Este protocolo es significativo porque describe un modelo para la infección crónica de la herida de Pseudomonas aeruginosa sin necesidad de implantación de material extraño o supresión inmune. La inoculación tardía con Pseudomonas aeruginosa 24 horas después de la intoxicación por escisión de espesor completo prostales el rápido aclaramiento y diseminación de la bacteria, estableciendo una infección que dura de siete a 10 días. Este modelo único será una herramienta útil para las investigaciones de la patogénesis bacteriana, las interacciones de patógenos del huésped y el desarrollo de nuevas terapias para las infecciones crónicas de la herida de Pseudomonas aeruginosa.
Ayudándome en una demostración del procedimiento estará Dan Liu, un estudiante de medicina del Laboratorio Bollyky. Antes de comenzar el procedimiento, pesar un ratón anestesado de ocho a 12 semanas de edad para obtener un peso basal y colocar el ratón en la posición propensa. Después de confirmar la falta de respuesta al reflejo del pedal, inyecte por vía subcutánea al ratón con 250 microlitros de cloruro estéril precalentó 0,9% de sodio en cada flanco.
Usa una afeitadora eléctrica para eliminar el cabello de la zona dorsal del ratón y aplica una fina capa de crema depilatoria sobre la piel expuesta. Después de 20 a 60 segundos, retira el cabello y el exceso de loción con gasa humedecida en agua tibia. Para la cirugía de heridas por escisión de espesor completo, utilice primero una aguja de calibre 25 para inyectar por vía subcutánea de 0,6 a un miligramo por kilogramo de buprenorfina de liberación sostenida en la zona dorsal media del ratón y limpie el sitio quirúrgico de forma circular con tres betadines estériles alternativas y hisopos de alcohol.
Coloque un plástico de plástico sobre el sitio quirúrgico y estire la piel tensa caudalmente. Cuando la piel se haya secado, utilice un punzón estéril de biopsia de piel de seis milímetros de diámetro para hacer una incisión inicial a través de la epidermis dorsal izquierda, seguida de una segunda incisión en la epidermis dorsal derecha. Utilice fórceps para hacer carpa de la piel desde el centro del área de la herida delineada a la izquierda y use tijeras para extirpar las capas epidérmicas y dérmicas.
Después de repetir la incisión en el área de la herida delineada derecha para crear heridas escisionales simétricas, lave ambas heridas con 50 microlitros de solución salina estéril. Cuando el sitio quirúrgico y la piel circundante se hayan secado, cubra las heridas y el dorso con un vendaje de película transparente y coloque el ratón en una jaula limpia en una almohadilla de calentamiento con monitoreo hasta la recumbencia completa. 24 horas después de la cirugía, pesar el ratón anestesiado de nuevo e inyectar el animal por vía subcutánea con 250 microlitros de cloruro de sodio estéril precalentó 0.9%en ambos flancos.
A continuación, cargue 100 microlitros de la cansillado luminiscente P.aeruginosa en una jeringa de tapa de seguridad de tuberculina de 500 microlitros equipada con una aguja de calibre 27 e inyecte 40 microlitros de suspensión bacteriana a través del apósito de película transparente en cada herida. Asegúrese de que la suspensión bacteriana esté bien mezclada y que el apósito transparente esté intacto. Asegúrese de perforar el apósito transparente una sola vez con el bisel de la aguja hacia arriba.
A continuación, devuelva el ratón a su jaula en una página de calentamiento con monitoreo y proporcione pasta de suplemento nutricional de alta calorías intercalada entre pellets de alimentos en el suelo de la jaula. Plato el inóculo restante en una placa de agar LB y contar las colonias para confirmar el número de bacterias que se han administrado. Para obtener imágenes in vivo de las heridas infectadas, siga los protocolos de contención de nivel de seguridad bio dos para el transporte de los ratones hacia y desde el instrumento de imagen y coloque el ratón anestesiado en la posición propensa dentro de la cámara de imágenes.
En el software de imágenes, establezca el tiempo de exposición, el binning, el f-stop y el campo de visión según corresponda para el experimento. A continuación, cree una región de interés en el sitio de la herida y mida el flujo promedio detectado en fotones por segundo. Para medir el fondo, cree una región de interés sobre un área aleatoria en la plataforma de imágenes y reste el número de fondo de fotones por segundo.
Al final del experimento, en un gabinete de biosequirma, utilice tijeras y fórceps estériles para extirpar los lechos de las heridas y coloque cada cama en un mililitro de PBS estéril en un tubo de polipropileno de 1,5 mililitros. Picar el tejido de la herida con tijeras e incubar las piezas de tejido en una coctelera a cuatro grados Celsius en 300 rotaciones por minuto durante dos horas. Al final de la incubación, vórtice cada tubo durante 10 segundos antes de diluir en serie el efluente bacteriano en PBS y enchacar el efluente bacteriano diluido en el agar LB para cuantificar la carga bacteriana.
Esta imagen representativa obtenida mediante un sistema óptico de imágenes demuestra que este modelo da como resultado una luminiscencia detectable. En este experimento, la infección alcanzó su punto máximo en el tercer día de inoculación después de la inoculación y persistió siete días después de la inoculación basada en la bioluminiscencia y el recuento de colonias. El cultivo de las bacterias aisladas de la herida demuestra además que las unidades formadoras de colonias cuantificadas por herida se correlacionan con la luminiscencia detectada.
Aunque hay una pérdida de peso rápida inicial inmediatamente después de la inyección, las inyecciones de solución salina y la nutrición suplementaria pueden restaurar los ratones a sus pesos iniciales. Se ha determinado que la dosis de inoculación calculada de la cual el 50% de las heridas se infectarán sustancialmente es de aproximadamente 7,7 veces 10 a la segunda colonia formando unidades por mililitro. Dosis superiores a una por 10 a la cuarta colonia formando unidades por mililitro resultan en una tasa de infección del 100%.
Se pueden aplicar varios tratamientos tópicos y sistémicos después de los procedimientos de heridas e inoculación para investigar nuevas terapias potenciales para Pseudomonas aeruginosa. Todo el trabajo con Pseudomonas aeruginosa y ratones infectados debe llevarse a cabo con precauciones de seguridad BSL-2 de acuerdo con las directrices del comité institucional de biosequietidad y uso animal del investigador.
