El protocolo descrito aquí tiene como objetivo demostrar un algoritmo para probar la eficacia del tratamiento utilizando modelos de cáncer in vivo. El protocolo consiste en una combinación de varias técnicas. La biosecuenciación del genoma completo de muestras de tumores humanos se utiliza para identificar alteraciones genómicas.
Estos incluyen tanto reordenamientos genéticos como cambios en el número de copia genética. Por lo tanto, el análisis de las alteraciones identificadas se realiza con el fin de seleccionar cambios potencialmente farmacológicas. Los fármacos seleccionados en base al análisis genómico se utilizan para el tratamiento in vivo de los tumores correspondientes cultivados en ratones inmunocomprometidos.
El algoritmo desarrollado representa un enfoque prometedor para ayudar a las decisiones de tratamiento para la atención de los pacientes con cáncer. Utilice la herramienta Panda o un software análogo para identificar alteraciones específicas. Podemos enumerar los genes que fueron identificados por la microsecuenciación resultaron como un simple archivo delineado de pestaña utilizando símbolos genéticos aceptados estándar.
Agregue el signo de libra a la línea de encabezado de la lista para asegurarse de que el encabezado de la tabla se transfiere al nivel de ruta U del software. Cargue el archivo haciendo clic en la pestaña de navegación correspondiente. Asigne un solo icono para representar los datos subyacentes haciendo clic en el icono de su elección y, a continuación, haciendo clic en la pestaña Finalizar.
Una vez que se cargan los archivos de un paciente, obtenga una vista previa de la página para identificar una columna que muestra el número de genes anotados por ruta. Esta es la última columna a la derecha. Utilice un filtro de vía en la parte superior izquierda de la ventana principal para restringir el número de vías mostradas a las que contienen los genes de interés.
Para identificar vías que tienen más genes anotados de lo que se esperaría por casualidad, utilice una función ubicada debajo de la pestaña de enriquecimiento. A continuación, se agrega una columna a la tabla principal que muestra el valor p correspondiente de la prueba exacta de Fisher. Seleccione la base de datos para mostrar posibles genes farmacológicas a partir de anotaciones predefinidas comprobando un icono apropiado a la izquierda de la ventana principal.
Para seleccionar una ruta para la visualización, haga clic en su nombre que se muestra en la página del visor de rutas. Los iconos que representan cada conjunto de anotaciones se muestran junto al gen asociado. Al hacer clic en cualquier gen de la vía se abrirá la página correspondiente de tarjetas genéticas.
Seleccione las vías que mostraron genes anotados de interés y golpes para fármacos potenciales para su posterior análisis. Realizar el trabajo de tejido en una campana de flujo laminar para mantener condiciones estériles. Poner el tejido tumoral en un plato que contenga PBS frío o medios de cultivo de tejidos, como RPMI, DMEM, que contienen antibióticos.
Identificar y aislar material tumoral viable del tejido normal y necrótico adyacente con la ayuda de un patólogo. Utilice fórceps estériles y bisturí para eliminar el material necrótico señalado por un patólogo. Para realizar el injerto subcutáneo, corte el tejido tumoral con fórceps estériles, bisturí o tijeras quirúrgicas en pequeños fragmentos, aproximadamente 2 x 2 x 2 milímetros de tamaño.
Transfiera el tejido fragmentado a una placa de petri pre-refrigerada sobre hielo. Dejar en frío el matrielón en el plato con el tejido fragmentado, aproximadamente 200 microlitros por cada 10 trozos de tejido. Mezclar bien y dejar que los fragmentos de tejido se empapen en el matrigel durante 10 minutos.
Utilice tijeras quirúrgicas estériles y fórceps para hacer una incisión de piel vertical de 5-10 milímetros en ambos flancos de un ratón. Inserte los fórceps rectos suavemente en el espacio subcutáneo para crear un bolsillo lo suficientemente grande como para que un fragmento de tumor se coloque debajo de la almohadilla de grasa. Utilice fórceps rectos estériles para insertar fragmentos de tumores en el bolsillo previamente preparado en cada uno de los cinco ratones.
Cierre la incisión de la piel usando pegamento tisú. Después de la implantación, para inhibir la proliferación de linfocitos, inyectar cada ratón con 100 microlitros de rituximab. Prepare el ratón para el gavage oral pellizcando la piel de la espalda y doblándola hacia atrás para que la cabeza y los labios del ratón estén inmovilizados.
Inserte la sonda gavage por la parte posterior de la garganta del ratón hasta que la sonda llegue al esófago. Asegúrese de que la sonda no se inserte demasiado lejos, ya que los pulmones del ratón pueden perforar causando la muerte. La carroza representativa del genoma ilustra el paisaje de los cambios genómicos en un tumor.
Típico de los tumores serosubtipos de alto grado, múltiples ganancias de líneas azules y líneas rojas pérdidas, se identificaron indicando altos niveles de inestabilidad genómica. La principal alteración de la tendencia para la intervención terapéutica en el tumor OC101 fue una amplificación en el cromosoma 17, que involucró a ERBB2, un gen que codifica para el receptor HER2. Para validar los resultados a nivel de ADN, se diseñaron varios conjuntos de imprimaciones específicas para los bordes de la región amplificada.
Y pcR se llevó a cabo. No se absorbió ningún producto de amplificación cuando se utilizó el control del ADN humano. Se identificaron bandas específicas para el ADN tumoral OC101.
En otro tumor variante, T14, se observaron numerosas ganancias de ADN. Esos incluyeron AKT2 en genes RICTOR. La validación realizada a nivel proteico, utilizando inmunoblotting mostró altos niveles de AKT en RICTOR.
Se observó una reducción significativa de la carga tumoral en el grupo tratado con quimioterapia al final de la semana seis. Hubo un beneficio adicional sobre la quimioterapia solo en los grupos que recibieron un tratamiento combinado. Se recogió tejido tumoral para el análisis molecular de la respuesta al tratamiento al final del ensayo de tratamiento.
Los niveles totales y fosforilados de S6, AKT y mTOR se determinaron mediante inmunobloqueo. La comparación de los niveles de estas proteínas en no tratadas, tratadas con quimioterapia y tratadas con inhibidores de AKT o mTOR mostró una marcada disminución para estas dos últimas. El enfoque presentado es muy útil para llevar a cabo el ensayo clínico en modelos PDX.
Aprovecha las características moleculares del tumor obtenidas por el perfil genómico para determinar la mejor opción de fármacos para el análisis.
