Описанный здесь протокол направлен на демонстрацию алгоритма тестирования эффективности лечения с использованием моделей рака in vivo. Протокол состоит из комбинации нескольких методов. Для выявления геномных изменений используется биосеквенирование всего генома образцов опухолей человека.
К ним относятся как перестановки генов, так и изменения числа копий генов. Таким образом, анализ выявленных изменений проводится для того, чтобы выбрать потенциально наркотические изменения. Препараты, отобранные на основе геномного анализа, затем используются для лечения соответствующих опухолей, выращенных у мышей с ослабленным иммунитетом.
Разработанный алгоритм представляет собой перспективный подход к оказанию помощи в принятии решений по лечению онкологических больных. Используйте инструмент Panda или аналогичное программное обеспечение для определения целевых изменений. Мы можем перечислить гены, которые были идентифицированы по микросеккенкированию, в результате чего был простой файл, очерченный вкладкой, используя стандартные принятые символы генов.
Добавьте знак фунта к заголовку списка, чтобы убедиться, что заголовок таблицы передается на уровень пути U программного обеспечения. Загрузите файл, нажав на соответствующую навигационную вкладку. Назначьте один значок для представления базовых данных, нажав на значок выбора, а затем нажав на завершенную вкладку.
После загрузки файлов пациента просмотрите страницу, чтобы определить столбец, отображаемый количество аннотированных генов на пути. Это последняя колонка справа. Используйте фильтр пути в левом верхнем левом верхнем левом части главного окна, чтобы ограничить количество путей, отображаемых на те, которые содержат гены интереса.
Чтобы определить пути, которые имеют больше генов аннотированы, чем можно было бы ожидать случайно, используйте функцию, расположенную под вкладкой обогащения. Затем столбец добавляется в основную таблицу, которая показывает соответствующую p-значение из точного теста Фишера. Выберите базу данных для отображения потенциальных генов с наркотиками из предустановленной аннотации, проверив соответствующий значок слева от основного окна.
Чтобы выбрать путь для визуализации, нажмите на его имя, отображаемое на странице просмотра пути. Рядом с ассоциированным геном отображаются значки, представляющие каждый набор аннотации. Нажатие на любой ген в пути откроет соответствующую страницу генных карт.
Выберите пути, которые показали аннотированные гены, представляющие интерес и хиты для потенциальных препаратов для дальнейшего анализа. Выполните работу ткани в капюшоне ламинарного потока для поддержания стерильных условий. Положите опухолевые ткани в блюдо, содержащее холодный PBS или ткани культуры средств массовой информации, таких как RPMI, DMEM, содержащие антибиотики.
Определить и изолировать жизнеспособный опухолевый материал из смежных нормальных и некротических тканей с помощью патологоанатома. Используйте стерильные типсы и скальпель для удаления некротического материала, отмеченного патологоанатомом. Для выполнения подкожного прираздела, разрежьте опухолевую ткань стерильными мипсами, скальпелем или хирургическими ножницами на мелкие фрагменты, размером примерно 2 х 2 х 2 миллиметра.
Перенесите фрагментированную ткань в предварительно охлажденную чашку Петри на льду. Пусть холодный матригель в блюдо с фрагментированной ткани, около 200 микролитров на 10 кусков ткани. Хорошо перемешать и дайте фрагментам ткани замочить в матригеле в течение 10 минут.
Используйте стерильные хирургические ножницы и типсы, чтобы сделать 5-10 миллиметров вертикального разреза кожи на обоих флангах мыши. Вставьте прямые миппы осторожно в подкожное пространство, чтобы создать карман достаточно большой для фрагмента опухоли, чтобы быть помещены под жировой подушечку. Используйте стерильные прямые типсы, чтобы вставить фрагменты опухоли в ранее подготовленный карман в каждой из пяти мышей.
Закройте разрез кожи с помощью тканевого клея. После имплантации, чтобы ингибировать пролифкоцитов пролиферации, вводить каждой мыши с 100 микролитров ритуксимаба. Подготовь мышь к пероральному гаважу, ущипнув кожу спины и согнув ее назад, чтобы голова и губы мыши были обездвижены.
Вставьте зонд gavage вниз задней части горла мыши, пока зонд не достигнет пищевода. Убедитесь, что зонд не вставляется слишком далеко, как легкие мыши может перфорировать вызывая смерть. Репрезентативный поплавок генома иллюстрирует ландшафт геномных изменений в одной опухоли.
Типичные для высококачественных опухолей серосубтипа, несколько завоеваний синих линий и потерь красных линий, были определены с указанием высоких уровней геномной нестабильности. Верхней тенденцией изменения терапевтического вмешательства в опухоли OC101 было усиление в хромосоме 17, с участием ERBB2, ген, который кодирует рецептор HER2. Для проверки результатов на уровне ДНК, несколько наборов конкретных грунтовки были разработаны для краев усиленной области.
И ПЦР был проведен. Ни один продукт усиления не был поглощен при контроле человеческой ДНК. Конкретные полосы были определены для OC101 ДНК опухоли.
В другом варианте опухоли, T14, многочисленные успехи ДНК наблюдались. К ним относятся AKT2 в генах RICTOR. Проверка, проведенная на уровне белка, с использованием иммуноблоттинга показала высокий уровень АКТ в РИКТОРЕ.
Значительное снижение бремени опухоли наблюдалось в группе химиотерапии к концу шестой недели. Существовал дополнительное преимущество по поводу химиотерапии только в группах, которые получили комбинированное лечение. Опухолевая ткань была собрана для молекулярного анализа реакции лечения в конце испытания лечения.
Общие и фосфорилированные уровни S6, AKT и mTOR были определены с использованием иммуноблоттинга. Сравнение уровней этих белков в необработанных, обработанных химиотерапией и обработанных ингибитором АКТ или mTOR показало заметное снижение для последних двух. Представленный подход очень полезен для проведения клинических испытаний в моделях PDX.
Он использует молекулярные характеристики опухоли, полученные путем геномного профилирования, чтобы определить наилучший выбор препаратов для тестирования.
