הפרוטוקול המתואר כאן נועד להדגים אלגוריתם לבדיקת יעילות הטיפול באמצעות מודלים של סרטן vivo. הפרוטוקול מורכב משילוב של מספר טכניקות. רצף ביולוגי שלם של הגנום של דגימות גידול אנושי משמש לזיהוי שינויים גנומיים.
אלה כוללים גם סידורים מחדש של גנים וגם שינויים במספר עותקי הגנים. אז הניתוח של שינויים מזוהים מבוצע על מנת לבחור שינויים שעשויים להיות ניתנים לסמים. התרופות שנבחרו על סמך ניתוח גנומי משמשות לאחר מכן לטיפול in vivo בגידולים מקבילים הגדלים בעכברים immunocompromised.
האלגוריתם המפותח מייצג גישה מבטיחה לסיוע בהחלטות טיפול בטיפול בחולים בסרטן. השתמש בכלי Panda או בתוכנה אנלוגית כדי לזהות שינויים הניתנים למטרה. אנחנו יכולים לפרט את הגנים שזוהו על ידי microsequencing הביא כקובץ מסוים טאב פשוט באמצעות סמלי גנים מקובלים סטנדרטיים.
הוסף את סימן הפאונד לכותרת העליונה של הרשימה כדי להבטיח שכותרת הטבלה תועבר לרמת הנתיב U של התוכנה. העלה את הקובץ על-ידי לחיצה על כרטיסיית הניווט המתאימה. הקצה סמל יחיד כדי לייצג את הנתונים המשמשים כבסיס על-ידי לחיצה על סמל הבחירה ולאחר מכן לחיצה על הכרטיסיה 'תהפוך לסופי'.
לאחר מכן מועלים קבצי מטופל, הצג את הדף בתצוגה מקדימה כדי לזהות עמודה המציגה את מספר הגנים המוערים לכל מסלול. זו העמודה האחרונה מימין. השתמש במסנן מסלול בפינה הימנית העליונה של החלון הראשי כדי להגביל את מספר הנתיבים המוצגים לאלה המכילים את הגנים המעניינים.
כדי לזהות מסלולים שיש להם יותר גנים מבוארים מהצפוי במקרה, השתמש בפונקציה הממוקמת תחת לשונית ההעשרה. לאחר מכן, עמודה נוספת לטבלה הראשית המציגה ערך p תואם מהבדיקה המדויקת של פישר. בחר את מסד הנתונים כדי להציג גנים פוטנציאליים לתרופה מהביאור המוגדר מראש על-ידי בדיקת סמל מתאים בצד שמאל של החלון הראשי.
כדי לבחור נתיב לפריט חזותי, לחץ על שמו המוצג בדף מציג הנתיבים. סמלים המייצגים כל ערכת ביאורים מוצגים לצד הגן המשויך. לחיצה על כל גן במסלול תפתח את דף כרטיסי הגנים המתאים.
בחר את המסלולים שהראו גנים מבוארים של עניין להיטים עבור תרופות פוטנציאליות לניתוח נוסף. בצע את עבודת הרקמה במכסה המנוע לזרימת למינאר כדי לשמור על תנאים סטריליים. הנח את רקמת הגידול בצלחת המכילה PBS קר או מדיה תרבות רקמות, כגון RPMI, DMEM, המכיל אנטיביוטיקה.
לזהות ולבודד חומר גידול בר קיימא מרקמה נורמלית ונמקית סמוכה בעזרת פתולוג. השתמש מלקעות סטריליות ואזמל כדי להסיר חומר נמק הצביע על ידי פתולוג. כדי לבצע חריטה תת עורית, לחתוך את רקמת הגידול עם ממטרים סטריליים, אזמל או מספריים כירורגיים לרסיסים קטנים, בערך 2 x 2 x 2 מילימטרים בגודל.
מעבירים את הרקמה המפוצלת לצלחת פטרי מצוננת מראש על קרח. תן מטריגל קר לתוך המנה עם הרקמה מקוטעת, כ 200 microliters לכל 10 חתיכות של רקמה. מערבבים היטב ולתת שברי הרקמה להשרות את המטריגל במשך 10 דקות.
השתמש מספריים כירורגיים סטריליים מדפים לעשות חתך עור אנכי 5-10 מילימטרים על שני האגפים של העכבר. הכנס מדפים ישרים בעדינות לחלל התת עורי כדי ליצור כיס גדול מספיק כדי שבר הגידול להיות ממוקם מתחת כרית השומן. השתמש במדפים סטריליים ישרים כדי להכניס שברי גידול בכיס שהוכן בעבר בכל אחד מחמשת העכברים.
סגור את חתך העור באמצעות דבק רקמות. לאחר ההשתלה, כדי לעכב התפשטות לימפוציטים, להזריק לכל עכבר עם 100 microliters של rituximab. הכן את העכבר עבור gavage אוראלי על ידי צביטת העור של הגב וכיפוף אותו לאחור, כך הראש והשפתיים של העכבר משותקים.
הכנס את בדיקה gavage במורד החלק האחורי של הגרון של העכבר עד החללית מגיעה הוושט. ודא כי החללית אינה מוכנסת רחוק מדי כמו הריאות של העכבר עלול לניקוב גרימת מוות. צף הגנום הייצוגי ממחיש את הנוף של שינויים גנומיים בגידול אחד.
אופייני לגידולים סרוסוביטיפ בדרגה גבוהה, רווחים מרובים קווים כחולים והפסדים קווים אדומים, זוהו המציין רמות גבוהות של חוסר יציבות גנומית. שינוי המגמה העליון להתערבות טיפולית בגידול OC101 היה הגברה כרומוזום 17, מעורבים ERBB2, גן אשר קודים עבור קולטן HER2. כדי לאמת את התוצאות ברמת הדנ"א, מספר קבוצות של פריימרים ספציפיים תוכננו עבור הקצוות של האזור המוגבר.
ו PCR בוצע. שום מוצר הגברה לא נספג בעת שימוש בדנ"א אנושי. להקות ספציפיות זוהו עבור DNA גידול OC101.
בגידול גרסה אחרת, T14, רווחי DNA רבים נצפו. אלה כללו AKT2 בגנים RICTOR. אימות שבוצע ברמת החלבון, באמצעות immunoblotting הראה רמות גבוהות של AKT ב RICTOR.
ירידה משמעותית בנטל הגידול נצפתה בקבוצה לטיפול כימותרפי עד סוף השבוע השישי. היה יתרון נוסף על כימותרפיה לבד בקבוצות שקיבלו טיפול משולב. רקמת הגידול נאספה לניתוח מולקולרי של תגובת הטיפול בסוף ניסוי הטיפול.
רמות סה"כ וזרחן של S6, AKT, ו mTOR נקבעו באמצעות immunoblotting. השוואה של רמות של חלבונים אלה בטיפול לא מטופל, כימותרפיה, וטופלו עם מעכבי AKT או mTOR הראו ירידה ניכרת עבור שני האחרונים. הגישה המוצגת שימושית מאוד כדי לנהל את הניסוי הקליני במודלים PDX.
זה מנצל את המאפיינים המולקולריים של הגידול כפי שהושג על ידי פרופיל גנומי כדי לקבוע את הבחירה הטובה ביותר של תרופות לבדיקה.
