Das hier beschriebene Protokoll soll einen Algorithmus zur Prüfung der Wirksamkeit der Behandlung mit In-vivo-Krebsmodellen demonstrieren. Das Protokoll besteht aus einer Kombination mehrerer Techniken. Die gesamte Genom-Biosequenzierung menschlicher Tumorproben wird verwendet, um genomische Veränderungen zu identifizieren.
Dazu gehören sowohl Gen-Rearrangements als auch Änderungen der Anzahl der Genkopien. So wird die Analyse der identifizierten Veränderungen durchgeführt, um potenziell medikamentöse Veränderungen auszuwählen. Die auf der Grundlage der Genomanalyse ausgewählten Medikamente werden dann zur In-vivo-Behandlung entsprechender Tumoren verwendet, die in immungeschwächten Mäusen angebaut werden.
Der entwickelte Algorithmus stellt einen vielversprechenden Ansatz zur Unterstützung von Behandlungsentscheidungen für die Versorgung von Krebspatienten dar. Verwenden Sie das Panda-Tool oder eine analoge Software, um zielfähige Änderungen zu identifizieren. Wir können die Gene auflisten, die durch Mikrosequenzierung identifiziert wurden, die als einfache Tab-delineated Datei mit Standard akzeptierten Gensymbolen resultierte.
Fügen Sie das Pfundzeichen zur Kopfzeile der Liste hinzu, um sicherzustellen, dass der Tabellenkopf auf die Pfadebene U der Software übertragen wird. Laden Sie die Datei hoch, indem Sie auf die entsprechende Navigationsregisterkarte klicken. Weisen Sie ein einzelnes Symbol zur Darstellung der zugrunde liegenden Daten zu, indem Sie auf das Symbol ihrer Wahl und dann auf die Registerkarte "Abschließen" klicken.
Sobald dann eine Patientendatei hochgeladen wird, zeigen Sie eine Vorschau der Seite an, um eine Spalte zu identifizieren, die die Anzahl der annotierten Gene pro Pfad anzeigt. Dies ist die letzte Spalte auf der rechten Seite. Verwenden Sie einen Pfadfilter in der oberen linken Seite des Hauptfensters, um die Anzahl der angezeigten Pfade auf die Wege zu beschränken, die die geneswichtig enthalten.
Um Pfade zu identifizieren, die mehr Gene kommentieren, als zufällig erwartet würden, verwenden Sie eine Funktion unter der Anreicherungsregisterkarte. Anschließend wird der Haupttabelle eine Spalte hinzugefügt, die den entsprechenden p-Wert aus dem genauen Test eines Fishers anzeigt. Wählen Sie die Datenbank aus, um potenzielle drogenfähige Gene aus voreingestellter Anmerkung anzuzeigen, indem Sie ein entsprechendes Symbol auf der linken Seite des Hauptfensters überprüfen.
Um einen Pfad für die Visualisierung auszuwählen, klicken Sie auf den Namen, der auf der Seite "Pfad-Viewer" angezeigt wird. Symbole, die jeden Anmerkungssatz darstellen, werden neben dem zugeordneten Gen angezeigt. Wenn Sie auf ein beliebiges Gen im Pfad klicken, wird die entsprechende Seite der Genkarten geöffnet.
Wählen Sie die Wege aus, die annotierte Gene von Interesse und Treffer für potenzielle Medikamente für weitere Analysen zeigten. Führen Sie die Gewebearbeit in einer laminaren Strömungshaube durch, um sterile Bedingungen aufrechtzuerhalten. Legen Sie das Tumorgewebe in eine Schale, die kalte PBS oder Gewebekulturmedien wie RPMI, DMEM enthält und Antibiotika enthält.
Identifizieren und isolieren Sie lebensfähiges Tumormaterial aus angrenzendem normalen und nekrotischen Gewebe mit Hilfe eines Pathologen. Verwenden Sie sterile Zangen und Skalpell, um nekrotisches Material zu entfernen, auf das ein Pathologe hingewiesen hat. Um subkutane Engraftment durchzuführen, schneiden Sie das Tumorgewebe mit sterilen Zangen, Skalpell oder chirurgischen Scheren in kleine Fragmente, etwa 2 x 2 x 2 Millimeter groß.
Übertragen Sie das fragmentierte Gewebe auf Eis in eine vorgekühlte Petrischale. Lassen Sie kalte Matrigel in die Schale mit dem fragmentierten Gewebe, etwa 200 Mikroliter pro 10 Stück Gewebe. Gut mischen und die Gewebefragmente 10 Minuten im Matrigel einweichen lassen.
Verwenden Sie sterile chirurgische Schere und Zangen, um einen 5-10 Millimeter vertikalen Hautschnitt an beiden Flanken einer Maus zu machen. Setzen Sie gerade Zangen sanft in den subkutanen Raum ein, um eine Tasche zu schaffen, die groß genug ist, um ein Tumorfragment unter das Fettpolster zu legen. Verwenden Sie sterile gerade Zangen, um Tumorfragmente in die zuvor vorbereitete Tasche in jeder von fünf Mäusen einzufügen.
Schließen Sie den Hautschnitt mit Gewebekleber. Nach der Implantation, um die Lymphozytenproliferation zu hemmen, injizieren Sie jede Maus mit 100 Mikroliter Rituximab. Bereiten Sie die Maus für die orale Gavage vor, indem Sie die Haut des Rückens kneifen und sie nach hinten biegen, so dass der Kopf und die Lippen der Maus bewegungsunfähig sind.
Setzen Sie die Gavage-Sonde an der Rückseite der Mauskehle ein, bis die Sonde die Speiseröhre erreicht. Stellen Sie sicher, dass die Sonde nicht zu weit eingesetzt wird, da die Lunge der Maus den Tod verursachen kann. Der repräsentative Genomschwimmer veranschaulicht die Landschaft genomischer Veränderungen in einem Tumor.
Typisch für hochgradige Serosubtyp-Tumoren, mehrere Gewinne blaue Linien und Verluste rote Linien, wurden identifiziert, die ein hohes Maß an genomischer Instabilität. Die Top-Trend-Veränderung für therapeutische Interventionen im OC101-Tumor war eine Amplifikation am Chromosom 17, bei der ERBB2, ein Gen, das für HER2-Rezeptorkodiert ist, beteiligt war. Um die Ergebnisse auf DNA-Ebene zu validieren, wurden mehrere Sätze spezifischer Primer für die Ränder des verstärkten Bereichs entwickelt.
Und PCR wurde durchgeführt. Bei der Verwendung der Kontrolle der menschlichen DNA wurde kein Amplifikationsprodukt absorbiert. Für OC101-Tumor-DNA wurden spezifische Bänder identifiziert.
In einem anderen Variantentumor, T14, wurden zahlreiche DNA-Gewinne beobachtet. Dazu gehörten AKT2 in RICTOR-Genen. Die Validierung auf Proteinebene mit Immunoblotting zeigte einen hohen AKT-Gehalt in RICTOR.
Eine signifikante Verringerung der Tumorbelastung wurde in der chemotherapiebehandelten Gruppe bis zum Ende der sechsten Woche beobachtet. Es gab einen zusätzlichen Nutzen gegenüber der Chemotherapie allein in den Gruppen, die eine Kombinationsbehandlung erhielten. Tumorgewebe wurde für die molekulare Analyse des Behandlungsreaktionens am Ende der Behandlungsstudie gesammelt.
Die Gesamt- und Phosphorylatwerte von S6, AKT und mTOR wurden mittels Immunoblotting ermittelt. Der Vergleich der Konzentrationen dieser Proteine in unbehandelten, chemotherapiebehandelten und mit AKT- oder mTOR-Hemmerbehandelten behandelten Proteinen zeigte bei den beiden letztgenannten eine deutliche Abnahme. Der vorgestellte Ansatz ist sehr nützlich, um die klinische Studie in PDX-Modellen durchzuführen.
Es nutzt die molekularen Eigenschaften des Tumors, wie durch genomische Profilierung erhalten, um die beste Wahl von Medikamenten für Tests zu bestimmen.
