Este protocolo é significativo porque descreve um modelo para infecção crônica da ferida pseudomonas aeruginosa sem a necessidade de implantação de material estranho ou supressão imunológica. A inoculação retardada com Pseudomonas aeruginosa 24 horas após a espessura total do ferimento excisional prossala a liberação rápida e disseminação da bactéria, estabelecendo uma infecção que dura de sete a dez dias. Este modelo único será uma ferramenta útil para as investigações de patogênese bacteriana, interações de patógenos hospedeiros e o desenvolvimento de novas terapias para infecções crônicas da ferida pseudomonas aeruginosa.
Me auxiliando em uma demonstração do procedimento estará Dan Liu, um estudante de medicina do Laboratório Bollyky. Antes de iniciar o procedimento, pese um rato anestesiado de oito a 12 semanas de idade para obter um peso de linha de base e colocar o mouse na posição propensa. Depois de confirmar a falta de resposta ao reflexo do pedal, injete subcutâneamente o mouse com 250 microliters de cloreto de sódio estéril pré-aquecido de 0,9% em cada flanco.
Use uma máquina de barbear elétrica para remover o cabelo da área dorsal do mouse e aplique uma fina camada de creme depilatório à pele exposta. Após 20 a 60 segundos, remova o cabelo e o excesso de loção com gaze umedecido em água morna. Para cirurgia de ferida excisional de espessura total, primeiro use uma agulha de calibre 25 para injetar subcutâneamente 0,6 a um miligrama por quilograma de buprenorfina de liberação sustentada na área média dorsal do rato e limpe o local cirúrgico de forma circular com três betadinas estéreis alternativos e cotonetes de álcool.
Coloque uma cortina de plástico sobre o local cirúrgico e estique a pele esticada caudally. Quando a pele secar, use um soco de biópsia de pele de seis milímetros de diâmetro estéril para fazer uma incisão inicial através da epiderme dorsal esquerda, seguida de uma segunda incisão na epiderme dorsal direita. Use fórceps para galoar a pele a partir do centro da área de ferida delineada pela esquerda e usar tesouras para extirir as camadas epidérmicas e dérmicas.
Depois de repetir a incisão na área de ferida delineada à direita para criar feridas excisionais simétricas, lave ambas as feridas com 50 microliters de soro fisiológico estéril. Quando o local cirúrgico e a pele circundante secarem, cubra as feridas e o dorso com um curativo transparente e coloque o rato em uma gaiola limpa em uma almofada de aquecimento com monitoramento até a recumbência total. 24 horas após a cirurgia, pese novamente o camundongo re-anestesiado e injete o animal subcutâneamente com 250 microlitadores de cloreto de sódio pré-aquecido 0,9% em ambos os flancos.
Em seguida, carregue 100 microliters da suspensão luminescente de cepa P.aeruginosa em uma seringa de tampa de segurança tuberculina de 500 microliter equipada com uma agulha calibre 27 e injete 40 microliters de suspensão de bactérias através do curativo de filme transparente em cada ferida. Certifique-se de que a suspensão bacteriana está bem misturada e que o curativo transparente está intacto. Certifique-se de perfurar o curativo transparente apenas uma vez com o lado da luneta da agulha para cima.
Em seguida, devolva o rato à sua gaiola em uma página de aquecimento com monitoramento e forneça pasta de suplemento nutricional de alta caloria sanduíche entre pelotas de alimentos no chão da gaiola. Plaque o inóculo restante em uma placa de ágar LB e conte as colônias para confirmar o número de bactérias que foram administradas. Para a imagem in vivo das feridas infectadas, siga os protocolos de contenção do nível de bio segurança dois para o transporte dos camundongos de e para o instrumento de imagem e coloque o camundongo anestesiado na posição propensa dentro da câmara de imagem.
No software de imagem, defina o tempo de exposição, binning, f-stop e campo de visão conforme apropriado para o experimento. Em seguida, crie uma região de interesse no local da ferida e meça o fluxo médio detectado em fótons por segundo. Para medir o fundo, crie uma região de interesse sobre uma área aleatória na plataforma de imagem e subtraia o número de fundo de fótons por segundo.
No final do experimento, em um armário de bio segurança, use tesouras estéreis e fórceps para extirpar os leitos de ferida e colocar cada cama em um mililitro de PBS estéril em um tubo de polipropileno de 1,5 mililitro. Pique o tecido da ferida com uma tesoura e incubar os pedaços de tecido em um agitador a quatro graus Celsius em 300 rotações por minuto durante duas horas. No final da incubação, vórtice de cada tubo por 10 segundos antes de diluir em série o efluente bacteriano na PBS e emplacar o efluente bacteriano diluído no ágar LB para quantificar a carga bacteriana.
Esta imagem representativa obtida usando um sistema óptico de imagem demonstra que este modelo resulta em luminescência detectável. Neste experimento, a infecção atingiu o pico no terceiro dia pós-inoculação e persistiu sete dias após a inoculação com base tanto na bioluminescência quanto na contagem de colônias. A cultura das bactérias isoladas da ferida demonstra ainda que a colônia quantificada formando unidades por ferida se correlaciona com a luminescência detectada.
Embora haja uma perda de peso rápida inicial imediatamente após a injeção, injeções salinas e nutrição suplementar podem restaurar os camundongos aos seus pesos iniciais. A dose de inoculação calculada da qual 50% das feridas se tornarão substancialmente infectadas foi determinada em cerca de 7,7 vezes 10 para a segunda colônia formando unidades por mililitro. Doses superiores a uma vezes 10 a quarta colônia formando unidades por mililitro resultam em uma taxa de infecção de 100%.
Vários tratamentos tópicos e sistêmicos podem ser aplicados após os procedimentos de woundamento e inoculação para investigar novas terapias potenciais para Pseudomonas aeruginosa. Todo o trabalho com Pseudomonas aeruginosa e camundongos infectados deve ser conduzido com precauções de segurança BSL-2 de acordo com as diretrizes do comitê institucional de biosegurança e uso animal do pesquisador.
