaybı olmasına rağmen, tuzlu enjeksiyonlar ve ek beslenme fareleri ilk ağırlıklarına geri getirebilir. Yaraların %50'sinin önemli ölçüde enfekte olacağı hesaplanan aşılama dozu, mililitre başına ikinci koloni oluşturan ünitelere yaklaşık 7.7 kat 10 olarak saptanmıştır. Mililitre başına dördüncü koloni oluşturan birimlere 10 kereden daha yüksek dozlar %100 enfeksiyon oranı sağlar.
Pseudomonas aeruginosa için yeni potansiyel tedavileri araştırmak için yaralama ve aşılama prosedürlerinden sonra çeşitli topikal ve sistemik tedaviler uygulanabilir. Pseudomonas aeruginosa ve enfekte fareler ile tüm çalışmalar, araştırmacının kurumsal biyo güvenlik ve hayvan kullanım komitesi yönergelerine uygun olarak BSL-2 güvenlik önlemleri ile yapılmalıdır.
