Bu yöntem hastalardan periferik kan kullanarak PD-1-bloke antikor-bağlı hücreleri belirlediği için, antitümör etkileri ve immün ile ilgili advers olaylardan sorumlu spesifik alt küme tespit edilebilir. Bu yöntem kan örneği sadece küçük bir miktar ihtiyacı ve analiz süreci oldukça basit ve hızlıdır. Sadece akış sitometri makinesine ihtiyacı var.
Başlamak için, EDTA içeren kan toplama tüpleri içine tam kan örnekleri toplamak. Her beş mililitre yuvarlak alt polistiren akış sitometri tüppbs% 2 fetal sığır serum bir mililitre ile tedavi. 10 saniyelik girdap.
Daha sonra 20 mikrolitre tam kan örneğini tedavi edilen beş mililitrelik yuvarlak alt tüplere aktarın. PBS'de 20 mikrolitre %2 FBS ve insana özgü FC reseptör bloke reaktifinin 10 mikrolitresini ekleyin. İyi bir şekilde karıştırın ve oda sıcaklığında 15 dakika kuluçkaya yatırın.
Sonra, kırmızı kan hücresi lisis tampon 500 mikrolitre ekleyin. İyi bir şekilde karıştırın ve oda sıcaklığında 10 dakika kuluçkaya yatırın. PBS'de %2 FBS'lik dört mililitre ekleyin ve hücreleri 400 kez g'de dört santigrat derecede beş dakika boyunca aşağı doğru döndürün.
Aspirasyon tarafından supernatant çıkarın. Yıkama ve aspirasyon işlemini tekrarlayın. PBS'de %2 FBS'lik 100 mikrolitredeki hücreleri yeniden askıya alın ve her biri 50 mikrolitreden oluşan iki tüpe bölün.
Yüzey marker antikorları ekleyin. İyi bir şekilde karıştırın ve karanlıkta oda sıcaklığında 20 dakika kuluçkaya yatırın. Örnekleri pbs'de daha önce olduğu gibi %2 FBS'de iki kez yıkayın.
PBS'de %2 FBS'nin 200 mikrolitresinde hücreleri yeniden askıya alın. Tüpleri akış sitometresine yerleştirin ve önerilen protokolü izleyerek hücreleri edinin. 10.000 olayı lenfosit kapısı olarak kaydedin ve akış verilerini analiz için FCS dosyaları olarak dışa aktarın.
Analiz yazılımındaki dosyaları açın ve ileri dağılımdaki hücreleri yan dağılım çizimine ve kapı lenfositlerine karşı görselleştirmek için izotip kontrolü dosyasına tıklayın. FSCH ile FSCW ve SSCH ve SSCW'yi kullanarak tek hücreleri seçin ve bunları CD3'e karşı CD8 veya CD3 ile CD4 çiziminde görüntüleyin. Cd8 T-hücrelerini ve CD4 T-hücrelerini sırasıyla açın.
Kapılı hücreleri seçin ve bunları insan IgG4 çizimine karşı bir PD-1 üzerinde görüntüleyin. Ve sonra izotip kontrolüne dayanarak, PD-1 engelleyen antikora bağlı CD8 ve CD4 T hücrelerini tanımlamak için Q3'u seçin. Bu çalışmada, gating stratejisi ve akış sitometri analizi, hastanın periferik kan damlasından elde edilen T-hücrelerine PD-1 blokajlı antikor bağlanması nı saptmıştır.
PD-1 karşı insan IgG4 arsa T-hücreleri üzerinde PD-1-bloke antikorların bağlayıcı durumunu gösterir. Turuncu noktalar ve siyah noktalar sırasıyla anti-IgG4 antikor ve isotip kontrol boyama gösterir. PD-1-bloke edici antikor verilmeden önce insan IgG4 pozitif CD8 veya CD4 T-hücreleri mevcut değildi ve PD-1 ekspresyonu pd-1 saptanan antikor ile doğrulandı.
Nivolumab veya pembrolizumab uygulamasından sonra, IgG4 anti-IgG4 antikor ile T-hücrelerinde tespit edilebilirken, PD-1 tespit antikor EH12.1 T-hücrelerinde herhangi bir PD-1 tanımaz. Kırmızı, mavi ve yeşil kapılar sırasıyla tam bağlama, kısmi bağlama ve bağlama kaybını gösterir. Hastalar nivolumab ve pembrolizumab kesildikten sonra, CD8 T hücrelerine bağlanan PD-1-bloke edici antikor ların durumu azaldı.
Kısmi bağlama ve nihayet tam bağlama kaybı vardı. Lütfen kan örneğini RBC lysis ile karıştırdığından emin olun. Ayrıca, yüzey marker boyama önce RBC lysis karıştırma bu yöntemin önemli bir adımdır.
Araştırmacı gelişmiş bir akış sitometri makinesine erişebiliyorsa, PD-1-bloke edici antikor-bağlı T-hücreleri, PD-1-bloke edici antikorların neden olduğu advers olaylardan sorumlu T-hücre fenotiplerinin profilini çıkarmak için bu stratejiye ilişkin daha fazla belirteçle değerlendirilebilir. Gelişmiş advers olayları olan hastalardan örnekleme bu stratejinin yarar değerlendirmek için önemlidir.
