Bu modüler protokol, örnek numune başına gelişmiş nicel ve nitel veri çıkışı ile ketum doku bölgelerinde ve kanda yapısal ve sinyal lipitleri ve/veya RNA'lar tarafından işlenen birden fazla moleküler olayı keşfetmeyi mümkün kılar. Yöntem herhangi bir deneysel model için geçerlidir ve insan doku örneklerine ve kana da uygulanabilir. Prosedürü gösterenler bir teknisyen olan Claudia Schwitter, yüksek lisans öğrencisi Julia Post ve grubumdaki bir postdoc olan Raissa Lerner olacak.
Başlamak için, akut ve profilaktik olarak tedavi edilmiş kainik asit kaynaklı epilepsili farelerin daha önce izole edilmiş, bütün, donmuş beyinlerini alın. Beyinleri kriyostatın montaj sistemine monte edin. Kalınlığı 50 mikrometreye ayarlayın ve beyni ilgi çekici bölgeye yakın kırpma modunda dilimleyin.
İlgi alanına yaklaşırken kalınlığı 18 ila 20 mikrometre olarak ayarlayın. İlginin alt kısmını lokalize etmek için, toluidin mavisi kullanarak beyin dilimlerini lekeleyin. Delik delmenin ilgi çekici bölgelerini belirlemek için lekeli dilimleri incelemek için bir mikroskop kullanın ve uygun beyin anatomik bölgelerini bulmak için referans olarak bir fare atlası kullanın.
0,8 ila 1,0 milimetre çapında yumruklar almak için örnek corers kullanın. Endocannabinoidler ve eikosanoidler için yumrukları, tüp başına yedi önceden soğutulmuş çelik bilyeli önceden soğutulmuş 2 mililitrelik kehribar tüplere aktarın. Fosfolipidler ve endokannabinoidlerin birlikte çıkarılması, çift lipid ve RNA ortak ekstraksiyonu için, yumrukları seramik boncuklu 2 mililitre RNase içermeyen ekstraksiyon tüplerine aktarın.
Soğuk odada donmuş zımbaları tartın ve hemen ekstraksiyona devam edin veya 80 santigrat derecede dondurun. Endocannabinoidlerin ve eikosanoidlerin beyin parçalarından, yumruklardan veya doku tozu örneklerinden sıvı-sıvı lipid birlikteliğini gerçekleştirmek için, doku örneklerini ve yedi çelik topu içeren ekstraksiyon tüplerini buza yerleştirin. İç standartları içeren 600 mikrolitre buz gibi MTBE ve 50 mikrolitre asetonitril su ekleyin.
400 mikrolitre 0.1 molar formik asit ekledikten sonra, 30 saniye ila 1 dakika homojenleşmek için bir doku likörü kullanın. Bu homojenliği 15 dakika boyunca 5,000 kez g 4 santigrat derecede santrifüjleyin. Üst organik fazın transferini kolaylaştıracak sulu alt fazı dondurmak için 80 santigrat derecede 10 dakika dondurucuya yerleştirin.
Üst organik fazı yeni 1,5 mililitrelik kehribar tüplere aktarın, 10 dakika boyunca 37 santigrat derecede hafif bir azot akışı altında buharlaşın ve daha fazla analiz için 50 mikrolitre asetonitril suda yeniden inşa edin. Daha fazla protein içeriği analizi için sulu fazı 20 veya 80 santigrat derecede saklayın. Plazma örneklerinden endokannabinoidleri ve eikosanoidleri bir arada çıkarmak için donmuş plazma örneklerini buza yerleştirin ve tamamen çözülmelerini bırakın.
Referans plazma örnekleri kullanılarak spiking için optimize edilmiş iç standartları içeren 800 mikrolitre MTBE ve 50 mikrolitre asetonitril su ekleyin. 2 dakika boyunca 4 santigrat derecede 0,1 molar formik asit ve girdap 600 mikrolitre ekleyin. Örnekleri 4 santigrat derecede 15 dakika boyunca 4.000 kez g'da santrifüjleyin.
Organik fazı yeni tüplere aktarın. 37 santigrat derecede hafif bir azot akışı altında buharlaştır ve sıvı kromatografi çoklu reaksiyon izleme analizi için 50 mikrolitre asetonitril su ile yeniden inşa edin. Fosfolipidlerin ve endokannabinoidlerin beyin bölgelerinden, yumruklardan veya diğer doku tozu örneklerinden birlikte çıkarılmasını gerçekleştirmek için, doku örneklerini ve seramik boncukları içeren ekstraksiyon tüplerini buza yerleştirin.
800 mikrolitre metil tert-butil eter ve metanol karışımı ve iç standartları içeren 10 mikrolitre metanol ekleyin. Daha sonra, 25 mikromoler tetrahidrolipstatin / URB597 ve BHT mililitre başına 50 mikrogram içeren% 0.1 formik asit 200 mikrolitre ekleyin. Bir doku homojenizatör ile homojenizasyon yaptıktan sonra, 15 dakika boyunca 5.000 kez g ve 4 santigrat derecede santrifüj.
Üst organik fazı yeni tüplere aktarın, 37 santigrat derecede hafif bir azot akışı altında buharlaşın ve ardından bu lipid ekstresini 90 mikrolitre metanol ile yeniden inşa edin. Hemen devam ediyorsanız, lipit ekstresinin bir aliquot'una% 10 su ekleyin ve fosfolipid analizi için LC / MS'ye 10 mikrolitre enjekte edin. Daha fazla endokannabinoid analizi için bir sonraki adıma geçin.
Lipid özünden bir aliquot alın, kuruluğa buharlaşın ve asetonitril suda yeniden inşa edin. RNA ve lipitlerin çift ekstraksiyonu ve doku örneklerinden fosfolipidlerin ve endokannabinoidlerin birlikte çıkarılması, 4 santigrat derecede doku tozu aliquots veya beyin demetlerinin çözülmesini gerçekleştirmek. Mendili seramik boncuklu ekstraksiyon tüplerine ekleyin.
Daha sonra 200 mikrolitre kloroform ile birlikte 600 mikrolitre RLT tamponu ekleyin. Fosfolipid ve endokannabinoid birlikteliği için, 10 mikrolitre iç standart karışıma sahip çivi örnekleri ve 20 saniye boyunca yüksek hızda homojenize edin. Homojenize edilmiş numuneleri yeni santrifüj tüplerine ve santrifüjene tam hızda beş dakika ve faz ayrımını sağlamak için 4 santigrat derece aktarın.
Üst fazı standart bir kit kullanarak RNA ekstraksiyonu için yeni bir tüpe aktarın. Elute, RNA'yı toplam 50 mikrolitre RNase içermeyen su hacminde çıkardı ve 80 santigrat derecede depoladı. Lipid ekstraksiyonu için alt kloroform içeren faza 800 mikrolitre MTBE/metanol ve %0,1 formik asit 200 mikrolitre ekleyin.
4 santigrat derecede 45 dakika boyunca girdap. Üst organik fazı yeni bir tüpe aktarın. 37 santigrat derecede hafif bir nitrojen akışı altında buharlaştır.
Daha fazla LC/MS analizi için, numuneyi 90 mikrolitre metanol içinde yeniden oluşturmak ve 20 veya 80 santigrat derecede saklamak veya hemen analize devam etmek. Daha fazla endokannabinoid analizi için bir sonraki adıma geçin. Lipid özünden bir aliquot alın, kuruluğa buharlaşın ve asetonitril suda yeniden inşa edin.
Daha sonra endokannabinoid analizi için LC/MS'e 20 mikrolitre enjekte edin. Akut epileptik nöbetlerin kainik asit indüksiyonu, enjeksiyondan bir saat sonra maksimum nöbet yoğunluğuna yol açtı. Endokannabinoidlerin ve eikosanoidlerin yanı sıra fosfolipidler ve endokannabinoidlerin lipidomik profillemeleri, serebral korteks, striatum, talamik bölge, hipokampus, hipotalamus, serebellumun yanı sıra kainic asit kaynaklı epileptik farelerde ve kontrollerde kalp ve akciğer dokusunda lipid seviyesi değişikliklerini göstermektedir.
Fare beyin yumruklarının nicel profillemesi için fosfolipidler ve endokannabinoidler ve RNA'nın çift ekstraksiyonu yapıldıktan sonra, hipotalamus, bazolateral amigdala ve ventral ve dorsal hipokampustaki lipitlerin nicel dağılımı analiz edildi. Lipid sinyalinde yer alan endojen enzimlerin ve reseptörlerin göreceli ekspresyon düzeylerinin yanı sıra farklı beyin bölgelerinde mRNA düzeyinde araştırılan beyin aktivitesi belirteçleri ve kainik asit kaynaklı epileptik nöbet ve kontrollere maruz kalan farelerden alt bölgeler. Kainik asit kaynaklı epilepsi, çoğunlukla hipokampüsün CA1, CA3 ve hilus bölgesinde, kontrol salin enjekte edilen farelere kıyasla caspase-3 sinyali ile belirtilen apoptotik olaylar eşliğinde büyük NeuN sinyali kaybına neden oldu.
Subkronik palmitoylethanolamid ile tedavi edildikten sonra nöronal çekirdek protein sinyali belirgin bir şekilde korundu ve CASP3 sinyali zar zor tespit edildi. Gizli beyin bölgelerinin beyin delme ve diseksiyonu oldukça zordur ve birden fazla kohort arasında tutarlı örnekleme elde etmek için ince beceriler gerektirir. Bu nedenle, test organları üzerinde pratik yapmak ve beyin morfolojisi hakkında iyi bilgi sahibi olmak şiddetle tavsiye edilir.
