Amostragem e Extração de Tumores Cerebrais no local para análise metabolômica e lipidômica

Este protocolo pode ser usado para realizar uma extração de tumores cerebrais dentro ou ao lado de um servidor no uso de fibras de microextração de fase sólida. Esta técnica permite a extração de pequenas moléculas diretamente de tumores ressecados e proporciona uma oportunidade para diagnósticos intraoperatórios rápidos, acoplando dispositivos de extração diretamente à instrumentação analítica. Para preparar o dispositivo de microextração de fase sólida, corte a codificação de cada sonda de dispositivo de microextração de fase sólida com revestimentos de modo misto ou C18 a um comprimento apropriado de acordo com o tamanho do tumor.

E mergulhe as sondas e uma solução de 50 50 água de metanol por pelo menos uma hora antes da coleta da amostra. Este protocolo se concentra em tumores cerebrais, mas a estratégia pode ser implementada para o diagnóstico de muitos cânceres diferentes. A tecnologia é totalmente portátil, por isso não há necessidade de dispositivos adicionais.

O mais rápido possível após a remoção do tumor imergir as fibras da sonda com água de grau LCMS por cinco segundos antes de inserir as fibras o mais longe possível na amostra do tecido tumoral cerebral, para garantir que toda a fase de extração esteja localizada dentro do tumor. Deixe as sondas dentro do tecido por precisamente 30 minutos para eliminar fontes de erro devido à presença de artefatos de fontes diferentes do tumor amostral, coloque fibras da sonda condicionadas sobre a mesa pelo mesmo período de tempo. Durante a extração, rotule frascos HPLC a serem usados para armazenamento da sonda após a extração.

No final da extração, mergulhe as fibras na água de grau LCMS por três segundos para remover quaisquer detritos sanguíneos ou celulares e inserir cada sonda através da parte inferior da septa de uma única tampa de frasco HPLC para imobilizar as fibras. Em seguida, tampe os frascos com as fibras imobilizadas e coloque os frascos em um recipiente de transporte apropriado. Após a chegada do laboratório, imediatamente colocou os frascos em um congelador de menos 30 ou menos 80 graus Celsius por não mais do que três ou cinco anos, respectivamente.

Uma vez coletadas todas as amostras de um único experimento, coloquem os frascos contendo as fibras do modo misto à temperatura ambiente. e rotule dois frascos de mililitro para desorção coloque uma inserção de vidro em cada frasco e adicione 300 microliters de 80 20 solução de água acetonitrila recém-preparada para cada inserção. Imergiu totalmente a codificação de cada sonda em frascos individuais do solvente de desorção e agitar os frascos por 120 minutos a 1.200 revoluções por minuto em um vórtice.

Uma vez que a desorção esteja completa, remova as tampas dos frascos e reserve 10 alíquotas de microliter de cada arquivo contendo extrato do tumor para preparar uma amostra de controle de qualidade. Em seguida, feche os frascos com novas tampas e coloque os frascos nos quatro graus Celsius auto sampler de um espectrômetro de massa de alta resolução cromatografia líquida. Para preparar as amostras para análise lipidômica, coloque os frascos contendo as fibras C 18 à temperatura ambiente e rotule dois frascos de IC IC mililitros para a interrupção coloque as pastilhas de vidro silanizada nos frascos e adicione 200 microliters de solução de metanol isopropanol recém-preparada a cada inserção.

Imergir totalmente cada revestimento da sonda no solvente e agitar as amostras por 50 minutos a 1.200 revoluções por minuto em um vórtice. No final do tempo, pare a desordenação removendo as tampas e reserve 10 alíquotas de 10 microliteres de cada arquivo contendo extrato do tumor para preparar a amostra de controle de qualidade e fechar os frascos com novas tampas. Em seguida, coloque os frascos no amostrador automático de quatro graus Celsius do espectrômetro de massa de alta resolução da cromatografia líquida.

A reprodutibilidade da análise instrumental foi determinada como muito boa com base no agrupamento apertado das amostras de controle de qualidade no enredo principal de análise de componentes. Esses dados lipidomáticos para amostras coletadas de pacientes com gliomas e meningiomas destacam a capacidade das amostras tumorais de serem distinguidas de acordo com sua origem histológica e malignidade. Conforme ilustrado com esses dados metabolômicos, os gliomas podem ser ainda divididos com base em seu grau de malignidade e ou de acordo com a presença ou ausência de mutações de interesse.

A análise estatística também permite a seleção de compostos específicos dentro dos grupos estudados. É essencial controlar cuidadosamente o tempo de extração e manter condições reprodutíveis para todas as amostras. Alternativamente, as amostras podem ser dissolvidas da fibra diretamente para Ms sem separação cromatográfica permitindo a análise direcionada de marcadores específicos e encurtando todo o procedimento para vários minutos.