Burada açıklanan protokol, in vivo kanser modellerini kullanarak tedavi etkinliğini test etmek için bir algoritma göstermeyi amaçlamaktadır. Protokol çeşitli tekniklerin bir kombinasyonundan oluşur. İnsan tümör örneklerinin tüm genom biyo-dizilimi genomik değişiklikleri tanımlamak için kullanılır.
Bunlar hem gen rearrangements hem de gen kopya numarası değişikliklerini içerir. Bu yüzden, potansiyel olarak uyuşturucu verilebilen değişiklikleri seçmek için tanımlanmış değişikliklerin analizi yapılır. Genomik analize dayalı olarak seçilen ilaçlar daha sonra immünazlarda yetişen ilgili tümörlerin in vivo tedavisinde kullanılır.
Geliştirilen algoritma kanser hastalarının bakımı için tedavi kararlarına yardımcı olmak için umut verici bir yaklaşım temsil eder. Hedeflenebilir değişiklikleri belirlemek için Panda aracını veya benzer bir yazılımı kullanın. Mikrosedikleme ile tanımlanan genleri standart kabul görmüş gen sembolleri kullanarak basit bir sekme olarak tanımlanan dosya olarak sıralayabiliriz.
Tablo üstbilgisinin yazılımın U yol seviyesine aktarıldığından emin olmak için listenin üstbilgisine pound işaretini ekleyin. İlgili gezinti sekmesine tıklayarak dosyayı yükleyin. Seçim simgesine tıklayarak ve sonra sonlandırma sekmesine tıklayarak temel verileri temsil edecek tek bir simge atayın.
Hasta dosyaları yüklendikten sonra, yol başına açıklamalı gen sayısını görüntüleyen bir sütunu tanımlamak için sayfayı önizleyin. Bu sağdaki son sütun. İlgi genleri içeren yollar ayarı için ana pencerenin sol üst kısmında bir yol filtresi kullanın.
Şans eseri beklenenden daha fazla gen açıklamalı olan yolları belirlemek için zenginleştirme sekmesinin altında bulunan bir işlev kullanın. Daha sonra bir sütun, fisher'ın tam testinden karşılık gelen p değerini gösteren ana tabloya eklenir. Ana pencerenin solundaki uygun simgeyi kontrol ederek önceden ayarlanmış ek açıklamalardan potansiyel ilaçlanabilir genleri görüntülemek için veritabanını seçin.
Görselleştirme için bir yol seçmek için, yol görüntüleyici sayfasında görüntülenen adını tıklatın. Her ek açıklama kümesini temsil eden simgeler ilişkili genin yanında görüntülenir. Patikadaki herhangi bir genin üzerine tıkladığınızda ilgili gen kartları sayfası açılır.
Daha fazla analiz için ilgi ve potansiyel ilaçlar için isabet açıklamalı genler gösterdi yolları seçin. Steril koşulları korumak için bir laminar akış kaputunda doku çalışması gerçekleştirin. Soğuk PBS veya rpmi, DMEM gibi antibiyotik içeren doku kültürü ortamı içeren bir çanak içinde tümör dokusu lay.
Bir patolog yardımıyla komşu normal ve nekrotik dokudan canlı tümör materyalini belirleyin ve izole edin. Bir patolog tarafından işaret nekrotik malzeme kaldırmak için steril çerte ve neşter kullanın. Deri altı engraftment gerçekleştirmek için, küçük parçalar halinde steril forceps, neşter veya cerrahi makas ile tümör dokusu kesilmiş, boyutu kabaca 2 x 2 x 2 milimetre.
Parçalanmış dokuyu buz üzerinde önceden soğutulmuş bir petri kabına aktarın. Parçalanmış doku ile çanak içine soğuk matrigel izin, doku 10 adet başına yaklaşık 200 mikrolitre. Iyice karıştırın ve doku parçaları 10 dakika matrigel emmek sağlar.
Bir farenin her iki yan üzerinde 5-10 milimetre dikey deri kesi yapmak için steril cerrahi makas ve forseps kullanın. Bir tümör parçası yağ yastığı nın altına yerleştirilecek kadar büyük bir cep oluşturmak için deri altı boşluğa yavaşça düz forseps yerleştirin. Beş farenin her birine önceden hazırlanmış cebine tümör parçaları yerleştirmek için steril düz forceps kullanın.
Doku tutkal kullanarak deri kesi kapatın. İmplantasyondan sonra, lenfosit proliferasyonunu inhibe etmek için, her fareye 100 mikrolitre ritukimab enjekte edin. Farenin arka derisini çimdikleyerek ve farenin baş ve dudakları hareketsiz hale getirilmiş olacak şekilde geriye doğru bükerek fareyi oral gavage için hazırlayın.
Gavaj sondasını farenin boğazının arkasına, sonda yemek borusuna ulaşana kadar yerleştirin. Sondanın çok uzağa yerleştirildiğinden emin olun çünkü farenin akciğerleri ölüme neden olabilir. Temsili genom şamandırası bir tümördeki genomik değişikliklerin manzarasını göstermektedir.
Yüksek dereceli serosubtip tümörler için tipik, birden fazla kazanım mavi çizgiler ve kayıplar kırmızı çizgiler, genomik instabilite yüksek düzeyde gösteren tespit edildi. OC101 tümöründe terapötik girişim için en önemli eğilim değişikliği, HER2 reseptörünü kodlayan bir gen olan ERBB2'yi içeren kromozom 17'de bir amplifikasyondu. DNA düzeyindesonuçları doğrulamak için, özel astar çeşitli setleri yükseltilmiş bölgenin kenarları için tasarlanmıştır.
Ve PCR gerçekleştirildi. Kontrol insan DNA'sı kullanıldığında hiçbir amplifikasyon ürünü absorbe edilemedi. OC101 tümör DNA'sı için spesifik bantlar saptandı.
Başka bir varyant tümör, T14, çok sayıda DNA kazanımları gözlendi. Bunlar arasında RICTOR genlerinde AKT2 de yer almıştır. Protein düzeyinde yapılan doğrulamada, immünolotlama kullanılarak RICTOR'da yüksek düzeyde AKT saptandı.
Altıncı hafta sonuna kadar kemoterapi tedavisi yapılan grupta tümör yükünde önemli bir azalma gözlendi. Kombinasyon tedavisi alan gruplarda tek başına kemoterapiye göre ekstra bir fayda vardı. Tedavi denemesi sonunda tedavi yanıtının moleküler analizi için tümör dokusu toplandı.
İmmünoblotting kullanılarak S6, AKT ve mTOR'un total ve fosforiile düzeyleri belirlendi. Tedavi edilmeyen, kemoterapi ile tedavi edilen ve AKT veya mTOR inhibitörü ile tedavi edilen bu proteinlerin düzeylerinin karşılaştırılması, son iki protein için belirgin bir azalma gösterdi. Sunulan yaklaşım PDX modellerinde klinik deney yapmak için çok yararlıdır.
Test için en iyi ilaç seçimini belirlemek için genomik profilleme ile elde edilen tümörün moleküler özelliklerinden yararlanır.
