Metabolomik ve Lipidomik Analizler için Beyin Tümörlerinin Yerinde Örnekleme sivesi ve ekstraksiyonu

Bu protokol, katı faz mikroekstraksiyon lifleri kullanarak bir sunucu nun içinde veya yanında beyin tümörlerinden bir çıkarma gerçekleştirmek için kullanılabilir. Bu teknik, küçük moleküllerin doğrudan rezeke edilen tümörlerden çıkarılmasını sağlar ve ekstraksiyon cihazlarını doğrudan analitik enstrümantasyona bağlama ile hızlı intraoperatif tanılama olanağı sağlar. Katı faz mikroekstraksiyon cihazını hazırlamak için, her katı faz mikroekstraksiyon cihazı probunun kodlamasını karışık modveya C18 kaplamalarla tümörün büyüklüğüne göre uygun bir uzunluğa kesin.

Ve sondaları ve 50 50 metanollü su çözeltisini numune toplamadan önce en az bir saat bekletin. Bu protokol beyin tümörleri üzerinde duruluyor ama strateji birçok farklı kanser tanısı için uygulanabilir. Teknoloji tamamen taşınabilir, bu nedenle herhangi bir ek cihazlar için gerek yoktur.

Tümör çıkarılmasından sonra en kısa sürede tüm ekstraksiyon fazı tümör içinde bulunan sağlamak için, beyin tümör doku örneği içine mümkün olduğunca liflereklemeden önce beş saniye boyunca LCMS sınıf su ile prob lifleri batırın. Örnek tümör dışındaki kaynaklardan gelen eserlerin varlığı nedeniyle hata kaynaklarını ortadan kaldırmak için doku içinde probları tam olarak 30 dakika bekletin, aynı süre için masaya şartlı prob lifleri yerleştirin. Çıkarma sırasında, prob depolama için kullanılacak hplc şişeleri etiketi çıkarmadan sonra kullanılacak.

Çıkarma sonunda, herhangi bir kan veya hücre enkaz kaldırmak ve lifleri hareketsizleştirmek için tek bir HPLC şişe kapağının septa alt yoluyla her prob eklemek için üç saniye lcms sınıf su lifleri batırın. Daha sonra şişeleri hareketsiz liflerle kaplayın ve şişeleri uygun bir taşıma kabına yerleştirin. Laboratuvara vardıktan sonra, şişeleri sırasıyla en fazla üç veya beş yıl süreyle eksi 30 veya eksi 80 santigrat derecelik bir dondurucuya yerleştirdi.

Tek bir deneyden alınan tüm numuneler toplandıktan sonra, karışık modlifleri içeren şişeleri oda sıcaklığına yerleştirin. ve desorpsiyon için iki mililitrelik şişeleri etiketleyin her şişenin içine bir cam kesici yerleştirin ve her kesici uça taze hazırlanmış 80 20 asetonitril su çözeltisi 300 mikrolitre ekleyin. Desorpsiyon çözücümün ayrı şişelerinde her sondanın kodlanmasına tam olarak daldırılmış ve şişeleri 120 dakika boyunca bir girdap üzerinde dakikada 120 dakikada hareket ettirin.

Desorpsiyon tamamlandıktan sonra, şişelerden kapakları çıkarın ve bir kalite kontrol örneği hazırlamak için tümörekstresi içeren her dosyadan 10 mikrolitre aliquots bir kenara koyun. Daha sonra şişeleri yeni kapaklarla kapatın ve şişeleri sıvı kromatografi yüksek çözünürlüklü kütle spektrometresinin dört derecelik santigrat otomatik örnekleyicisine yerleştirin. Lipidomik Analiz için numuneleri hazırlamak için oda sıcaklığında C 18 lifleri içeren şişeleri yerleştirin ve iki mililitre HPLC şişelerini, şişelerin içine silanize cam uçlarının bozulması için etiketleyin ve her kesici uça 200 mikrolitre taze hazırlanmış 50 50 isopropanol metanol çözeltisi ekleyin.

Her prob kaplamasını çözücüye tamamen batırın ve numuneleri bir girdap üzerinde dakikada 1,200 devirde 50 dakika boyunca çalkalayın. Zaman sonunda, kapakları kaldırarak desorption durdurmak ve daha sonra kalite kontrol örneği hazırlamak ve yeni kapaklar ile şişeleri kapatmak için tümör ekstresi içeren her dosyadan 10 mikrolitre aliquots bir kenara koyun. Daha sonra şişeleri sıvı kromatografiyüksek çözünürlüklü kütle spektrometresinin dört derecelik santigrat otomatik örnekleyicisine yerleştirin.

Enstrümental analizin tekrarlanabilirliği, temel bileşen analiz çizimindeki kalite kontrol örneklerinin sıkı kümelemesi nedeniyle çok iyi olarak belirlenmiştir. Gliom ve menenjiyomlu hastalardan alınan örneklere ait bu lipidomik veriler, tümör örneklerinin histolojik kökenlerine ve malignitelerine göre ayırt edilebilme yeteneğini vurgulamaktadır. Bu metabolomik verilerde gösterildiği gibi gliomlar malignite derecesine ve ilgi mutasyonlarının varlığına veya yokluğuna göre daha da ayrılabilir.

İstatistiksel analiz aynı zamanda incelenen gruplar içinde belirli bileşiklerin seçimine de izin verir. Çıkarma süresini dikkatle kontrol etmek ve tüm numuneler için tekrarlanabilir koşulları korumak esastır. Alternatif olarak, numuneler belirli belirteçlerin hedeflenen analizine izin vererek ve tüm prosedürü birkaç dakikaya kadar kısaltarak kromatografik ayırma olmadan doğrudan lifden Ms'e çözülebilir.