Biz bu yazının eleştiri, Dr. Nuno Moreno Dr David Olivieri Foxp3-KI GFP / GFP tür bağış için hayvan sahibi ve ısıtma pedleri ve Dr Emre K. Kuchroo oluşturmak için lojistik yardım için teşekkür etmek istiyorum fareler. Bu çalışma, &quot;Fundação para Ciencia e Tecnologia&quot; (FCT, Portekiz), hibe # PTDC/EBB-BIO/115514/2009 tarafından desteklenmektedir.

1. Hayvan hazırlık Önemli notlar: BM hücre süspansiyonları ve timik transplantasyon aseptik koşullarda yapıldı. Timik nakli hayvan tesis içinde yer alan cerrahi odasında yapıldı BM süspansiyonlar, hücre kültürü oda davlumbaz içinde hazırlandı. Bu aseptik koşullarda tutmak ve garanti altına almak için, biz bu yerlerin video kaydetmek için izin verilmiyordu. Ancak, tüm cerrahi malzemelerin otoklava ve daha önce cerrahi tezgah Virkon ® (Pharmacal Research Laboratories Inc) ve% 70 etanol ile temizlendi. Tüm işlemler onaylanmış ve Kurumsal Hayvan Bakım Komitesi (IACUC) kullanın ve Avrupa Laboratuar Hayvan Bilimi Birlikleri (FELASA) direktifleri Federasyonu ile anlaşmaya vardı. Onay ID&#39;niz AO10/2010. Tüm görüntü deneyler terminali prosedürleri ve hayvanlar görüntü sona ermesinin ardından hemen ötenaziedinimi. Ayrıntılı prosedür aşağıdaki gibidir: <ol><li> Işın tedavisi (γ ışınlama ile) kemik ilikleri (BM) içinde endojen hematopoietik öncüleri yok etmek için 900 rad ile 8 hafta eski Çıplak fareler. Intravenöz enjeksiyon ve daha fazla BM sulandırıldıktan için donör BM hücreleri hazırlamak kadar ışınlama sonra, kafesler, hayvanların geri. Bu BM transferi 1 saat ışınlama sonrası yapıldı. </li><li> BM donör hayvanlar ayırın. Bir hayvanın arka bacaklarda tibiaları ve femur 3 alıcı hayvanlara sulandırmak için yeterli. CO 2 ile ötenazi sonra, arka bacaklarda kaldırmak ve sonra kemiklerinden kas ve deri kaldırın. </li><li> Her kemik kapalı ucunu kesin ve BM kaldırmak için 2 ml PBS (ya da RPMI) bir havaneli kullanarak PBS (veya RPMI) ile yıkayın ya da bir havanda döv. </li><li> Dinç aspirasyon USI tekrar tek bir hücre süspansiyonu içine BM yapısını bozabilirng P1000 pipet. Alternatif olarak, aynı zamanda bir 21G şırınga iğnesi boyunca birkaç kez BM geçebilir. Santrifüj (400g, 5 dakika, RT), PBS içinde hücre yeniden askıya alma, ve çıplak ışınlanmış alıcıları içine intravenöz enjekte. Deneylerde tüm düzenleyici T hücreleri (Tregs) GFP 1 ifade Foxp3-KI GFP / GFP fareler BM kullandı. </li><li> -BM-sulandırılmış olmayan hayvanların 14 günden fazla yaşayamaz beri donör BM Kabul, transferinden sonra ilk günlerinde ortaya çıkar. Ancak, bir bütün BM bölmeleri tam iyileşme sağlamak için 4 ila 6 hafta beklemeniz gerekir. Bactrim (Roche) bakteriyel enfeksiyonların riskini azaltmak için ışınlama sonrası ilk hafta içinde (2 mg / ml) su eklendi. </li><li> Embriyonik timus nakli zaten 2 tarif edilmiştir. Kısaca, isogenic farelerin üreme çiftleri başlayın ve her gün takarak (birleşmede kanıt) kontrol edin. Ayrı takılı kadın ve CO pregn gün 15 2-euthanizeANCY (fiş gözlem gebeliğin 1. gün). Embriyoların ve thymuses çıkarın. Transferi kadar soğuk PBS içinde embriyonik thymuses yerleştirin. </li><li> Thymuses nakli, ketamin (120 mg / g fare ağırlık) / ksilizin (fare ağırlığı 16 mg / g) ile anestezi BM-alıcı Çıplak fareler gerçekleştirmek ve aldıkları 37 ° C kadar bir ısıtma yastığı üstünde tutmak için bilinçsiz. </li><li> Cerrahi thymuses nakli gerçekleştirmek için böbrek maruz kalmaktadır. İlk ChloraPrep (Carefusion A.Ş.) ve% 70 etanol ile cilt fırçalayın. Daha sonra, hayvanın arka-lateral vücut parçası, 2 mm körüklü son torasik kaburga cilt üzerinde kesilmiş bir 1 cm. </li><li> Periton boşluğuna kesin ve bu boşlukta böbrek çekin. Bir neşter bıçağı ile böbrek kapsülü küçük bir yüzeysel kesik olun. Çok ince bir ucu ile forseps kullanma alıcı fare böbrek kapsülü altında bir kese yapmak ve bu kese içine 4 timus lobları ekleyebilirsiniz. </li><li> Böbrek b koyun<html> yerine ack, bir ya da iki dikiş ile periton boşluğuna dikiş, ve daha sonra aynı dikiş yöntemi kullanarak fare deri yakın. Alternatif olarak, dikişlerle cerrahi yapıştırıcı kullanılarak yapılabilir. </li><li> Subkutan sağ hayvan ağrıyı önlemek ve bunlar anestezi kurtarmak için başlayana kadar bir ısıtma pedi hayvanlar tutmak için ameliyat bittikten sonra (5 mg / kg butorfanol) analjezik enjekte edilir. Fareler kafes arkadaşları dikiş kaldırmasını önlemek için transplantasyon sonrası ilk 3 gün için ayrı ayrı kafesli. 1 hafta sonra dikişler çıkarın. </li><li> Çıplak fareler, T hücreleri yoktur. Bu nedenle, kandaki CD4 + veya CD8 + T hücrelerinin yüzde izleme timus greft kabul değerlendirebilir. Haftada bir kez, 2 hafta timus naklinden sonra, hayvanların kanama ve anti-CD4 ve CD8 anti-monoklonal antikor (mAb) ile kan lekesi. CD4: CD8 oranı yaklaşık 2:1 &#39;dir, nakledilen timus tamamen işlevseldir (Şekil 1). </li></ol>&quot;&gt; 2 intravital görüntü elde etme Önceden ihtiyaç ve onları bir kenara koyacağız tüm malzemeleri hazırlayın. <ol><li> 37 ketamin / xylazine (madde 1.5 açıklanan aynı dozlarda) ile hayvanların anestezisi ve bir ısıtma yastığı üstüne koyun ° C Kan akımının gelecekteki görselleştirme izin intravenöz rodamin B izotiyosiyanat-Dextran (PBS içinde 20 mg / ml) 100 ul enjekte edilir. </li><li> Böbrek nakledilen timus içeren öğe 1.6, daha önce açıklanan protokole göre Açığa. </li><li> Orijinal konumuna geri böbrek önlemek için dikiş ile cilt insizyonu lateral taraf kapatın. </li><li> PBS batırılmış pamuk organın üstüne nemli tutmak için bir parça yerleştirin. </li><li> Hayvan sahibinin aşama (Şekil 2A) üstüne ısıtma yastığı koyun. </li><li> Hayvan, hayvan sahibi, organ kadar (Şekil 2B) ısıtma yastığı üstüne koyun. </li><li> Her iki tarafta bir kelepçe m organ Pinchade ince alüminyum folyo (Şekil 2C). </li><li> Hayvan sahibinin kapatın ve üst ısıtıcı prob doku (Şekil 2B) mümkün olduğunca yakın yerde. Bu ısıtıcı prob, sürekli bir organ sıcaklığı ölçer 37 ° C tutarak ısıtıcı, elektrik akımı ayarlamak için bu bilgileri gönderir </li><li> PBS batırılmış pamuk çıkarın ve hazırlık üstünde 30 ° C düşük erime agaroz (PBS içinde% 2) ekleyin. </li><li> Üst ısıtıcı (Şekil 2E) ile tüm hazırlık Kapak. Bu ısıtıcı diyafram objektif (Şekil 2F) agaroz izole bir coverglass vardır. Fare anestezi Monitör ve yarım doz artışı her 40 dakikada enjekte. Görüntü alımından sonra, CO 2 ile hayvan euthanize. </li></ol> Not: alüminyum folyo klip ve üst ısıtıcı resimleri Şekil 3&#39;te sunulmaktadır. 3. İki foton görüntüleme satın alma Biz dik &quot;Prairie Ultima XY&quot; iki foton mikroskop kullanılır. Bizim sistemi ile donatılmış bir Ti: Safir lazer, aynı anda kadar 4 kanal satın almalar için en büyük dört Proje Yönetim Ekipleri ve 20x suya daldırma hedefi. <ol><li> Ti açın: Safir lazer ve tüm mikroskop sistemi. </li><li> Dikroik aynalar ve filtre setleri istenilen dalga boyuna göre ekleyin. Bizim durumumuzda, 565 nm dikroik ayna içeren Olympus BX2 Chroma tutucu, bir 525/50 nm filtre (GFP Foxp3-sinyal için) ve 595/50 nm filtresi (Dextran-rodamin-B kan damarları içinde sinyali için kullanılan .) Kullanılan lazer dalga boyu aralığı 880-900 nm arasında idi. </li><li> Hayvan sahibinin, mikroskop bağlamak ve suya, üst ısıtıcı diyafram üzerine su ekleyin, tüm ısıtıcıların amacı dikkatlice düşük çevirin, ve bir gemi ya da bazı GFP-Tregs odaklanmak. </li><li> Mikroskop x, y, z dış kontrolü, hızlı bir bölge bulmak için doku anket<html> çıkar. </li><li> Proje Yönetim Ekipleri, renk ayrımı optimize ve arka plan üzerinde yeterli sinyal elde etmek için gerekli lazer miktarını en aza indirmek için kazanç ayarlayın. Doku fotoğraf zarar vermemek için lazer az miktarda kullanmaya çalışın. </li><li> Çıkarlarını bölgede yer almaktadır sonra, time-lapse görüntüleme başlar. Bizim durumumuzda, tipik bir 5D (x, y, z, t ve renk) satın alma protokolü, 4.0 mikron z adımları, x ve y uzunluğu 140 mm ayrılır 50 mikron derinlik doku hacmi sıralı görüntüler elde oluşur her biri. Her cilt elde edilecek yaklaşık 30 saniye sürer. Bu nedenle, 60 satın almalar, yaklaşık 30 dakika görüntü alımı gerçekleştirecektir. </li><li> Kurumsal sunucu, veri transferi ve çok boyutlu render ve hücre izleme gerçekleştirmek için ImageJ, Imaris, ya da Volocity yazılımı kullanmak. </li></ol> 4. Temsilcisi Sonuçlar <html> g1.jpg &quot;/&gt; Şekil 1. Embriyonik timus kabul ve fonksiyon BM kurtardıktan sonra, embriyonik thymuses BM sulandırılmış hayvan nakledilen; timus nakli iki hafta sonra, bu farelerin anti-CD4 veya anti-CD8 T hücre alt tiplerinin yüzdeleri boyama ile izlemek için haftada bir kere kanadı Mablar. Biz timus CD4 hayvanlarda başarıyla kabul edilmiştir kabul 1.5-2.0:1 etrafında CD8 oranı (A). Işlevselliğini doğrulamak için, bazı timus nakledilen hayvanların kurban ve WT farelerin (B) ile farklı timosit alt popülasyonlarının yüzde karşılaştırıldığında. Alt popülasyonlar (anti-CD25 ve anti-CD44 Mablar ile boyama), çift-pozitif (DP; CD4 + CD8 + timositleri) (- CD8 timositleri CD4 DN) ve tek-pozitif (SP), CD4 çift-negatif yüzdeleri + veya CD8 + timositleri bu hayvanlar arasında benzer bulunmuştur. ig2.jpg &quot;/&gt; Şekil 2. Hayvan tutucu sonra derin anestezi, hayvan, bir ısıtma yastığı üstüne konur, daha önce hayvan sahibinin aşama (A) üst üste monte edilmiştir . Böbrek nakledilen timus içeren (B) yukarı bakacak. Bir alüminyum folyo kelepçe incelikle yerinde tutmak için tüm böbrek tutam (C). Şekil 1C insert kelepçe ayrıntılı olarak gösterir. Hayvan sahibinin üst kısmı yere (D) konur. PBS-batırılmış pamuk organın üst, sıcak düşük erime agaroz yerine kaldırılır ve üst ısıtıcı (E) eklenir. Son olarak, tüm montaj, mikroskop transfer hedefi (F) tarafından temsil edilen. <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/3504/3504fig3.jpg" /> Şekil 3. Tutucu parça Detayları Bu resimler, alüminyum folyo kelepçe (A) (B) böbrek tutarak gösteriyor . Nakledilen timus bulunduğu bölgenin de unutmayın. Bu yaklaşık olarak bölgenin gösterirtimus kapsül kesmek ve embriyonik timus koymak için cepte yapmak. Üst ısıtıcı coverglass (C) alt kısmı (D) silikon yapıştırıcı ile tespit edildi. Movie 1 Foxp3-GFP + timositleri fizyolojik oksijenlenme ve sıcaklık seviyeleri (37 ° C), tüm süreç boyunca tutuldu timus içinde intravital görüntüleme . Tregs kan akış ve hareket edin. Bu hızları ölçülen ve yayımlanmış verilere göre <a href="/files/ftp_upload/3504/3504movie1.avi">film görmek için buraya tıklayın.</a> Film 2 görüntüleri 30 satın alındı ​​timus içinde Tregs intravital görüntüleme ° C Kan akımının bakım rağmen hareket ve yuvarlak şekil hücrelerin yokluğunda <a href="/files/ftp_upload/3504/3504movie2.avi">film görmek için buraya tıklayın.</a>

<ol>
	<li>Bettelli, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reciprocal+developmental+pathways+for+the+generation+of+pathogenic+effector+TH17+and+regulatory+T+cells.">Reciprocal developmental pathways for the generation of pathogenic effector TH17 and regulatory T cells.</a> Nature. 441, 235-238 (2006).</li><li>Ramsdell, F., Z&#250;&#241;iga-Pfl&#252;cker, J. C., Takahama, Y., Coligan, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+systems+for+the+study+of+T+cell+development:+fetal+thymus+organ+culture+and+OP9-DL1+cell+coculture.">In vitro systems for the study of T cell development: fetal thymus organ culture and OP9-DL1 cell coculture.</a> Current protocols in immunology. , (2006).</li><li>Tadokoro, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+T+cells+inhibit+stable+contacts+between+CD4++T+cells+and+dendritic+cells+in+vivo.">Regulatory T cells inhibit stable contacts between CD4+ T cells and dendritic cells in vivo.</a> J. Exp. Med. 203, 505-511 (2006).</li><li>Mempel, T. R., Henrickson, S. E., Von Andrian, U. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-cell+priming+by+dendritic+cells+in+lymph+nodes+occurs+in+three+distinct+phases.">T-cell priming by dendritic cells in lymph nodes occurs in three distinct phases.</a> Nature. 427, 154-159 (2004).</li><li>Miller, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+the+single+cell+dynamics+of+CD4++T+cell+activation+by+dendritic+cells+in+lymph+nodes.">Imaging the single cell dynamics of CD4+ T cell activation by dendritic cells in lymph nodes.</a> J. Exp. Med. 200, 847-856 (2004).</li><li>Shakhar, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+T+cell-dendritic+cell+interactions+precede+the+development+of+both+tolerance+and+immunity+in+vivo.">Stable T cell-dendritic cell interactions precede the development of both tolerance and immunity in vivo.</a> Nat. Immunol. 6, 707-714 (2005).</li><li>Hugues, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+T+cell+dynamics+in+lymph+nodes+during+the+induction+of+tolerance+and+immunity.">Distinct T cell dynamics in lymph nodes during the induction of tolerance and immunity.</a> 5, 1235-1242 (2004).</li><li>Tang, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+regulatory+T+cell+control+of+autoimmune+responses+in+nonobese+diabetic+mice.">Visualizing regulatory T cell control of autoimmune responses in nonobese diabetic mice.</a> Nat. Immunol. 7, 83-92 (2006).</li><li>Le Borgne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+negative+selection+on+thymocyte+migration+in+the+medulla.">The impact of negative selection on thymocyte migration in the medulla.</a> Nature immunology. 10, 823-830 (2009).</li><li>Baez, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+open+cremaster+muscle+preparation+for+the+study+of+blood+vessels+by+in+vivo+microscopy.">An open cremaster muscle preparation for the study of blood vessels by in vivo microscopy.</a> Microvascular research. 5, 384-394 (1973).</li><li>Wang, B., Zinselmeyer, B. H., McDole, J. R., Gieselman, P. A., Miller, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-invasive+Imaging+of+Leukocyte+Homing+and+Migration+in+vivo.">Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo.</a> J. Vis. Exp. (46), e2062-e2062 (2010).</li><li>Barretto, R. P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-lapse+imaging+of+disease+progression+in+deep+brain+areas+using+fluorescence+microendoscopy.">Time-lapse imaging of disease progression in deep brain areas using fluorescence microendoscopy.</a> Nature medicine. 17, 223-228 (2011).</li></ol>

Biz ifşa etmek başka bir şey var.

Bu yazıda, iki foton görüntüleme için yaşayan bir hayvan içinde timositleri işlemleri gösterdi. Biz aynı zamanda kan akımının devam etmesi ve görüntüleme işlemleri sırasında organ sıcaklık bakım gibi, dikkatle kontrol gereken bazı parametreler nitelendirdi. Bununla birlikte, organ sabit tutmak için dikkatli çabalarına rağmen, böyle bir &quot;organı sürüklenen&quot; olarak hareket eserler ortaya çıkabilir. Arka görüntü düzeltme, bu amaç için özel olarak tasarlanmış algoritmalar geliştirme yapılabilir. Daha fazla görüntü analizi de hataları en aza indirmek için çalışan yeni protokol geliştirme kaynağı olabilir. Timus, T hücreleri, bu nedenle üretilen ve organ, Bağışıklık nesil γδ, anlamak isteyen bir organdır, CD4 veya CD8 T hücreleri, onların dikkatini durulacak. T hücreleri ile ilgili çalışmaların çoğu, bu c sayıda farklılıklar ve / veya istikrar dayanıyorin vitro / in vivo manipülasyonlar sonra arşın. Ancak, sadece in vivo görselleştirme sonra homeostazı 3-7 koruyarak bağışıklık sisteminin hücreleri arasındaki etkileşimi gözlemlemek olabilir. Bu nedenle, in vivo timositleri gözlem muhtemelen T hücre biyolojisi daha iyi anlamak için en önemli eksik bilgileri biridir. Intravital TPM T hücre hareketleri ve etkileşimleri detaylı bir resmini sunar ve biz burada detaylı timosit çalışmalar için nasıl kullanılabileceğini göstermektedir. Ancak, her teknik sınırlamaları vardır. Intravital görüntüleme alımı hücreleri vücudun içine davranış yansıtarak için en doğru sistem iken, bu organların eksplante görüntü elde etme, daha az zahmetli ve 8,9 bağışıklık sistemi ile ilgili önemli bilgiler toplamak için kullanılır olmuştur olduğu da doğrudur. Ayrıca, bir vanlarda intravital görüntüleme yöntemleri doku ve kan damarları açığa çıkarmak için ameliyat gerektiren inkar edemeztek başına, tüm organ fizyolojisi 10 bir değişikliğe neden olabilir . Bununla birlikte, non-invaziv yöntemler geliştirilmekte olan cerrahi işlem 11 ve yeni yöntemler neden eserler kaldırılması vardır ki 12 kullanılan hayvanların daha iyi önceden hazırlanmak . Bu nedenle, yeni bir cerrahi prosedür ve geçiş ücretlerine en aza indirmek ya da bypass intravital görüntüleme satın alma gerçek sınırlamalar ve daha fazla bilimsel topluluk tarafından erişilebilir. Açıklanan yöntem uygundur ve biz kullanmış olduğunuz tüm raporları, in vivo sistemik manipülasyonlar, bu tür ilaç idaresi olduğunu göstermiştir. Böylece, timositleri gelişimi ile ilgili ileri çalışmalar tamamlayacak ve güçlendirmek amacıyla zaten mevcut ex vivo teknikleri ile birlikte bu yöntemin kullanılmasını öneririz .

<table border="1"><thead><tr><td> Reaktifi Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar </td></tr></thead><tbody><tr><td> Rodamin B ishothiocyanate-Dextran </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> R9379 </td><td> 20 mg / ml stok hazırlamak </td></tr><tr><td> İki foton mikroskop </td><td> Prairie Technologies Inc. </td><td> Prairie Ultima XY </td><td></td></tr><tr><td> Ti: Safir lazer </td><td> Tutarlı, Inc. </td><td> Chameleon Ultra Ailesi </td><td></td></tr><tr><td> 20x/1.00 NA daldırma hedefi </td><td> Olympus Inc. </td><td> XLUMPLFLN 20XW </td><td></td></tr><tr><td> Tutucu (Filtreler / Dikroik) </td><td> Chroma Technology Corp. </td><td> 91.018 BX2 (U-MF2) </td><td></td></tr><tr><td> 525 nm/50 filtre </td><td> Chroma Technology Corp. </td><td> ET525/50m </td><td></td></tr><tr><td> 595 nm/50 filtre </td><td> Chroma Technology Corp. </td><td> ET595/50m </td><td&gt; </td></tr><tr><td> 565 nm dikroik </td><td> Chroma Technology Corp. </td><td> 565dcxr </td><td></td></tr><tr><td> Imaris yazılımı </td><td> Bitplane AG, Inc. </td><td> Imaris </td><td></td></tr><tr><td> Volocity </td><td> Perkin Elmer Inc. </td><td> Volocity </td><td></td></tr><tr><td> ImageJ </td><td> NIH, ABD </td><td> ImageJ </td><td></td></tr></tbody></table>

intravital imaging of the mouse thymus using 2-photon microscopy

İki foton Mikroskobu (TPM), doku ve organları içinde derin alanlarında görüntü alımı sağlar. Yeni stereotaktik araçları ve cerrahi işlemlerin gelişimi ile birlikte, TPM organları içinde &quot;nişler&quot; belirlemek ve canlı hayvan hücresel &quot;davranışlar&quot; belgelemek için güçlü bir tekniği haline gelir. Intravital görüntüleme en iyi organ içindeki gerçek hücresel davranış benzer bilgiler sunarken, daha zahmetli ve daha teknik daha gerekli ekipman / alternatif ex vivo görüntüleme satın alma prosedürleri açısından zorlu hem de . Bu nedenle, biz, cerrahi bir işlemdir ve Foxp3, hareketleri + hücreleri timus içinde izlemenizi sağlar romanı &quot;stereotaktik&quot; organ sahibinin tarif. Foxp3 düzenleyici T hücreleri (Tregs) üretimi için ana düzenleyicisidir. Yani: Ayrıca, bu hücrelerin kökenlerine göre sınıflandırılmış olabilir. timus diferansiye Tregs o, &quot;doğal olarak meydana gelen Tregs&quot; (nTregs) denirperiferik dönüştürülmüş Tregs (pTregs) pposed. Önemli miktarda araştırma, bu T hücre fenotipi ve fizyolojisi ile ilgili literatürde bildirilmiş olmasına rağmen, onların diğer hücrelere in vivo etkileşimleri hakkında bilinen çok az. Bu eksiklik, bu tür gözlemler izin verecek teknikler olmaması nedeniyle olabilir. Bu yazıda açıklanan protokol, bu durum için bir çare sağlar. Protokol zamanında timik epitel hücreleri dahil olmak üzere bazı epitel hücrelerinin farklılaşması ödün DNA dizilimi bir mutasyon beri endojen bir timus yoksun çıplak farelerin kullanarak oluşur. Çıplak fareler gama ışınlanmış ve Foxp3-KI GFP / GFP farelerden alınan kemik ilikleri (BM) ile sulandırılır. BM kurtarma (6 hafta) sonra, her bir hayvan, böbrek kapsülü içinde embriyonik timus nakli yapıldı. Timus kabul (6 hafta) sonra, hayvanların anestezi; böbrek içerennakledilen timus, maruz kalan organ tutucuya sabit ve in vivo görüntüleme için TPM tarafından fizyolojik şartlar altında tutulur . Biz düzenleyici T hücrelerinin nesil ilaçların etkisini incelemek için bu yaklaşım olmuştur.

Watch this Scientific Journal Video about Intravital Imaging of the Mouse Thymus using 2-Photon Microscopy at JoVE.com

Intravital Imaging of the Mouse Thymus using 2-Photon Microscopy

Biz roman laboratuar araçları ve timus intravital görüntü elde etmek için protokoller geliştirdik. Bizim tekniği T hücre gelişimi oluşur timus içinde &quot;nişler&quot; belirlenmesinde yardımcı olacaktır.

2-Foton Mikroskopi kullanarak Fare Thymus intravital Görüntüleme

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic ...

intravital-imaging-of-the-mouse-thymus-using-2-photon-microscopy

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

16.9K Görüntüleme.  Instituto Gulbenkian de Ciência. Biz roman laboratuar araçları ve timus intravital görüntü elde etmek için protokoller geliştirdik. Bizim tekniği T hücre gelişimi oluşur timus içinde "nişler" belirlenmesinde yardımcı olacaktır.

Video: Intravital Imaging of the Mouse Thymus using 2-Photon Microscopy

Intravital Microscopy of the Inguinal Lymph Node

Lymph nodes (LN's), located throughout the body, are an integral component of the immune system. They serve as a site for induction of adaptive immune response and therefore, the development of effector cells. As such, LNs are key to fighting invading pathogens and maintaining health. The choice of LN to study is dictated by accessibility and the desired model; the inguinal lymph node is well situated and easily supports studies of biologically relevant models of skin and genital mucosal infection.
The inguinal LN, like all LNs, has an extensive microvascular network supplying it with blood. In general, this microvascular network includes the main feed arteriole of the LN that subsequently branches and feeds high endothelial venules (HEVs). HEVs are specialized for facilitating the trafficking of immune cells into the LN during both homeostasis and infection. How HEVs regulate trafficking into the LN under both of these circumstances is an area of intense exploration. The LN feed arteriole, has direct upstream influence on the HEVs and is the main supply of nutrients and cell rich blood into the LN. Furthermore, changes in the feed arteriole are implicated in facilitating induction of adaptive immune response. The LN microvasculature has obvious importance in maintaining an optimal blood supply to the LN and regulating immune cell influx into the LN, which are crucial elements in proper LN function and subsequently immune response. 
The ability to study the LN microvasculature in vivo is key to elucidating how the immune system and the microvasculature interact and influence one another within the LN. Here, we present a method for in vivo imaging of the inguinal lymph node. We focus on imaging of the microvasculature of the LN, paying particular attention to methods that ensure the study of healthy vessels, the ability to maintain imaging of viable vessels over a number of hours, and quantification of vessel magnitude. Methods for perfusion of the microvasculature with vasoactive drugs as well as the potential to trace and quantify cellular traffic are also presented. 
Intravital microscopy of the inguinal LN allows direct evaluation of microvascular functionality and real-time interface of the direct interface between immune cells, the LN, and the microcirculation. This technique potential to be combined with many immunological techniques and fluorescent cell labelling as well as manipulated to study vasculature of other LNs.

A technique for performing intravital microscopy of the inguinal lymph node (LN) is outlined. Such technique allows for real-time, in vivo study of the lymph node microvasculature and structure both during homeostasis and infection. This technique can be adapted to cell trafficking studies and to other lymph node sites.

Kasık lenf düğüm intravital Mikroskopi

Lymph nodes (LN's), located throughout the body, are an integral component of the immune system. They serve as a site for induction of adaptive immune ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Direct Observation of Phagocytosis and NET-formation by Neutrophils in Infected Lungs using 2-photon Microscopy

After the gastrointestinal tract, the lung is the second largest surface for interaction between the vertebrate body and the 
environment. Here, an effective gas exchange must be maintained, while at the same time avoiding infection by the multiple pathogens that are inhaled 
during normal breathing. To achieve this, a superb set of defense strategies combining humoral and cellular immune mechanisms exists. One of the most 
effective measures for acute defense of the lung is the recruitment of neutrophils, which either phagocytose the inhaled pathogens or kill them by 
releasing cytotoxic chemicals. A recent addition to the arsenal of neutrophils is their explosive release of extracellular DNA-NETs by which bacteria 
or fungi can be caught or inactivated even after the NET releasing cells have died. We present here a method that allows one to directly observe neutrophils, 
migrating within a recently infected lung, phagocytosing fungal pathogens as well as visualize the extensive NETs that they have produced throughout the 
infected tissue. The method describes the preparation of thick viable lung slices 7 hours after intratracheal infection of mice with conidia of the mold 
Aspergillus fumigatus and their examination by multicolor time-lapse 2-photon microscopy. This approach allows one to directly investigate antifungal 
defense in native lung tissue and thus opens a new avenue for the detailed investigation of pulmonary immunity.

We show, how to use 2-photon microscopy for the observation of the dynamics of neutrophil granulocytes in infected lungs while they phagocytose pathogens or produce neutrophil extracellular traps (NETs).

2-foton Mikroskop kullanarak Enfekte Akciğerler Nötrofiller Fagositoz ve NET-oluşumu Doğrudan Gözlem

After the gastrointestinal tract, the lung is the second largest surface for interaction between the vertebrate body and the 
environment. Here, an ...

Intravital Microscopy of the Spleen: Quantitative Analysis of Parasite Mobility and Blood Flow

The advent of intravital microscopy in experimental rodent malaria models has allowed major advances to the knowledge of parasite-host interactions 1,2. Thus, in vivo imaging of malaria parasites during pre-erythrocytic stages have revealed the active entrance of parasites into skin lymph nodes 3, the complete development of the parasite in the skin 4, and the formation of a hepatocyte-derived merosome to assure migration and release of merozoites into the blood stream 5. Moreover, the development of individual parasites in erythrocytes has been recently documented using 4D imaging and challenged our current view on protein export in malaria 6. Thus, intravital imaging has radically changed our view on key events in Plasmodium development. Unfortunately, studies of the dynamic passage of malaria parasites through the spleen, a major lymphoid organ exquisitely adapted to clear infected red blood cells are lacking due to technical constraints.
Using the murine model of malaria Plasmodium yoelii in Balb/c mice, we have implemented intravital imaging of the spleen and reported a differential remodeling of it and adherence of parasitized red blood cells (pRBCs) to barrier cells of fibroblastic origin in the red pulp during infection with the non-lethal parasite line P.yoelii 17X as opposed to infections with the P.yoelii 17XL lethal parasite line 7. To reach these conclusions, a specific methodology using ImageJ free software was developed to enable characterization of the fast three-dimensional movement of single-pRBCs. Results obtained with this protocol allow determining velocity, directionality and residence time of parasites in the spleen, all parameters addressing adherence in vivo. In addition, we report the methodology for blood flow quantification using intravital microscopy and the use of different colouring agents to gain insight into the complex microcirculatory structure of the spleen. 
Ethics statement
All the animal studies were performed at the animal facilities of University of Barcelona in accordance with guidelines and protocols approved by the Ethics Committee for Animal Experimentation of the University of Barcelona CEEA-UB (Protocol No DMAH: 5429). Female Balb/c mice of 6-8 weeks of age were obtained from Charles River Laboratories.

We show the method for performing intravital microscopy of the spleen using GFP transgenic malaria parasites and the quantification of parasite mobility and blood flow within this organ.

Dalak intravital Mikroskopi: Parazit Mobilite ve Kan Akımının Kantitatif Analiz

The advent of intravital microscopy in experimental rodent malaria models has allowed major advances to the knowledge of parasite-host interactions 1,2. ...

Intravital Imaging of the Mouse Popliteal Lymph Node

Lymph nodes (LNs) are secondary lymphoid organs, which are strategically located throughout the body to allow for trapping and presentation of foreign antigens from peripheral tissues to prime the adaptive immune response. Juxtaposed between innate and adaptive immune responses, the LN is an ideal site to study immune cell interactions1,2. Lymphocytes (T cells, B cells and NK cells), dendritic cells (DCs), and macrophages comprise the bulk of bone marrow-derived cellular elements of the LN. These cells are strategically positioned in the LN to allow efficient surveillance of self antigens and potential foreign antigens3-5. The process by which lymphocytes successfully encounter cognate antigens is a subject of intense investigation in recent years, and involves an integration of molecular contacts including antigen receptors, adhesion molecules, chemokines, and stromal structures such as the fibro-reticular network2,6-12. 
Prior to the development of high-resolution real-time fluorescent in vivo imaging, investigators relied on static imaging, which only offers answers regarding morphology, position, and architecture. While these questions are fundamental in our understanding of immune cell behavior, the limitations intrinsic with this technique does not permit analysis to decipher lymphocyte trafficking and environmental clues that affect dynamic cell behavior. Recently, the development of intravital two-photon laser scanning microscopy (2P-LSM) has allowed investigators to view the dynamic movements and interactions of individual cells within live LNs in situ12-16. In particular, we and others have applied this technique to image cellular behavior and interactions within the popliteal LN, where its compact, dense nature offers the advantage of multiplex data acquisition over a large tissue area with diverse tissue sub-structures11,17-18. It is important to note that this technique offers added benefits over explanted tissue imaging techniques, which require disruption of blood, lymph flow, and ultimately the cellular dynamics of the system. Additionally, explanted tissues have a very limited window of time in which the tissue remains viable for imaging after explant. With proper hydration and monitoring of the animal's environmental conditions, the imaging time can be significantly extended with this intravital technique. Here, we present a detailed method of preparing mouse popliteal LN for the purpose of performing intravital imaging.

Recent advances in 2-photon microscopy have enabled real-time in situ imaging of live tissues in animal models, thereby enhancing our ability to investigate cellular behavior in both physiologic and pathologic conditions. Here, we outline the preparations required to perform intravital imaging of the mouse popliteal lymph node.

Intravital Görüntüleme Fare Popliteal Lenf Nodu

Lymph nodes (LNs) are secondary lymphoid organs, which are strategically located throughout the body to allow for trapping and presentation of foreign ...

Highly Resolved Intravital Striped-illumination Microscopy of Germinal Centers

Monitoring cellular communication by intravital deep-tissue multi-photon microscopy is the key for understanding the fate of immune cells within thick tissue samples and organs in health and disease. By controlling the scanning pattern in multi-photon microscopy and applying appropriate numerical algorithms, we developed a striped-illumination approach, which enabled us to achieve 3-fold better axial resolution and improved signal-to-noise ratio, i.e. contrast, in more than 100 &#181;m tissue depth within highly scattering tissue of lymphoid organs as compared to standard multi-photon microscopy. The acquisition speed as well as photobleaching and photodamage effects were similar to standard photo-multiplier-based technique, whereas the imaging depth was slightly lower due to the use of field detectors. By using the striped-illumination approach, we are able to observe the dynamics of immune complex deposits on secondary follicular dendritic cells &#8211; on the level of a few protein molecules in germinal centers.

High-resolution intravital imaging with enhanced contrast up to 120 &#181;m depth in lymph nodes of adult mice is achieved by spatially modulating the excitation pattern of a multi-focal two-photon microscope. In 100 &#181;m depth we measured resolutions of 487 nm (lateral) and 551 nm (axial), thus circumventing scattering and diffraction limits.

Germinal Merkezleri derece Çözülmüş Intravital Çizgili-aydınlatma Mikroskopi

Monitoring cellular communication by intravital deep-tissue multi-photon microscopy is the key for understanding the fate of immune cells within thick ...

Intravital Microscopy Imaging of the Liver following Leishmania Infection: An Assessment of Hepatic Hemodynamics

Intravital microscopy (IVM) is a powerful optical imaging technique that has made possible the visualization, monitoring and quantification of various biological events in real time and in live animals. This technology has greatly advanced our understanding of physiological processes and pathogen-mediated phenomena in specific organs.
In this study, IVM is applied to the mouse liver and protocols are designed to image in vivo the circulatory system of the liver and measure red blood cell (RBC) velocity in individual hepatic vessels. To visualize the different vessel subtypes that characterize the hepatic organ and perform blood flow speed measurements, C57Bl/6 mice are intravenously injected with a fluorescent plasma reagent that labels the liver-associated vasculature. IVM enables in vivo, real time, measurement of RBC velocity in a specific vessel of interest. Establishing this methodology will make it possible to investigate liver hemodynamics under physiological and pathological conditions. Ultimately, this imaging-based methodology will be important for studying the influence of L. donovani infection&#160;on hepatic hemodynamics.
This method can be applied to other infectious models and mouse organs and might be further extended to pre-clinical testing of a drug&#8217;s effect on inflammation by quantifying its effect on blood flow.

Intravital Microscopy Imaging of the Liver following Leishmania Infection: An Assessment of Hepatic Hemodynamics

This article reports on a detailed method for the dynamic measurement and quantification of blood flow velocity within individual blood vessels of the mouse liver vasculature using intravital microscopy imaging in combination with a specific methodology for image acquisition and analysis.

Aşağıdaki Karaciğer intravital Mikroskopi Görüntüleme<em&gt; Leishmania</em&gt; Enfeksiyon: Karaciğer Hemodinami Üzerine Bir Değerlendirme

Intravital microscopy (IVM) is a powerful optical imaging technique that has made possible the visualization, monitoring and quantification of various ...

Long Term Intravital Multiphoton Microscopy Imaging of Immune Cells in Healthy and Diseased Liver Using CXCR6.Gfp Reporter Mice

Liver inflammation as a response to injury is a highly dynamic process involving the infiltration of distinct subtypes of leukocytes including monocytes, neutrophils, T cell subsets, B cells, natural killer (NK) and NKT cells. Intravital microscopy of the liver for monitoring immune cell migration is particularly challenging due to the high requirements regarding sample preparation and fixation, optical resolution and long-term animal survival. Yet, the dynamics of inflammatory processes as well as cellular interaction studies could provide critical information to better understand the initiation, progression and regression of inflammatory liver disease. Therefore, a highly sensitive and reliable method was established to study migration and cell-cell-interactions of different immune cells in mouse liver over long periods (about 6 hr) by intravital two-photon laser scanning microscopy (TPLSM) in combination with intensive care monitoring.
The method provided includes a gentle preparation and stable fixation of the liver with minimal perturbation of the organ; long term intravital imaging using multicolor multiphoton microscopy with virtually no photobleaching or phototoxic effects over a time period of up to 6 hr, allowing tracking of specific leukocyte subsets; and stable imaging conditions due to extensive monitoring of mouse vital parameters and stabilization of circulation, temperature and gas exchange.
To investigate lymphocyte migration upon liver inflammation CXCR6.gfp knock-in mice were subjected to intravital liver imaging under baseline conditions and after acute and chronic liver damage induced by intraperitoneal injection(s) of carbon tetrachloride (CCl4).
CXCR6 is a chemokine receptor expressed on lymphocytes, mainly on Natural Killer T (NKT)-, Natural Killer (NK)- and subsets of T lymphocytes such as CD4 T cells but also mucosal associated invariant (MAIT) T cells1. Following the migratory pattern and positioning of CXCR6.gfp+ immune cells allowed a detailed insight into their altered behavior upon liver injury and therefore their potential involvement in disease progression.

Stable intravital high-resolution imaging of immune cells in the liver is challenging. Here we provide a highly sensitive and reliable method to study migration and cell-cell-interactions of immune cells in mouse liver over long periods (about 6 hours) by intravital multiphoton laser scanning microscopy in combination with intensive care monitoring.

CXCR6.Gfp Muhabir Fare kullanma Sağlıklı ve hastalıklı Karaciğer Bağışıklık Hücreleri Uzun Vadeli intravital multiphoton Mikroskopi Görüntüleme

Liver inflammation as a response to injury is a highly dynamic process involving the infiltration of distinct subtypes of leukocytes including monocytes, ...

Analysis of Yersinia enterocolitica Effector Translocation into Host Cells Using Beta-lactamase Effector Fusions

Many gram-negative bacteria including pathogenic Yersinia spp. employ type III secretion systems to translocate effector proteins into eukaryotic target cells. Inside the host cell the effector proteins manipulate cellular functions to the benefit of the bacteria. To better understand the control of type III secretion during host cell interaction, sensitive and accurate assays to measure translocation are required. We here describe the application of an assay based on the fusion of a Yersinia enterocolitica effector protein fragment (Yersinia outer protein; YopE) with TEM-1 beta-lactamase for quantitative analysis of translocation. The assay relies on cleavage of a cell permeant FRET dye (CCF4/AM) by translocated beta-lactamase fusion. After cleavage of the cephalosporin core of CCF4 by the beta-lactamase, FRET from coumarin to fluorescein is disrupted and excitation of the coumarin moiety leads to blue fluorescence emission. Different applications of this method have been described in the literature highlighting its versatility. The method allows for analysis of translocation in vitro and also in in vivo, e.g., in a mouse model. Detection of the fluorescence signals can be performed using plate readers, FACS analysis or fluorescence microscopy. In the setup described here, in vitro translocation of effector fusions into HeLa cells by different Yersinia mutants is monitored by laser scanning microscopy. Recording intracellular conversion of the FRET reporter by the beta-lactamase effector fusion in real-time provides robust quantitative results. We here show exemplary data, demonstrating increased translocation by a Y. enterocolitica YopE mutant compared to the wild type strain.

Analysis of Yersinia enterocolitica Effector Translocation into Host Cells Using Beta-lactamase Effector Fusions

Effector translocation into host cells via a type III secretion system is a common virulence strategy among gram-negative bacteria. A beta-lactamase effector fusion based assay for quantitative analysis of translocation was applied. In Yersinia infected cells, conversion of a FRET reporter by the beta-lactamase is monitored using laser scanning microscopy.

Analizi<em&gt; Yersinia enterocolitica</emAna Hücreleri içine&gt; Efektör Translokasyon Beta-laktamaz Effector Fusions kullanma

Many gram-negative bacteria including pathogenic Yersinia spp. employ type III secretion systems to translocate effector proteins into eukaryotic target ...

Imaging Neutrophils and Monocytes in Mesenteric Veins by Intravital Microscopy on Anaesthetized Mice in Real Time

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in vivo is crucial for understanding the molecular basis of leukocyte transendothelial migration and interaction with vascular endothelium. One powerful approach involves intravital microscopy on transgenic mice expressing fluorescent proteins in cells of interest.
Here we present a protocol for imaging monocytes and neutrophils in the CX3CR1gfp/wt mouse i.v. injected with orange dye-labeled neutrophils with an inverted confocal microscope. Time-lapse movies gathered from 30 min&#160;to several hours of imaging allow the analysis of leukocyte behavior in mesenteric veins under both steady state and inflammatory conditions. We also describe the steps to locally induce blood vessel inflammation with TLR2/TLR1 agonist Pam3SK4 and monitor the subsequent recruitment of neutrophils and monocytes.
The presented technique can also be used to monitor other populations of leukocytes and investigate molecules implicated in leukocyte recruitment or trafficking using other stimuli or transgenic mice.

We detail a protocol to monitor the behavior of neutrophils and monocytes in mesenteric veins under steady state and inflammatory conditions using intravital confocal microscopy on anaesthetized mice.

Real Time Anestetize Farelerde Intravital Mikroskopi Mezenterik Damarlardaki nötrofiller ve monositler Görüntüleme

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in ...

Intravital Imaging of Neutrophil Priming Using IL-1&#946; Promoter-driven DsRed Reporter Mice

Neutrophils are the most abundant leukocytes in human blood circulation and are quickly recruited to inflammatory sites. Priming is a critical event that enhances the phagocytic functionality of neutrophils. Although extensive studies have unveiled the existence and importance of neutrophil priming during infection and injury, means of visualizing this process in vivo have been unavailable. The protocol provided enables monitoring of the dynamic process of neutrophil priming in living animals by combining three methodologies: 1) DsRed reporter signal &#8212; used as a measure of priming 2) in vivo neutrophil labeling &#8212; achieved by injection of fluorescence-conjugated anti-lymphocyte antigen 6G (Ly6G) monoclonal antibody (mAb) and 3) intravital confocal imaging. Several critical steps are involved in this protocol: oxazolone-induced mouse ear skin inflammation, appropriate sedation of animals, repeated injections of anti-Ly6G mAb, and prevention of focus drift during imaging. Although a few limitations have been observed, such as the limit of continuous imaging time (~ 8 hr) in one mouse and the leakage of fluorescein isothiocyanate-dextran from blood vessels in the inflammatory state, this protocol provides a fundamental framework for intravital imaging of primed neutrophil behavior and function, which can easily be expanded to examination of other immune cells in mouse inflammation models.

Intravital Imaging of Neutrophil Priming Using IL-1&amp;#946; Promoter-driven DsRed Reporter Mice

This current protocol employs fluorescent reporters, in vivo labeling, and intravital imaging techniques to enable monitoring of the dynamic process of neutrophil priming in living animals.

IL-1β Promoter odaklı DsRed Muhabir Fare kullanma Nötrofil Hazırlama intravital Görüntüleme

Neutrophils are the most abundant leukocytes in human blood circulation and are quickly recruited to inflammatory sites. Priming is a critical event that ...