Bu protokolün amacı, kalsiyum sinyalizasyonunda rol oynayan yeni genlerin belirlenmesinde kullanılabilecek bir yöntem belirlemektir. Bunu yapmak için, klasik ileri genetik ekranı kullanırız. Kalsiyum sinyalizasyonu çeşitli bitki sistemlerinde önemli bir savunma tepki yoludur.
Bu yolda yer alan genleri tanımlamak için klasik ileri genetik ekranı kullandık. Bu yöntemde, EMS bitki sistemlerinde rastgele mutasyonlar tanıtmak için bir alkilleyici ajan olarak kullanılacaktır. Gelişmiş mutant nesil daha sonra ilgi bir fenotip için tarama için kullanılabilir.
İlginin fenotipi belirlendikten sonra nedensel gen eşlenebilir. Bu çalışmada, spektrumda kalsiyum muhabiri aequorin olan model bitki Arabidopsis'i kullanıyoruz. EMS mutagenez için aequorin 150 mg tohum ve kontrol olarak kullanılmak üzere başka bir 150 mg tohum ağırlığında.
Tohumları 50 ml'lik falcon tüpüne aktarın ve %2 EMS veya otoklavlı su ekleyin. EMS kullanırken, kanserojen olduğu için dikkatli olun. EMS kullanırken koruyucu dişliler giyilmeli ve her türlü dökülme önlenmelidir.
Falcon tüplerini parafinle kapatın ve alüminyum folyo ile sarın. Oda sıcaklığında 18 saat boyunca boru ucunu ucunda döndürün. Tohumların yerleşmesine ve EMS çözeltisini dikkatlice çıkarmasına ve bir azı nesi NaOH içeren bir atık kabına atmasını bekleyin.
Mutajenize edilmiş tohumları en az sekiz kez 40 ml otoklavlı su ile iyice yıkayın. Son yıkama için, EMS izlerini gidermek için en az üç kez 100 milimolar sodyum tiyosülfat ekleyin ve durulayın. Tohumları 40 ml otoklavlı suda bekleterek EMS'yi tohumlardan dağıtın ve tamamen kuruyana kadar Whatman kağıdına yerleştirin.
Tohumları Eppendorf'a aktarın ve tabakalaşma için 2-4 gün boyunca dört santigrat derecede kuluçkaya yatırın. Hem mutajenize edilmiş tohumları hem de su yla işlenmiş tohumları toprağa aktarın ve 22 santigrat derece ve %70 bağıl nemde 16 saatlik ışık ve sekiz saatlik karanlık fotoğraf süresiyle büyüme odalarına aktarın. Mutagenezin başarılı olup olmadığını belirlemek için klorofil bulalısi arayın.
Biz tek soy bazlı tohum toplama yöntemi kullandık ve her M1 bitki benzersiz bir sayı verilir. Olgunlaşma üzerine, tohumlar bu bireysel mutant bitkilerden hasat edilir ve bireysel M1 hatları olarak saklanır. Ranf ve ark.'dan uyarlanan yüksek iş kaynağı tohum sterilizasyonu ve hidroponik bitki kökü protokolü kullanılmaktadır.
İlk gün, 24 kuyulu doku kültür plakasının tek tek kuyularında M1 başına yaklaşık 12 ila 15 M2 tohum yerleştirin ve sodyum hipoklorit ve hidroklorik asit solüsyonu kullanılarak üçe göre birdir. Bu tohumları sterilize klor gazı bültenleri. Kalan klor gazıtamamen buharlaştırmak için bir gecede plaka bırakın.
Sterilizasyondan sonra, tek tek kuyulara yarım mukavemetli sıvı MS ortamı ekleyin ve tohumları dört santigrat derecede iki ila dört gün boyunca tabakalayın ve tohumları 10 saatlik ışık ve 14 saat karanlık 22 derece, %70 bağıl nem ile bir büyüme odasına taşıyın. 14. günde, fideler 8-12 günlük ken, her çizgiden 12 M2 fideyi tek tek 96 kuyulu bir luminometre plakasına yerleştirin. Fide transferinden sonra, tek tek kuyulara beş mikromolar Coelenterazine çözeltisinin 150 mikrolitresini ekleyin ve karanlıkta 21 derecede sekiz saat saklayın.
Coelenterazine fonksiyonel aequorin oluşturmak için apoaequorin bağlanır bir protez grubudur. Coelenterazine ışığa duyarlıdır ve bu nedenle ışıktan korunan koyu renkli şişelerde saklanır. Ertesi gün, ekran mutantlar uyarıcı olarak hidrojen peroksit kullanarak ve sonraki kalsiyum yüksekliği ölçmek.
24 kuyunun eşzamanlı ölçümü için, arka planın bir dakika ölçülmesi, ardından 10 dakika uyarıcı ilavesi ve ölçümü, ardından deşarj enjeksiyonu 150 mikrolitre ve üç ila beş dakika ölçüm yapılmasını içeren otomatik bir kinetik program yapılır. Ve kızı aequorin için herhangi bir deşarj ölçülen kalsiyum ölçmek için okuma dahil edilecek ve fonksiyonel aequorin için ek kontrol olarak. Yukarıdaki yöntemden sağlanan okumalar göreli ışık birimlerindedir.
Sitosolik kalsiyum iyon konsantrasyonunun hesaplanmasında, Rental and Knight tarafından 2004 yılında verilen daha önce tanımlanmış bir konsantrasyon denklemi protokolde tanımlanmıştır. Alüminyum iyon konsantrasyonu hesaplamak için luminometreden elde edilen RTU'lar denkleme eklenir. Elde edilen sitosolik kalsiyum iyon değerleri daha sonra grafiksel kalsiyum yanıtı için putatif hidrojen peroksit mutantları tanımlamak için bir vahşi tip kontrol karşı çizilir.
Bu, gösterilen protokolün temsili bir sonucudur. Kalsiyum iyon konsantrasyonunun yükselmesi için ölçülen 12 ayrı fideile bir M1 hattı gösterdik. Grafikteki yeşil çizgi, mutantlarla birlikte ölçülen vahşi tip aequorin'i gösteriyor.
Kırmızı tüm 12 fide ortalaması, ve siyah çizgi kalsiyum iyon yüksekliği için ölçülen bireysel M2 fideleri. Hidrojen peroksit uygulamasına son derece az tepki gösteren fideler daha sonra kurtarılır. Kurtarılan mutantlar daha sonra bir sonraki nesilde yeniden teyit edilir, ardından nedensel genleri belirlemek için haritalama.
EMS'yi mutajen olarak kullanırken dikkat edilmelidir, çünkü bu bir karsinojendir. Koruyucu dişli her zaman giyilmelidir ve yapılan herhangi bir dökülme iyi laboratuvar uygulamaları ile ele alınmalıdır. Ayrıca, tohum bir soy tabanlı toplama yaparken, bireysel bitkiler herhangi bir aşamada herhangi bir tohum karıştırma böylece son derece dikkatli hasat edilmelidir.
Bu bir geri dönmek ve homozigot mutant bitki olan ana bitki, iz yardımcı olacaktır. Ayrıca, bu yöntem tarama yöntemine herhangi bir önyargı veya önceki varsayımlar getirmediğinden, ilgi bir fenotip tanımlamak için bir veya daha fazla koşul için kullanılabilir. Ayrıca, birden fazla bağımsız gen de aynı protokol kullanılarak tespit edilebilir.
Protokol küçük doz ile bu yana kullanımı kolaydır, bitkilerin çok sayıda mutajenize edilebilir. Mutant bitkilerin Bu çok sayıda çeşitli popülasyonlar için kullanılabilir ve çeşitli koşullar için ve çeşitli genleri tanımlamak için. Kısmi fonksiyon kaybı, değiştirilmiş bir fonksiyon, tam bir fonksiyon kaybı veya aynı zamanda kurucu gen fonksiyonu bu yöntem le tanımlanabilir.
Haritalama, geçerli senaryolarda haritalama teknolojilerindeki ilerleme göz önüne alındığında kolay bir görev olmalıdır. Bir de novo tabanlı haritalama sistemi, bir SNP tabanlı ırksal çizim ve diğerleri ilgi fenotip neden neden olan nedensel geni tanımlamak için kullanılabilir. Bu yöntemin uygulanabilirliği göz önüne alındığında, sadece Arabidopsis model bitkilerde değil, ilgi okuma bir fenotip kurulabilir sağlanan diğer model bitkiler de kullanılabilir.
