이 프로토콜은 이물질 이식 또는 면역 억제없이 만성 슈도모나스 아에루기노사 상처 감염에 대한 모델을 설명하기 때문에 중요합니다. 슈도모나스 아에루기노사를 24시간 동안 전두께절상처후 24시간 동안 접종을 지연시킨 후 박테리아의 신속한 클리어런스와 보급을 막아 7~10일 간 지속되는 감염을 확립한다. 이 독특한 모델은 세균성 병원성, 숙주 병원체 상호 작용 및 만성 슈도모나스 아루기노사 상처 감염에 대한 새로운 치료법의 개발을 위한 유용한 도구가 될 것입니다.
절차의 데모에 나를 지원 댄 리우, 볼리키 연구소에서 의대생이 될 것입니다. 절차를 시작하기 전에, 베이스 라인 무게를 얻고 경향이 위치에 마우스를 배치하기 위해 마취 8 ~ 12 주 된 마우스의 무게. 페달 반사에 대한 반응의 부족을 확인한 후, 각 측면에 0.9%의 미리 따뜻해지는 멸균 살균소 250 마이크로리터로 마우스를 피하한다.
전기 면도기를 사용하여 마우스의 등대 부위에서 머리카락을 제거하고 노출된 피부에 얇은 탈모 크림층을 적용합니다. 20~60초 후에는 따뜻한 물에 촉촉해진 거즈로 모발과 여분의 로션을 제거합니다. 전체 두께 절제 상처 수술의 경우, 먼저 25 게이지 바늘을 사용하여 마우스의 중간 등쪽 영역에서 1킬로그램당 0.6~ 1밀리그램을 피하하고 세 가지 대체 멸균 베타딘과 알코올 면봉으로 수술 부위를 원형으로 닦아냅니다.
수술 부위에 플라스틱 집착 랩 드레이프를 놓고 피부를 팽팽하게 펴보시고 있습니다. 피부가 건조되면, 멸균 6 밀리미터 직경의 피부 생검 펀치를 사용하여 왼쪽 등색 표피를 통해 초기 절개를 하고 오른쪽 등색 표피에 두 번째 절개를 합니다. 집게를 사용하여 왼쪽 윤곽이 있는 상처 부위의 중앙에서 피부를 텐트화하고 가위를 사용하여 표피와 진피 층을 소비합니다.
대칭 절제적 상처를 만들기 위해 오른쪽 윤곽 상처 부위에 절개를 반복 한 후, 멸균 식염수의 50 마이크로 리터와 두 상처를 씻어. 수술 부위와 주변 피부가 건조되면 상처와 dorsum을 투명 필름 드레싱으로 덮고 마우스를 완전한 재조정이 있을 때까지 모니터링할 수 있는 가열 패드에 깨끗한 케이지에 놓습니다. 수술 후 24시간, 재마취된 마우스를 다시 계량하고 양면 양쪽에 0.9%의 미리 따뜻진 멸균 살균소 250마이크로리터로 동물을 피하시 주입한다.
다음으로, 발광 P.aeruginosa 균주 현탁액100마이크로리터를 27게이지 바늘이 장착된 500 마이크로리터 결핵 안전 캡 주사기에 적재하고 각 상처에 투명 필름 드레싱을 통해 40 마이크로리터의 박테리아 서스펜션을 주입한다. 세균 현탁액이 잘 혼합되어 투명 드레싱이 그대로 되었는지 확인하십시오. 바늘 베젤 쪽으로 한 번만 투명 드레싱을 천공하십시오.
그런 다음 모니터링을 통해 가열 페이지에 마우스를 케이지로 되돌리고 케이지 바닥에 있는 음식 펠릿 사이에 끼어있는 고칼로리 영양 보충제 페이스트를 제공합니다. LB 한천 판에 남은 접종을 접시에 대고 식민지를 세어 투여된 박테리아의 수를 확인합니다. 감염된 상처의 생체 내 이미징의 경우, 이미징 기기에서 마우스를 수송하기 위한 생체 안전 수준 2 개 봉쇄 프로토콜을 따르고 마취 된 마우스를 이미징 챔버 내의 경향이있는 위치에 놓습니다.
이미징 소프트웨어에서, 실험에 적합한 노출 시간, 비닝, f-스톱 및 시야를 설정합니다. 다음으로 상처 부위에 관심 영역을 만들고 초당 광자에서 검출된 평균 플럭스를 측정합니다. 배경을 측정하려면 이미징 플랫폼의 임의 영역에 대한 관심 영역을 만들고 초당 광자의 배경 수를 뺍니다.
실험이 끝나면 바이오 안전 캐비닛에서 멸균 가위와 집게를 사용하여 상처 침대를 소비하고 각 침대를 멸균 PBS 1밀리리터에 1밀리리터의 폴리프로필렌 튜브에 배치합니다. 상처 조직을 가위로 다진 후 2시간 동안 분당 300회 회전하여 4°C에서 셰이커에 티슈 조각을 배양합니다. 인큐베이션의 끝에서, 각 튜브는 PBS에서 세균 유출물을 연렬 희석시키고 LB 천에 희석된 세균 유출물을 도금하여 세균부담을 정량화하기 전에 10초 동안 각 튜브를 소용돌이시다.
이미징 광학 시스템을 사용하여 얻은 이 대표적인 이미지는 이 모델이 검출 가능한 발광을 초래한다는 것을 보여줍니다. 이 실험에서, 감염은 3일째에 접종을 하고 생물 발광과 식민지 수를 둘 다에 근거하여 7일 포스트 접종을 지속했습니다. 상처로부터 분리된 박테리아의 배양은 상처당 정량화된 식민지 형성 단위가 검출된 발광과 상관관계가 있음을 더욱 보여준다.
비록 초기 급속 한 체중 감소 즉시 주입 후, 식염 수 주사 와 보충 영양 그들의 초기 무게에 쥐를 복원할 수 있습니다. 상기 50%의 상처가 실질적으로 감염될 것으로 계산된 접종용량은 밀리리터당 제2식민지 형성 단위로 약 7.7배 10배로 결정되었다. 밀리리터당 10배 이상 높은 용량은 밀리리터당 100%의 감염률을 초래한다.
다양한 국소 및 전신 치료는 슈도모나스 아에루기노사에 대한 새로운 잠재적 인 치료를 조사하기 위해 상처 및 접종 절차 후 적용 될 수있다. 슈도모나스 아에루기노사 및 감염된 마우스와의 모든 작업은 연구원의 기관 생체 안전 및 동물 사용 위원회 지침에 따라 BSL-2 안전 예방 조치로 수행되어야 합니다.
