The authors acknowledge Meike Schaffrinski for excellent technical assistance. We would like to thank the following people for their help in the collection of peripheral blood samples (all from University Medical Center G&#246;ttingen): Henrietta Vida (Dept. of Transfusion Medicine), Kia Homayounfar, Lena-Christin Conradi (Dept. of General, Visceral and Pediatric Surgery), Leila Siam, Bawarjan Schatlo (Dept. of Neurosurgery), Hendrik A. Wolff, Martin Canis (Dept. of Otorhinolaryngology, Head and Neck Surgery) as well as all employees of the interdisciplinary short-term oncology. We acknowledge Dirk Wenzel (Max Planck Institute for Biophysical Chemistry, G&#246;ttingen) for his help with the electron microscopy of MVs. 
The study was funded by the German Ministry of Education and Research (BMBF) project MetastaSys (grant no. 0316173) as well as the German Cancer Aid (grant no. 109615).

İnsan deneklerle dahil olmak üzere tüm deneyler yerel etik kurul (onay no. 3/2/14) tarafından onaylanmıştır. Hastaların seçimi için tür, yaş, cinsiyet, mevcut tedavi rejimleri ve bu nedenle kandaki OG bileşim etkilemek olabilir ve daha pek çok çeşitli faktörler toplama 22,23 örnek önceden dikkate alınması gerektiği not edilmelidir. Plazma örneklerinin hazırlanması 1. <ol><li> EDTA (1.6 mg / ml kan) içeren bir vacutainer kan toplama tüpüne 21-gauge kelebek iğne ile donör başına kan 2 tüpleri - 1 çizin. verimli kan antikoagülan garanti tüp (ler) birkaç kez ters emin olun. Not: - 15 ml daha sonra akış sitometrisi ve Western Blot analizi için kan önerilen hacmi 5&#39;tir. OG bozulmasını ve kaybını önlemek için, kan örnekleri 30 dakika kan kesildikten sonra &lt;ele alınmalıdır. </li><li> 1.200 x g&#39;de 15 dakika süre ile numuneler santrifüj ile plazma numunelerinin hazırlanmasıOda sıcaklığında (RT). </li><li> kan hücreleri (= alt tabaka) geri kalan plazma (= üst tabaka) ayrılmasını yardımcı olmak için bir valf filtre uygulanır. </li><li> 15 ml tüp içine plazma aktarın. </li><li> 1,500 x g&#39;de 15 dakika boyunca santrifüj, RT daha büyük hücre yıkıntıları pelet haline geri kalan trombositleri çıkarmak için. </li><li> 15 ml tüp içine süpernatant aktarın ve doğrudan -20 ° C&#39;de 6 aya kadar OG yalıtım veya mağaza örnekleri devam edin. NOT: Sunulan protokol, aynı zamanda, hücre kültür süpernatanlarından MVs (ve EXOS) izole etmek için kullanılabilir. 24 için% 80 birleşme - - bunun için, 60 hücrelerinin kültive vezikül tükenmiş FCS ile takviyeli kültür ortamında 48 saat, ve daha sonra supernatant toplamak. 750 x g&#39;de 5 dakika 4 ° C&#39;de santrifüj kalıntı kayan hücreleri tüketir büyük hücre yıkıntıları pelet haline getirildi 1500 x g&#39;de, 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca tekrar yeni bir 15 ml tüp ve santrifüj içine süpernatant doldurun. Bu yüzer madde daha sonra MVs izolasyonu için kullanılabilmektedir2.16 - Adım 2.1 açıklandığı gibi. </li></ol> MVS 2. izolasyonu <ol><li> uygun bir santrifüj tüpü içinde plazma örneği aktarın. Gerekirse, santrifüj işlemi sırasında ince duvarlı borular çöküşü numunenin seyreltilmesi ve önlemek amacıyla PBS ile tüp doldurun. </li><li> 14.000 x g&#39;de, 4 ° C&#39;de 35 dakika boyunca santrifüje. </li><li> Durusu süpernatant, tüpler ters döndü ve bir kağıt havlu üzerine koymak tutun. Kalan tüm yüzer havlu batırılmış ve bu şekilde örnek çıkarılana kadar 5 dakika - 3 bekleyin. </li><li> 1000 uL PBS MV pelletini, bir masa üstü santrifüjü içinde 14,000 x g&#39;de 4 ° C&#39;de 35 dakika boyunca 1.5 ml tüp ve santrifüj aktarın. </li><li> Süpernatant aspire. </li><li> pelet boyutuna bağlı olarak, 500 ul PBS - 50 MV pelletini. Seçenek olarak ise, RIPA tamponu içinde, örneğin, doğrudan lize MVs, (150 mM NaCI /% 0.1 SDS /% 0.5 Na-deoksikolat /% 1 Triton X-100/50 mM Tris, pH 7.2)daha sonra Western blot analizi için. -20 ° C&#39;de saklayın MVs. Onlar birkaç ay boyunca stabil kalır, ancak tekrarlanan donma-çözülme-döngüleri önlemek olacaktır. </li><li> İsteğe bağlı MV verim değerlendirmek ve daha sonraki deneyler için MVs dozlanması amacıyla bir protein tahlili ile OG protein konsantrasyonu (örneğin, Bradford ve Lowry metodu) belirler. </li><li> Ek Exos Plazma örneklerinden izole edilecekse, 110,000 x g&#39;de, 4 ° C&#39;de, 2 saat için bir ultra-santrifuj tüpü ve santrifüj içine adım 2.3 süpernatant süzün. Aşama 2.3&#39;te tarif edildiği gibi süpernatant tortusundan ayırma, 1000 uL PBS Exo pelet tekrar süspansiyon ve küçük (1.5 mL) ultrasantrifügasyon tüplere aktarın. <ol><li> 75 uL PBS veya RIPA tamponu - 50 110.000 x g&#39;de, 4 ° C&#39;de, aspirat süpernatan ve tekrar süspansiyon Ekzo pelet, 2 saat süre ile ultra santrifüj. </li></ol></li></ol> Akış Sitometrisi ile MVS 3. Karakterizasyonu <ol><li> Aktarım 15 uL PBS +% 1 vezikül tüketilmiş sığır fetüs serumu (Fbir akış sitometrisi tüp CS). Not: Vezikül tükenmiş FCS, daha önce, 24 tarif edilen şekilde 0.2 um&#39;lik bir filtre boyunca süpernatan 110,000 x g&#39;de 18 saat FCS (56 ° C&#39;de 30 dakika) ısı ile inaktive edilmiş santrifüj ve süzme yolu ile hazırlanır. </li><li> PBS içinde MVs (3 ug de geçerlidir düşük verim durumunda) 5 ug ekleyin. </li><li> OG yüzeyindeki spesifik olmayan bağlama merkezlerini bloke edebilir ve böylece arka plan boyama azaltmak için, oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inkübe edin. </li><li> Protein-faiz karşı floresan etiketli antikor ekleyin. düşük bir sinyal-gürültü oranı optimal konsantrasyonunu belirlemek ve garanti etmek amacıyla kullanılmadan önce Boyama için kullanılan antikor miktarının titre edilir. Ayrıca negatif kontrol olarak lekesiz MVS ile bir tüp ve (antikor 1 ug kullanılması durumunda, örneğin, aynı zamanda izotop kontrol An 1 mikrogram kullanımı aynı konsantrasyonda eşleşen izotip kontrol antikoru ile boyandı MVS bir tüp dahil emin oluntibody) arka plan boyama ölçmek için. Not: Bu farklı fluorochromes bağlanmış bir çok antikor eklenerek sitometri renkli akış gerçekleştirmek de mümkündür. </li><li> karanlıkta, oda sıcaklığında 20 dakika boyunca inkübe edin. </li><li> 250 uL PBS ilave edin ve bir akış sitometrisi kullanılarak numunenin ölçüm devam edin. <ol><li> halinde numuneleri hemen ölçülemez ki 4 ° C&#39;de örnekleri ve mağaza düzeltmek için 150 uL PBS ve 50 uL% 4 paraformaldehit (PFA) ekleyin. UYARI: PFA zehirlidir. eldiven ve uygun kişisel koruyucu ekipman kullanın. </li></ol></li><li> mümkün olan en düşük değere akış sitometresi eşiğini azaltın ve logaritmik ölçekte yan dağılım (SSC) arsa karşı ileri dağılım (FSC) kullanılarak OG nüfus arayın. OG nüfus Kapısı ve buna karşılık gelen bir histogram floresan sinyali değerlendirir. </li></ol> Western Blot tarafından MVS 4. Karakterizasyonu <ol><li> doğrudan MV peletUygun bir liziz tamponu (örneğin, RIPA tamponu). <ol><li> Uygun bir liziz tamponu (örneğin, RIPA tamponu) içinde 1: MV pelet daha önce PBS içinde yeniden süspansiyon haline getirilmiş edilmiş durumda, en az 1 seyreltin. </li></ol></li><li> Lowry testi ile OG numunenin protein konsantrasyonu, örneğin, belirleme. </li><li> 22.5 ul RIPA tamponunda MVS 20 ug - 10 hazırlayın. Daha sonra 95 ° C de 5 dakika boyunca 7.5 mL 4 x Laemmli yükleme tamponu ve ısıtılır. </li><li> bir poliakrilamit jeli üzerinde Numuneleri ve standart protokollere göre immunoblotting gerçekleştirin. </li><li> zarı üzerine proteinleri aktarıldıktan sonra, standart protokollere göre, bir yükleme kontrolü olarak bir Ponceau boyama yapar. </li><li> Oda sıcaklığında 5 dakika süreyle TBST içinde destain membran. </li><li> TBST içinde% 5 BSA, oda sıcaklığında en fazla 1 saat 30 dakika boyunca blok membran. </li><li> gece boyunca ya da oda sıcaklığında 2 saat boyunca 4 ° C &#39;de primer antikor ile membran inkübe edin. </li><li> TBST&#39;dir 3 x 5 dakika ile membran yıkayın.</li><li> 1 bir seyreltme HRP ile birleştirilmiş ikincil antikor ile membran inkübe: 10,000,% 5 BSA. Not: Yüksek plan sinyalleri durumunda yerine BSA süt tozu kullanımı. </li><li> TBST 3x 5 dakika ile membran yıkayın. </li><li> Bir ECL algılama reaktifi ile membran geliştirmek ve chemilüminesan film ya da bir kemilüminesans görüntüleme sistemi sinyalleri algılar. Not: EXOS gelen MVs ayırt etmek için, tubulin benzeri proteinler kullanılabilir 4-aktinin veya mitofilin esas MVs 16,25 mevcut olması gereken. EXOS için markerler olarak kullanılan en tetraspanin antikorları (örneğin, CD9, CD81), indirgeyici koşullar altında çalışmaz ve bu nedenle 70 ° C &#39;de 10 dakika süre ile ısıtıldı, ardından indirgeyici olmayan yükleme tamponunda hazırlanmalıdır dikkat ediniz. </li></ol>

<ol>
	<li>Raposo, G., Stoorvogel, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles:+Exosomes,+microvesicles,+and+friends.">Extracellular vesicles: Exosomes, microvesicles, and friends.</a> J Cell Biol. 200 (4), 373-383 (2013).</li><li>Y&#225;&#241;ez-M&#243;, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+properties+of+extracellular+vesicles+and+their+physiological+functions.">Biological properties of extracellular vesicles and their physiological functions.</a> J Extracell Vesicles. 4, (2015).</li><li>Guescini, M., Genedani, S., Stocchi, V., Agnati, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytes+and+Glioblastoma+cells+release+exosomes+carrying+mtDNA.">Astrocytes and Glioblastoma cells release exosomes carrying mtDNA.</a> J Neural Transm (Vienna). 117 (1), 1-4 (2010).</li><li>Balaj, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour+microvesicles+contain+retrotransposon+elements+and+amplified+oncogene+sequences.">Tumour microvesicles contain retrotransposon elements and amplified oncogene sequences.</a> Nat Commun. 2, 180 (2011).</li><li>Lee, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncogenic+ras-driven+cancer+cell+vesiculation+leads+to+emission+of+double-stranded+DNA+capable+of+interacting+with+target+cells.">Oncogenic ras-driven cancer cell vesiculation leads to emission of double-stranded DNA capable of interacting with target cells.</a> Biochem Biophys Res Commun. 451 (2), 295-301 (2014).</li><li>Chi, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tumour+trail+left+in+blood.">The tumour trail left in blood.</a> Nature. 532 (7598), 269-271 (2016).</li><li>Pisitkun, T., Shen, R. -. F., Knepper, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+proteomic+profiling+of+exosomes+in+human+urine.">Identification and proteomic profiling of exosomes in human urine.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 101 (36), 13368-13373 (2004).</li><li>Harrington, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+morphology+and+biochemistry+of+nanostructures+provide+evidence+for+synthesis+and+signaling+functions+in+human+cerebrospinal+fluid.">The morphology and biochemistry of nanostructures provide evidence for synthesis and signaling functions in human cerebrospinal fluid.</a> Cerebrospinal Fluid Res. 6, 10 (2009).</li><li>Admyre, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+with+Immune+Modulatory+Features+Are+Present+in+Human+Breast+Milk.">Exosomes with Immune Modulatory Features Are Present in Human Breast Milk.</a> J Immunol. 179 (3), 1969-1978 (2007).</li><li>Caby, M. -. P., Lankar, D., Vincendeau-Scherrer, C., Raposo, G., Bonnerot, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomal-like+vesicles+are+present+in+human+blood+plasma.">Exosomal-like vesicles are present in human blood plasma.</a> Int Immunol. 17 (7), 879-887 (2005).</li><li>Nieuwland, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+origin+and+procoagulant+properties+of+microparticles+in+meningococcal+sepsis.">Cellular origin and procoagulant properties of microparticles in meningococcal sepsis.</a> Blood. 95 (3), 930-935 (2000).</li><li>Mfonkeu, J. B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+Cell-Specific+Microparticles+Are+a+Biological+Marker+for+Cerebral+Dysfunctions+in+Human+Severe+Malaria.">Elevated Cell-Specific Microparticles Are a Biological Marker for Cerebral Dysfunctions in Human Severe Malaria.</a> PLoS One. 5 (10), e13415 (2010).</li><li>Parker, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppression+of+inflammation+reduces+endothelial+microparticles+in+active+systemic+lupus+erythematosus.">Suppression of inflammation reduces endothelial microparticles in active systemic lupus erythematosus.</a> Ann Rheum Dis. 73 (6), 1144-1150 (2014).</li><li>Nozaki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prognostic+value+of+endothelial+microparticles+in+patients+with+heart+failure.">Prognostic value of endothelial microparticles in patients with heart failure.</a> Eur J Heart Fail. 12 (11), 1223-1228 (2010).</li><li>Galindo-Hernandez, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+concentration+of+microvesicles+isolated+from+peripheral+blood+in+breast+cancer+patients.">Elevated concentration of microvesicles isolated from peripheral blood in breast cancer patients.</a> Arch Med Res. 44 (3), 208-214 (2013).</li><li>Menck, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-derived+microvesicles+mediate+human+breast+cancer+invasion+through+differentially+glycosylated+EMMPRIN.">Tumor-derived microvesicles mediate human breast cancer invasion through differentially glycosylated EMMPRIN.</a> J Mol Cell Biol. 7 (2), 143-153 (2015).</li><li>Moon, P. -. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Developmental+Endothelial+Locus-1+on+Circulating+Extracellular+Vesicles+as+a+Novel+Biomarker+for+Early+Breast+Cancer+Detection.">Identification of Developmental Endothelial Locus-1 on Circulating Extracellular Vesicles as a Novel Biomarker for Early Breast Cancer Detection.</a> Clin Cancer Res. 22 (7), 1757-1766 (2016).</li><li>Melo, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glypican-1+identifies+cancer+exosomes+and+detects+early+pancreatic+cancer.">Glypican-1 identifies cancer exosomes and detects early pancreatic cancer.</a> Nature. 523 (7559), 177-182 (2015).</li><li>Kahlert, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Double-stranded+Genomic+DNA+Spanning+All+Chromosomes+with+Mutated+KRAS+and+p53+DNA+in+the+Serum+Exosomes+of+Patients+with+Pancreatic+Cancer.">Identification of Double-stranded Genomic DNA Spanning All Chromosomes with Mutated KRAS and p53 DNA in the Serum Exosomes of Patients with Pancreatic Cancer.</a> J Biol Chem. 289 (7), 3869-3875 (2014).</li><li>Shao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+typing+of+circulating+microvesicles+allows+real-time+monitoring+of+glioblastoma+therapy.">Protein typing of circulating microvesicles allows real-time monitoring of glioblastoma therapy.</a> Nat Med. 18 (12), 1835-1840 (2012).</li><li>L&#228;sser, C., Eldh, M., L&#246;tvall, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Characterization+of+RNA-Containing+Exosomes.">Isolation and Characterization of RNA-Containing Exosomes.</a> J Vis Exp. (59), (2012).</li><li>Witwer, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardization+of+sample+collection,+isolation+and+analysis+methods+in+extracellular+vesicle+research.">Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research.</a> J Extracell Vesicles. 2, (2013).</li><li>Gustafson, C. M., Shepherd, A. J., Miller, V. M., Jayachandran, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-+and+sex-specific+differences+in+blood-borne+microvesicles+from+apparently+healthy+humans.">Age- and sex-specific differences in blood-borne microvesicles from apparently healthy humans.</a> Biol Sex Differ. 6, (2015).</li><li>Shelke, G. V., L&#228;sser, C., Gho, Y. S., L&#246;tvall, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Importance+of+exosome+depletion+protocols+to+eliminate+functional+and+RNA-containing+extracellular+vesicles+from+fetal+bovine+serum.">Importance of exosome depletion protocols to eliminate functional and RNA-containing extracellular vesicles from fetal bovine serum.</a> J Extracell Vesicles. 3, (2014).</li><li>Kowal, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+comparison+defines+novel+markers+to+characterize+heterogeneous+populations+of+extracellular+vesicle+subtypes.">Proteomic comparison defines novel markers to characterize heterogeneous populations of extracellular vesicle subtypes.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 113 (8), E968-E977 (2016).</li><li>Dignat-George, F., Boulanger, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Many+Faces+of+Endothelial+Microparticles.">The Many Faces of Endothelial Microparticles.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 31 (1), 27-33 (2011).</li><li>Esser, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+Incorporation+of+CD45,+CD80+(B7-1),+CD86+(B7-2),+and+Major+Histocompatibility+Complex+Class+I+and+II+Molecules+into+Human+Immunodeficiency+Virus+Type+1+Virions+and+Microvesicles:+Implications+for+Viral+Pathogenesis+and+Immune+Regulation.">Differential Incorporation of CD45, CD80 (B7-1), CD86 (B7-2), and Major Histocompatibility Complex Class I and II Molecules into Human Immunodeficiency Virus Type 1 Virions and Microvesicles: Implications for Viral Pathogenesis and Immune Regulation.</a> J Virol. 75 (13), 6173-6182 (2001).</li><li>Canellini, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Red+blood+cell+microparticles+and+blood+group+antigens:+an+analysis+by+flow+cytometry.">Red blood cell microparticles and blood group antigens: an analysis by flow cytometry.</a> Blood Transfus. 10 (2), s39-s45 (2012).</li><li>Scholz, T., Temmler, U., Krause, S., Heptinstall, S., L&#246;sche, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfer+of+tissue+factor+from+platelets+to+monocytes:+role+of+platelet-derived+microvesicles+and+CD62P.">Transfer of tissue factor from platelets to monocytes: role of platelet-derived microvesicles and CD62P.</a> Thromb Haemost. 88 (6), 1033-1038 (2002).</li><li>Berckmans, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-derived+microparticles+circulate+in+healthy+humans+and+support+low+grade+thrombin+generation.">Cell-derived microparticles circulate in healthy humans and support low grade thrombin generation.</a> Thromb Haemost. 85 (4), 639-646 (2001).</li><li>Rupp, A. -. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+EpCAM+expression+in+breast+cancer+derived+serum+exosomes:+role+of+proteolytic+cleavage.">Loss of EpCAM expression in breast cancer derived serum exosomes: role of proteolytic cleavage.</a> Gynecol Oncol. 122 (2), 437-446 (2011).</li><li>Taylor, D. D., Gercel-Taylor, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+signatures+of+tumor-derived+exosomes+as+diagnostic+biomarkers+of+ovarian+cancer.">MicroRNA signatures of tumor-derived exosomes as diagnostic biomarkers of ovarian cancer.</a> Gynecol Oncol. 110 (1), 13-21 (2008).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

<html> Kandaki EVs üzerinde son çalışmalar, EV kompozisyon ve sayımlar çeşitli hastalıkların nedeni sırasında değişiklik olduğunu göstermiştir. Bu nedenle, bu AGH analizi ve ileri karakterizasyon daha fazla teşhis ve prognoz için hastalık biyobelirteçlerinin olarak potansiyel kullanımını değerlendirmek ya da tedavi yanıtları değerlendirmek için yüksek ilgi görmektedir. Burada mevcut protokol herhangi bir hücre organellerini içermeyen 600 nm çapında veziküllerin izolasyonu sağlar. Bu gözlemler MVS güncel bir tanımlama ile uyumlu ve apoptotik cisimlerin 2 varlığını dışlamak. genellikle Ekzo belirteç olarak kullanılan tetraspanins CD9 ve CD81 sadece biraz ifade edildi Western Blot kullanarak, izole edilmiş MVs tubulin yüksek ifade gösterdiği göstermek mümkün oldu. Bu MVs Exos farklı olduğunu teyit ve proteomik 25 tarafından son derinlemesine karakterizasyonu ve hem EV popülasyonlarının karşılaştırmak için uyuyor. Kan örneklerinin elde edilmesi sırasında içeriği &quot;&gt;, MV bozunmasını önlemek için, kısa sürede damar delinerek ve plazma hazırlama arasındaki zaman kalması açısından çok önemlidir. Ayrıca, kan örneklerinin uzun süreli depolama geliştirilmiş MV neden kan hücrelerinin aktivasyonuna yol açabilir sonuçta apoptotik cisimlerin salınımına neden apoptoz dökülme ve. OG izolasyonu için bir başka önemli husus nedenle, aşağı iplik sonra mümkün olduğunca süpernatant kadar çok kaldırmak için kritik öneme sahiptir. plazma proteinlerine veya daha küçük Exos MV hazırlıkları kirletmesini önlemek için topak, normal olarak görünür ve sıkı bir şekilde borunun duvara bağlı olduğu 14,000 x g&#39;de MVs., süpernatan kolay bir pipet ucu ile temizlenebilir. EXOS aksine yüksek hızlı ultra-santrifüj tarafından hazırlanması sırasında agregatlar oluşturması için eğilimi olan genellikle tekrar süspansiyon zor bu sorun MVs oluşmaz. Çalışmamız bu Possi olduğunu gösterirflow sitometri ile kanda bulunan OG subpopülasyonunun karakterize etmek için ble. En akış sitometrelerinde tespit limiti yaklaşık 200 olmasına rağmen - 300 nm, MVs tekrarlanabilir açıkça arka plan sinyallerinden kendi ayrım izin Aynı analiz parametreleri ve kapıları ile donör yanı sıra hücre kültürü örneklerinde ölçüldü. PBS akış sitometrisi (Şekil 3) sırasında yüksek bir arka plan neden olabilecek herhangi bir kirletici partiküller ihtiva etmez analizler için kullanılan ölçümlerinden önce kontrol edilmesi önemlidir. Bazı küçük MVs bir akış sitometri yaklaşımla ele olmayabilir rağmen, tüm büyük kan hücre popülasyonlarının (örneğin, trombositler, kırmızı kan hücreleri, lökositler, endotel hücreleri) MVS tespit edildi. 29 - Bizim analizlerde daha önce MVS 26 bulunmuştur farklı kan hücreleri için standart belirteçler kullanılır. Belirtilmelidir ki t akış sitometrisi ile mümkün olan en iyi sonuçları elde etmek içinO miktar ve antikor konsantrasyonu, söz konusu antijeni ifade eden bir MV numune üzerinde titre edilmelidir. Kanda spesifik MV alt popülasyonlar daha yüksek özgüllük ile tespit edilir ise, ilgili MVS iki farklı antijenlerin karşı çifte boyama gerçekleştirmek ve sonraki 23 analizleri için yalnızca tüm çift pozitif MVS dikkate almak mümkündür. Şu anda, sağlıklı bireylerin 23,30 kanında MV alt popülasyonlar standart bir dizi tanımlamak için çabalar vardır. Bu çalışmalar, daha önce trombosit türevli MVs gözlemlerimiz ile uyumlu olarak bir kan MVs büyük nüfus oluşturmaktadır göstermiştir. OG örnekleri karakterize etmek flow sitometri bir avantajı, bu yöntem zaten iyi günlük klinik teşhis biyomarkırların olarak MVs olası kullanımını sağlayacak birçok klinik merkezlerinde tanı amaçlı kurulmuş olmasıdır. çoğunlukla odak kandaki EVs önceki çalışmalarküçük Exos üzerinde ed, seçici istenen Exo hedef nüfusu 31,32 analiz özel sıralama prosedürleri ya güvenmek ya da analiz 18 öncesinde boncuk Latexe Exos birleştirilmesi ile zaman alıcı (2 gün) izolasyon süreci gerektirir. Kendi yayınlanmamış gözlemler tam kan hazırlıkları MVS akım sitometri analizi bile böyle böyle bir seçim süreçleri olmadan tümör kaynaklı MVS olarak MVS algılanmasını sağlar düşündürmektedir. Burada sunulan protokol standardı laboratuar ekipmanları ile periferik kan örneklerinden MVs hızlı izolasyonuna izin verir ve onların sonraki karakterizasyonu akım sitometri ve Western Blot kullanarak, birlikte ele alındığında. Bütün bu süreç hastalık biyobelirteçlerinin olarak MVs potansiyelini değerlendirmek için gerekli olan hastaların kanındaki OG profilleri gelecek çalışmalara kolaylaştıracaktır yaklaşık 2 saat içinde yapılabilir.

Son yıllarda in vitro çalışmalar, birçok hücre dışı veziküller (EVS) arası iletişimde önemli bir rol oynadığını göstermiştir. Yaşayan hücreler sürekli boyut, içerik ve biyogenezine farklılık kesecikler döken. En iyi çalışılan AGH onlar multiveziküler organları intraluminal kesecikler olarak depolandığı endozomal sisteminden kaynaklanan eksozomlar vardır. Plazma zarı ile ikinci sigorta kez içeriyordu veziküller Eksozomlann olarak yayımlanan (Exos, çap 30-100 nm 1). Plazma zarı 2 doğrudan kapalı tomurcuk - Son yıllarda artan ilgisini topladı EV ikinci nüfus büyük microvesicles (1000 nm MVs, çapı 100) vardır. 5, ve komşu C transfer proteinlerin bir bolluk - veziküllerinin her iki tipi, örneğin, DNA, mRNA veya miRNA 3, bir lipid iki katmanının ile çevrilidir ve nükleik asitleri içerirlerarşın. Genel olarak veziküllerin protein bileşimi kökenli hücrenin durumunu yansıtırken, bazı proteinler seçici hedef ve AGH 1 zenginleştirilmiş gibi görünüyor. Bir önemli araştırma ilgi roman biyomarkırların olarak AGH kullanımına izin verebilir belirli EV imzaları belirlemek amacıyla anormal ve hastalıklı hücrelerden AGH karakterize etmektir. Özellikle tümörün kendisi kolayca erişilebilir olmadığı kanser, içinde, kanda tümör spesifik AGH hedefleyen sıvı biyopsi tedavi yanıtları izlenmesine olanak veya invaziv işlemler 6 gerek kalmadan primer tümör karakterize yardımcı olabilir. Gerçekten de EVS başarıyla idrar 7, CSF 8, anne sütü 9 ya da kan 10 de dahil olmak üzere, çeşitli vücut sıvılarından izole edilmiştir. Çeşitli çalışmalarda, farklı insan hastalıklarında EV sayılarında değişiklik ve kompozisyon belirledi. Örneğin, sepsis hastalarında ön pıhtılaştırma MVs sayısıdırönemli ölçüde sağlıklı bireylerin 11 oranla artmıştır. Ayrıca şiddetli serebral sıtma olan hastalarda kandaki toplam MVS bir artış görülebilir ve trombosit kaynaklı MVS sayıları koma derinliği ve trombositopeni 12 ile ilişkilidir. Diğer çalışmalar bu kardiyovasküler olaylar 13,14 daha yüksek bir olasılık ile ilişkilidir, sistemik lupus eritematozus veya kalp yetmezliği olan hastalarda ve ikincisi durumunda endotel kökenli veziküllerin yüksek sayıda rapor. Özellikle kanser, kandaki AGH halen tanısal ve prognostik değeri olan yeni biyomarkerların olarak tartışılmaktadır. Bu MUC1, EGFR veya FAK tümör-ilişkili proteinler eksprese MVs seviyeleri meme kanserli hastaların 15,16 kanında yükselmiş olarak görülmektedir. Ayrıca EXOS için son zamanlarda yapılan çalışmalar gibi glipikan-1 erken hastalık DE izin göğüs kanseri için pankreas kanseri veya del-1 için olduğu gibi, tümör spesifik antijenler taşıyan kan türevi EXOS göstermiştiryüksek özgüllük ve duyarlılık 17,18 ile koruması. Buna ek olarak, serum kaynaklı tümör Exos gibi Kras ve tedavi tahmini 19 için kullanımlarını göstermektedir p53 gibi mutasyonların saptanması için kullanılabilir DNA içerebilir. Son gelişmeler, belirli bir mikroakışkan çip ile glioblastoma hastaların kanında EXOS bu analiz tedavisi 20 izlenmesine olanak sağlar göstermiştir. Birlikte ele alındığında, bu bulgular veziküllerin hastalığa özgü alt popülasyonlar analizi tanı, prognoz yanı sıra tedavi seçenekleri ve başarı hakkında değerli bilgiler verir ima. Bununla birlikte, kan EXOS izolasyonu ve analizi, zaman alıcıdır, özel laboratuar ekipmanları gerektirir ve bu nedenle henüz rutin klinik teşhis için uygun değildir. Bunun aksine, MVs bu EXOS 18 için gerekli olan sitometri lateks boncuk çift bunları gerek kalmadan kolayca akış sitometrisi ile analiz edilebilir nedeniyle büyük bir boyuta, çok daha hızlı biçimde izole edilebilir ve21. Bu nedenle, burada kan örneklerinden MVs standartlaştırılmış izolasyonu ve akış sitometrisi ile OG altgrupları müteakip özellik tayini için kullanılabilecek bir protokol mevcut. Bu protokol, daha fazla çalışma ve günlük klinik teşhis için MVS kullanmak için gerekli olacak büyük hasta gruplarında OG profilleri derinliği karakterizasyonu sağlayacaktır.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>butterfly needle (21 gauge)</td>
			<td>Hospira Deutschland GmbH</td>
			<td>490P29201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin Fraction V</td>
			<td>Roth</td>
			<td>8076.3</td>
			<td>For 10x TBS weigh 24.2 g Tris base and 80 g NaCl, ad 1 L H2O and adjust pH to 7.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For 1x TBS-T mix 100 mL 10x TBS with 900 mL H2O and add 1 mL Tween-20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD235a-PE</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A07792</td>
			<td>use 5&#181;l for staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45-FITC</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>7782</td>
			<td>use 5&#181;l for staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD62E-PE</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>336008</td>
			<td>use 0.8&#181;g for staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD62P-PE</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>304905</td>
			<td>use 0.1&#181;g for staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD81 antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>349501</td>
			<td>1:2000 in 5%BSA in TBS-T; use non-reducing conditions for Western Blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD9 antibody</td>
			<td>Immunotools</td>
			<td>21270091</td>
			<td>1:1000 in 5%BSA in TBS-T; use non-reducing conditions for Western Blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemiluminescence imager ImageQuant LAS-4000</td>
			<td>Fujitsu Life Sciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DC protein assay kit II</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>5000112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL detection reagent</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>RPN2232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA vacutainers for blood collection</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>01.1605.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSCanto II</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal calf serum (FCS)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10091148</td>
			<td>heat-inactivated (30 min, 56&#176;C)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>filter 0.22&#181;m</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.1826.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HRP-coupled anti-mouse secondary antibody</td>
			<td>santa cruz</td>
			<td>sc-2005</td>
			<td>use 1:10,000 in 5% milk powder in TBS-T</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HRP-coupled anti-rabbit secondary antibody</td>
			<td>santa cruz</td>
			<td>sc-2004</td>
			<td>use 1:10,000 in 5% milk powder in TBS-T</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4x Laemmli loading buffer, Roti-Load 1</td>
			<td>Roth</td>
			<td>K929.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microfuge SIGMA 1-15K</td>
			<td>Sigma Laborzentrifugen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>milk powder (Blotting-Grade Blocker, nonfat dry milk)</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>170-6404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>multifuge 3 L-R</td>
			<td>Heraeus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoSight LM10</td>
			<td>NanoSight Ltd.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, w/o Ca and Mg</td>
			<td>Pan biotech</td>
			<td>P04-36500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>perfusor syringe 50 mL</td>
			<td>Braun</td>
			<td>8728844F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ponceau-S staining solution</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>A2935,0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rotor Sw32.1 Ti for ultracentrifugation (6x 17 mL)</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rotor TLA-120.2 for ultracentrifugation (10x 1.5 mL)</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tubes for flow cytometry (5 mL, round-bottom)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tubes for ultracentrifugation (15 mL)</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>344061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tubes for ultracentrifugation (11* 34 mm)</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>343778</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubulin antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>05-829</td>
			<td>1:5000 in 5%BSA in TBST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ultracentrifuge Optima L-80 XP</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ultracentrifuge TL-100</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>valve filter Seraplas V15</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>53,428</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and characterization of microvesicles from peripheral blood

küçük endozomal türetilmiş Eksozomlann (Exos, çap &lt;100 nm) ve büyük plazma zarı kaynaklı microvesicles (MVs, çap&gt; 100 nm) dahil dışı veziküller (AGH) serbest bırakılması bütün canlı hücrelerde meydana temel hücresel bir süreçtir. Geldikleri hücre için ve in vitro çalışmalar belirli Bu veziküller taşıyıcı proteinler, lipidler ve nükleik asitler arası iletişimin arabulucu olarak önemlerini sermiştir. EVs başarıyla çeşitli vücut sıvılarından izole edilmiştir ve kan, özellikle EVs kanser veya bulaşıcı hastalıklar için biyolojik sözü olarak tespit edilmiştir. Kandaki MV alt popülasyonlarının çalışma imkan vermek üzere, periferik kan örneklerinden MVs standartlaştırılmış izolasyonu ve karakterizasyonu için bir protokol mevcut. MVs diferansiyel santrifüjleme ile EDTA antikoagüle Plazma örneklerinden topak haline getirildi ve tipik olarak 100 bir çapa sahip olan - 600 nm. Nedeniyle büyük bir boyuta, onlarKolayca flow sitometri, rutin klinik teşhis kullanılan ve en laboratuvarlarda mevcut olan bir teknikle incelenecektir. İzole MVs kalite kontrol testleri için birkaç örnek verilecektir ve kan farklı OG alt toplulukların ayrımı için kullanılabilen işaretleyiciler sunulacaktır.

tarif edilen protokol takip izole edilebilir MVs verimini ölçmek amacıyla, 10 donörlerin kan numunelerinden izole MVs miktarı hesaplanmıştır. Bir Lowry protein deneyinde değerlendirildi OG verim mL kan için 19.2 ug MVs (Tablo 1) &#39;in bir ortalama ug ila 30 kadar, 10 arasında değişmektedir. Nanoparçacık izleme analizi (NTA) ile tespit edilen partikül konsantrasyonu, 1.66 x 10 9&#39;dan ml plazma, numune başına 5.9 x 10 9 parçacıklar (Tablo 2), ortalama 2.36 x 10 ila 10 arasında değişmektedir. Transmisyon elektron mikroskobu ile MVs ileri karakterizasyonu bir lipit çift katmanı ile çevrili ve herhangi bir hücre organelleri (Şekil 1A) içermeyen bir çapı&gt; 100 nm olan veziküller nüfusu ortaya koymuştur. NTA izole MVs büyüklüğü 600 nm (Şekil 1 b) ve ortalama OG boyutuna kadar 100 arasında değişmektedir doğruladı 201 idimil (Şekil 1C). Western Blot tarafından tipik OG ve Exo belirteçleri için boyama izole MVs tubulin pozitif ve Exos tubulin negatif ve BS9 ve CD81 (Şekil 2) zenginleştirilmiş ise sadece, BS9 ve CD81 hafif bir ifade gösterdi olduğunu gösterdi. Akış sitometrisi (Şekil 3A) izole MVs analizi, normal olarak hücre kültür süpernatanlarından izole MVs için kullanılan ile aynı parametreler kullanılarak kapı olabilir tanımlanmış bir vezikül popülasyonu ortaya ve PBS ölçümü ile elde edilen arka plan sinyali açıkça farklıdır + % 1 MVs (Şekil 3B) ilavesi olmaksızın FCS veziküller tükenmiş. Kanda mevcut farklı OG popülasyonları analiz etmek için, MVs ör CD62P, trombosit türevli MVS, CD45 lökosit-türevi MVS, CD235a, farklı kan hücre popülasyonları için kurulan işaretleri ile boyandıKırmızı kan endotel hücre-türevli MVs (Şekil 4) MVs ve CD62E hücre kökenli. Bu nitelendirme MVs çoğunluğu tüm örneklerde trombositler tarafından döken gibiydi iken OG alt popülasyonlar yüzdesi araştırılmıştır donör kan örnekleri arasında farklılık göstermiştir. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/55057/55057fig1.jpg" /> Şekil 1: periferik kandan izole MVs boyutları dağılımı. A, izole edilmiş MVs transmisyon elektron mikroskobu ile görülür hale getirilirler. B, veziküllerin boyut dağılımına gösteren MVs temsili nanopartikül izleme analizi (NTA). C, 10 bağımsız hazırlıkları ortalama MV boyutu NTA (ortalama) ile ölçüldü. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55057/55057fig1large.jpg" target="_blank">Al görmek için buraya tıklayınız</a>Bu rakamın Arger sürümü. <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/55057/55057fig2.jpg" /> Şekil 2: Western Blot ile izole edilmiş MVs karakterizasyonu. İki vericilerden izole MVs ve EXOS Diferansiyel Protein ifadesi, western lekeleme ile görselleştirildi. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55057/55057fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/55057/55057fig3.jpg" /> Şekil 3: Akış Sitometrisi ile MVS analizi. A, MVs ilk ilgili OG nüfus kapısına sidescatter (SSC) araziler karşı ileri (FSC) görsel edilir. Daha sonra, bu MVs ilgili antijen tarafından karakterize edilir<html> antijene karşı floresan etiketli antikorlar kullanılarak. B, iki donörlerin plazmadan izole MVS SSC araziler karşı Tipik FSC. Karşılaştırma olarak, sadece PBS +% 1 vezikül tükenmiş MVs olmayan FCS kullanarak hücre kültürü üstte yüzen hem de bir negatif kontrol izole A549 akciğer kanseri hücreleri, tümör hücresi türevli MVs için tipik bir arsa sağ tarafta gösterilmiştir. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55057/55057fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/55057/55057fig4.jpg" /> Şekil 4: Akış Sitometrisi ile İzole MVS karakterizasyonu. Üç vericiden MVs akış sitometrisi ile oluşturulan kan hücre belirteçleri (kırmızı) ekspresyonu için karakterize edilmiştir. İlgili izotip kontrolleri gri renkle gösterilir.http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55057/55057fig4large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Örnek </td><td> MVs / ml kan [ug] </td></tr><tr><td> 1. </td><td> 29.4 </td></tr><tr><td> 2. </td><td> 10.3 </td></tr><tr><td> 3. </td><td> 15.2 </td></tr><tr><td> 4. </td><td> 31.1 </td></tr><tr><td> 5. </td><td> 18.8 </td></tr><tr><td> 6. </td><td> 22.7 </td></tr><tr><td> 7. </td><td> 19.1 </td></tr><tr><td> 8. </td><td> 18.7 </td></tr><tr><td> 9. </td><td> 15.0 </td></tr><tr><td> 10. </td><td> 11.9 </td></tr></tbody></table> Tablo 1: Periferik Kan Örneklerinden OG Protein Verimi. </strong&gt; Gösterilen 10 donörlerden alınan mL periferik kandan başına MVS miktarıdır. OG verimleri Lowry testi ile ölçülmüştür. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Örnek </td><td> MVs / ml plazma [partikül sayımı] </td></tr><tr><td> 1. </td><td> 6.42E + 09 </td></tr><tr><td> 2. </td><td> 2.36E + 10 </td></tr><tr><td> 3. </td><td> 1.88E + 09 </td></tr><tr><td> 4. </td><td> 6.51E + 09 </td></tr><tr><td> 5. </td><td> 3.48E + 09 </td></tr><tr><td> 6. </td><td> 4.57E + 09 </td></tr><tr><td> 7. </td><td> 2.09E + 09 </td></tr><tr><td> 8. </td><td> 1.66E + 09 </td></tr><tr><td> 9. </td><td> 2.54E + 09 </td></tr><tr><td> 10. </td><td> 6.20E + 09 </td></tr></tbody></table> Tablo 2: Periferik Kan Örneklerinden MV Parçacık Verim. </stRong&gt; MV 10 donörler ve partikül sayımları nanoparçacık izleme analizi ile belirlendi plazma örneklerinden izole edilmiştir. Üç bağımsız ölçümün ima edilen bir değerdir gösterilmiştir.

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Characterization of Microvesicles from Peripheral Blood at JoVE.com

Isolation and Characterization of Microvesicles from Peripheral Blood

Extracellular vesicles present in blood have been suggested as novel biomarkers for various diseases. Here, we present a protocol for the isolation of large plasma membrane-derived microvesicles from peripheral blood samples and their subsequent analysis by conventional flow cytometry and Western Blotting.

Periferik kan Microvesicles izolasyonu ve özelliklerinin belirlenmesi

The release of extracellular vesicles (EVs) including small endosomal-derived exosomes (Exos, diameter &#60; 100 nm) and large plasma membrane-derived ...

isolation-and-characterization-of-microvesicles-from-peripheral-blood

Research

JoVE Journal

Biology

22.9K Görüntüleme.  University Medical Center Göttingen. Extracellular vesicles present in blood have been suggested as novel biomarkers for various diseases. Here, we present a protocol for the isolation of large plasma membrane-derived microvesicles from peripheral blood samples and their subsequent analysis by conventional flow cytometry and Western Blotting. 

Video: Isolation and Characterization of Microvesicles from Peripheral Blood

Isolation and Culture of Pulmonary Endothelial Cells from Neonatal Mice

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) have shown to be convenient, easy to obtain and culture, and thus are the most widely studied endothelial cells. However, for research focused on processes like angiogenesis, permeability or many others, microvascular endothelial cells (ECs) are a much more physiologically relevant model to study 2. Furthermore, ECs isolated from knockout mice provide a useful tool for analysis of protein function ex vivo. Several approaches to isolate and culture microvascular ECs of different origin have been reported to date 3-7, but consistent isolation and culture of pure ECs is still a major technical problem in many laboratories. Here, we provide a step-by-step protocol on a reliable and relatively simple method of isolating and culturing mouse lung endothelial cells (MLECs). In this approach, lung tissue obtained from 6- to 8-day old pups is first cut into pieces, digested with collagenase/dispase (C/D) solution and dispersed mechanically into single-cell suspension. MLECS are purified from cell suspension using positive selection with anti-PECAM-1 antibody conjugated to Dynabeads using a Magnetic Particle Concentrator (MPC). Such purified cells are cultured on gelatin-coated tissue culture (TC) dishes until they become confluent. At that point, cells are further purified using Dynabeads coupled to anti-ICAM-2 antibody. MLECs obtained with this protocol exhibit a cobblestone phenotype, as visualized by phase-contrast light microscopy, and their endothelial phenotype has been confirmed using FACS analysis with anti-VE-cadherin 8 and anti-VEGFR2 9 antibodies and immunofluorescent staining of VE-cadherin. In our hands, this two-step isolation procedure consistently and reliably yields a pure population of MLECs, which can be further cultured. This method will enable researchers to take advantage of the growing number of knockout and transgenic mice to directly correlate in vivo studies with results of in vitro experiments performed on isolated MLECs and thus help to reveal molecular mechanisms of vascular phenotypes observed in vivo.

Here, we describe a protocol for isolation and culture of murine pulmonary endothelial cells. This method comprises mechanic and enzymatic lung tissue dissociation as well as a 2-step purification process using anti-PECAM-1 and anti-ICAM-2 antibodies conjugated to magnetic beads, which produces a pure endothelial cell population of mostly microvascular origin.

Yenidoğan Fareler Pulmoner Endotel Hücreleri İzolasyon ve Kültür

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells ...

Biyoloji

Isolation and Characterization of RNA-Containing Exosomes

The field of exosome research is rapidly expanding, with a dramatic increase in publications in recent years. These small vesicles (30-100 nm) of endocytic origin were first proposed to function as a way for reticulocytes to eradicate the transferrin receptor while maturing into erythrocytes1, and were later named exosomes. Exosomes are formed by inward budding of late endosomes, producing multivesicular bodies (MVBs), and are released into the environment by fusion of the MVBs with the plasma membrane2. Since the first discovery of exosomes, a wide range of cells have been shown to release these vesicles. Exosomes have also been detected in several biological fluids, including plasma, nasal lavage fluid, saliva and breast milk3-6. Furthermore, it has been demonstrated that the content and function of exosomes depends on the originating cell and the conditions under which they are produced. A variety of functions have been demonstrated for exosomes, such as induction of tolerance against allergen7,8, eradication of established tumors in mice9, inhibition and activation of natural killer cells10-12, promotion of differentiation into T regulatory cells13, stimulation of T cell proliferation14 and induction of T cell apoptosis15. Year 2007 we demonstrated that exosomes released from mast cells contain messenger RNA (mRNA) and microRNA (miRNA), and that the RNA can be shuttled from one cell to another via exosomes. In the recipient cells, the mRNA shuttled by exosomes was shown to be translated into protein, suggesting a regulatory function of the transferred RNA16. Further, we have also shown that exosomes derived from cells grown under oxidative stress can induce tolerance against further stress in recipient cells and thus suggest a biological function of the exosomal shuttle RNA17. Cell culture media and biological fluids contain a mixture of vesicles and shed fragments. A high quality isolation method for exosomes, followed by characterization and identification of the exosomes and their content, is therefore crucial to distinguish exosomes from other vesicles and particles. Here, we present a method for the isolation of exosomes from both cell culture medium and body fluids. This isolation method is based on repeated centrifugation and filtration steps, followed by a final ultracentrifugation step in which the exosomes are pelleted. Important methods to identify the exosomes and characterize the exosomal morphology and protein content are highlighted, including electron microscopy, flow cytometry and Western blot. The purification of the total exosomal RNA is based on spin column chromatography and the exosomal RNA yield and size distribution is analyzed using a Bioanalyzer.

This paper demonstrates methods for the isolation, purification and detection of exosomes, as well as techniques for analysis of their molecular content. These methods are adaptable for exosome isolation from both cell culture media and biological fluids, and can beyond analysis of molecular content also be useful in functional studies.

RNA İçeren Exosomes İzolasyonu ve Karakterizasyonu

The field of exosome research is rapidly expanding, with a dramatic increase in publications in recent years. These small vesicles (30-100 nm) of ...

Generation of Human Induced Pluripotent Stem Cells from Peripheral Blood Using the STEMCCA Lentiviral Vector

Through the ectopic expression of four transcription factors, Oct4, Klf4, Sox2 and cMyc, human somatic cells can be converted to a pluripotent state, generating so-called induced pluripotent stem cells (iPSCs)1-4. Patient-specific iPSCs lack the ethical concerns that surround embryonic stem cells (ESCs) and would bypass possible immune rejection. Thus, iPSCs have attracted considerable attention for disease modeling studies, the screening of pharmacological compounds, and regenerative therapies5.
We have shown the generation of transgene-free human iPSCs from patients with different lung diseases using a single excisable polycistronic lentiviral Stem Cell Cassette (STEMCCA) encoding the Yamanaka factors6. These iPSC lines were generated from skin fibroblasts, the most common cell type used for reprogramming. Normally, obtaining fibroblasts requires a skin punch biopsy followed by expansion of the cells in culture for a few passages. Importantly, a number of groups have reported the reprogramming of human peripheral blood cells into iPSCs7-9. In one study, a Tet inducible version of the STEMCCA vector was employed9, which required the blood cells to be simultaneously infected with a constitutively active lentivirus encoding the reverse tetracycline transactivator. In contrast to fibroblasts, peripheral blood cells can be collected via minimally invasive procedures, greatly reducing the discomfort and distress of the patient. A simple and effective protocol for reprogramming blood cells using a constitutive single excisable vector may accelerate the application of iPSC technology by making it accessible to a broader research community. Furthermore, reprogramming of peripheral blood cells allows for the generation of iPSCs from individuals in which skin biopsies should be avoided (i.e. aberrant scarring) or due to pre-existing disease conditions preventing access to punch biopsies.
Here we demonstrate a protocol for the generation of human iPSCs from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) using a single floxed-excisable lentiviral vector constitutively expressing the 4 factors. Freshly collected or thawed PBMCs are expanded for 9 days as described10,11 in medium containing ascorbic acid, SCF, IGF-1, IL-3 and EPO before being transduced with the STEMCCA lentivirus. Cells are then plated onto MEFs and ESC-like colonies can be visualized two weeks after infection. Finally, selected clones are expanded and tested for the expression of the pluripotency markers SSEA-4, Tra-1-60 and Tra-1-81. This protocol is simple, robust and highly consistent, providing a reliable methodology for the generation of human iPSCs from readily accessible 4 ml of blood.

Here we show a simple and effective protocol for the generation of human iPSCs from 3-4 ml of peripheral blood using a single lentiviral reprogramming vector. Reprogramming of readily available blood cells promises to accelerate the utilization of iPSC technology by making it accessible to a broader research community.

STEMCCA lentiviral Vektör Kullanma Çevresel Blood İnsan İsteyerek Pluripotent Kök Hücre Üretimi

Through the ectopic expression of four transcription factors, Oct4, Klf4, Sox2 and cMyc, human somatic cells can be converted to a pluripotent state, ...

Isolation of Blood-vessel-derived Multipotent Precursors from Human Skeletal Muscle

Since the discovery of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs), the native identity and localization&#160;of MSCs have been obscured by their retrospective isolation in culture. Recently, using fluorescence-activated cell sorting (FACS), we and other researchers prospectively identified and purified three subpopulations of multipotent precursor cells associated with the vasculature of human skeletal muscle. These three cell populations: myogenic endothelial cells (MECs), pericytes (PCs), and adventitial cells (ACs), are localized respectively to the three structural layers of blood vessels: intima, media, and adventitia. All of these human blood-vessel-derived stem cell (hBVSC) populations not only express classic MSC markers but also possess mesodermal developmental potentials similar to typical MSCs. Previously, MECs, PCs, and ACs have been isolated through distinct protocols and subsequently characterized in separate studies. The current isolation protocol, through modifications to the isolation process and adjustments in the selective cell surface markers, allows us to simultaneously purify all three hBVSC subpopulations by FACS from a single human muscle biopsy. This new method will not only streamline the isolation of multiple BVSC subpopulations but also facilitate future clinical applications of hBVSCs for distinct therapeutic purposes.

Blood vessels within human skeletal muscle harbor several multi-lineage precursor populations that are ideal for regenerative applications. This isolation method allows simultaneous purification of three multipotent precursor cell populations respectively from three structural layers of blood vessels: myogenic endothelial cells from intima, pericytes from media, and adventitial cells from adventitia.

İnsan İskelet Kası Kan-damar-türevli Multipotent Öncüleri İzolasyonu

Since the discovery of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs), the native identity and localization&#160;of MSCs have been obscured by their retrospective ...

Generation and Culture of Blood Outgrowth Endothelial Cells from Human Peripheral Blood

Historically, the limited availability of primary endothelial cells from patients with vascular disorders has hindered the study of the molecular mechanisms underlying endothelial dysfunction in these individuals. However, the recent identification of blood outgrowth endothelial cells (BOECs), generated from circulating endothelial progenitors in adult peripheral blood, may circumvent this limitation by offering an endothelial-like, primary cell surrogate for patient-derived endothelial cells. Beyond their value to understanding endothelial biology and disease modeling, BOECs have potential uses in endothelial cell transplantation therapies. They are also a suitable cellular substrate for the generation of induced pluripotent stem cells (iPSCs) via nuclear reprogramming, offering a number of advantages over other cell types. We describe a method for the reliable generation, culture and characterization of BOECs from adult peripheral blood for use in these and other applications. This approach (i) allows for the generation of patient-specific endothelial cells from a relatively small volume of adult peripheral blood and (ii) produces cells that are highly similar to primary endothelial cells in morphology, cell signaling and gene expression.

This protocol allows for the reliable generation and characterization of blood outgrowth endothelial cells (BOECs) from a small volume of adult peripheral blood. BOECs can be used as a surrogate for endothelial cells from patients with vascular disorders and as a substrate for the generation of induced pluripotent stem cells.

İnsan çevresel kanından üretilmesi ve kültür Blood üremesi Endotel Hücreleri

Historically, the limited availability of primary endothelial cells from patients with vascular disorders has hindered the study of the molecular ...

Isolation of CD4+ T-cells and Analysis of Circulating T-follicular Helper (cTfh) Cell Subsets from Peripheral Blood Using 6-color Flow Cytometry

Aberrant T-follicular helper (Tfh) cell activity is detectable in autoimmune conditions and their presence is associated with clinical outcomes when the lymph node microenvironment in B-cell non-Hodgkin&#39;s lymphoma is analyzed. Subsets of circulating T-follicular helper cells (cTfh), the circulating memory compartment of Tfh cells in the blood, are also perturbed in disease and therefore represent potential novel predictive biomarkers. Peripheral blood-based testing is advantageous because it is relatively non-invasive and allows simple serial monitoring.This article describes a method for isolating CD4+ T-cells from human blood, and further analysis by flow-cytometry to enumerate cTfh cells and the proportions of their various subsets (cTfhPD-1-/+/hi, cTfh1,2,17 and cTfh1/17). The level of these subsets was then compared between normal subjects and patients with lymphoma. We found that the method was robust enough to obtain reliable results from routinely collected patient material. The technique we describe for the analysis can be easily adapted to cell sorting and downstream applications such as RT-PCR.

Isolation of CD4+ T-cells and Analysis of Circulating T-follicular Helper cTfh Cell Subsets from Peripheral Blood Using 6-color Flow Cytometry

Here, a protocol for the isolation and characterization of CD4+ T-cell subsets from human peripheral blood is described. Purified CD4+ T-cells are analyzed by flow cytometry to determine proportions of T-follicular helper cell subsets.

CD4 yalıtım+ T-hücreleri ve T foliküler Yardımcısı (cTfh) hücre alt kümeleri üzerinden periferik kan kullanarak 6-renk Akış Sitometresi Analizi, dolaşan

Aberrant T-follicular helper (Tfh) cell activity is detectable in autoimmune conditions and their presence is associated with clinical outcomes when the ...

Isolation, Characterization, and Differentiation of Cardiac Stem Cells from the Adult Mouse Heart

Myocardial infarction (MI) is a leading cause of morbidity and mortality around the world. A major goal of regenerative medicine is to replenish the dead myocardium after MI. Although several strategies have been used to regenerate myocardium, stem cell therapy remains a major approach to replenish the dead myocardium of an MI heart. Accumulating evidence suggests the presence of resident cardiac stem cells (CSCs) in the adult heart and their endocrine and/or paracrine effects on cardiac regeneration. However, CSC isolation and their characterization and differentiation toward myocardial cells, especially cardiomyocytes, remains a technical challenge. In the present study, we provided a simple method for the isolation, characterization, and differentiation of CSCs from the adult mouse heart. Here, we describe a density gradient method for the isolation of CSCs, where the heart is digested by a 0.2% collagenase II solution. To characterize the isolated CSCs, we evaluated the expression of CSCs/cardiac markers Sca-1, NKX2-5, and GATA4, and pluripotency/stemness markers OCT4, SOX2, and Nanog. We also determined the proliferation potential of isolated CSCs by culturing them in a Petri dish and assessing the expression of the proliferation marker Ki-67. For evaluating the differentiation potential of CSCs, we selected seven- to ten-days cultured CSCs. We transferred them to a new plate with a cardiomyocyte differentiation medium. They are incubated in a cell culture incubator for 12 days, while the differentiation medium is changed every three days. The differentiated CSCs express cardiomyocyte-specific markers: actinin and troponin I. Thus, CSCs isolated with this protocol have stemness and cardiac markers, and they have a potential for proliferation and differentiation toward cardiomyocyte lineage.

The overall goal of this article is to standardize the protocol for the isolation, characterization, and differentiation of cardiac stem cells (CSCs) from the adult mouse heart. Here, we describe a density gradient centrifugation method to isolate murine CSCs and elaborated methods for CSC culture, proliferation, and differentiation into cardiomyocytes.

Yalıtım, karakterizasyonu ve yetişkin fare kalp kalp kök hücre farklılaşma

Myocardial infarction (MI) is a leading cause of morbidity and mortality around the world. A major goal of regenerative medicine is to replenish the dead ...

Isolation and Characterization of Adult Cardiac Fibroblasts and Myofibroblasts

Cardiac fibrosis in response to injury is a physiological response to wound healing. Efforts have been made to study and target fibroblast subtypes that mitigate fibrosis. However, fibroblast research has been hindered due to the lack of universally acceptable fibroblast markers to identify quiescent as well as activated fibroblasts. Fibroblasts are a heterogenous cell population, making them difficult to isolate and characterize. The presented protocol describes three different methods to enrich fibroblasts and myofibroblasts from uninjured and injured mouse hearts. Using a standard and reliable protocol to isolate fibroblasts will enable the study of their roles in homeostasis as well as fibrosis modulation.

Obtaining a pure population of fibroblasts is crucial to studying their role in wound repair and fibrosis. Described here is a detailed method to isolate fibroblasts and myofibroblasts from uninjured and injured mouse hearts followed by characterization of their purity and functionality by immunofluorescence, RTPCR, fluorescence-assisted cell sorting, and collagen gel contraction.

Erişkin Kardiyak Fibroblastlar ve Miyofibroblastların İzolasyon ve Karakterizasyonu

Cardiac fibrosis in response to injury is a physiological response to wound healing. Efforts have been made to study and target fibroblast subtypes that ...

Isolation and Characterization of Exosomes from Skeletal Muscle Fibroblasts

Exosomes are small extracellular vesicles released by virtually all cells and secreted in all biological fluids. Many methods have been developed for the isolation of these vesicles, including ultracentrifugation, ultrafiltration, and size exclusion chromatography. However, not all are suitable for large scale exosome purification and characterization. Outlined here is a protocol for establishing cultures of primary fibroblasts isolated from adult mouse skeletal muscles, followed by purification and characterization of exosomes from the culture media of these cells. The method is based on the use of sequential centrifugation steps followed by sucrose density gradients. Purity of the exosomal preparations is then validated by western blot analyses using a battery of canonical markers (i.e., Alix, CD9, and CD81). The protocol describes how to isolate and concentrate bioactive exosomes for electron microscopy, mass spectrometry, and uptake experiments for functional studies. It can easily be scaled up or down and adapted for exosome isolation from different cell types, tissues, and biological fluids.

This protocol illustrates the 1) the isolation and culture of primary fibroblasts from the adult mouse gastrocnemius muscle as well as 2) purification and characterization of exosomes using a differential ultracentrifugation method combined with sucrose density gradients followed by western blot analyses.

İskelet Kası Fibroblastlarından Eksozomların İzolasyonu ve Karakterizasyonu

Exosomes are small extracellular vesicles released by virtually all cells and secreted in all biological fluids. Many methods have been developed for the ...

Isolation of Human Neutrophils from Whole Blood and Buffy Coats

Neutrophils (PMNs) are the most abundant leukocytes in human circulation, ranging from 40 to 70% of total blood leukocytes. They are the first cells recruited at the site of inflammation via rapid extravasation through vessels. There, neutrophils perform an array of functions to kill invading pathogens and mediate immune signaling. Freshly purified neutrophils from human blood are the model of choice for study, as no cell line fully replicates PMN functions and biology. However, neutrophils are short-lived, terminally differentiated cells and are highly susceptible to activation in response to physical (temperature, centrifugation speed) and biological (endotoxin, chemo- and cytokines) stimuli. Therefore, it is crucial to follow a standardized, reliable, and fast method to obtain pure and non-activated cells. This protocol presents an updated protocol combining density gradient centrifugation, red blood cell (RBC) sedimentation, and RBC lysis to obtain high PMN purity and minimize cell activation. Furthermore, methods to assess neutrophil isolation quality, viability, and purity are also discussed.

This protocol details a method for the isolation of neutrophils from whole blood, buffy coats, or leukapheresis membranes, achieving good yield, high purity, and minimal cell activation. We utilize gradient purification, red blood cell (RBC) sedimentation, and RBC lysis to obtain a high-quality/purity neutrophil preparation.

İnsan Nötrofillerinin Tam Kan ve Buffy Coats'tan İzolasyonu

Neutrophils (PMNs) are the most abundant leukocytes in human circulation, ranging from 40 to 70% of total blood leukocytes. They are the first cells ...