Dieses Protokoll kann verwendet werden, um eine Extraktion von Hirntumoren in oder neben einem Server unter Verwendung von Festphasen-Mikroextraktionsfasern durchzuführen. Diese Technik ermöglicht die Extraktion kleiner Moleküle direkt aus resezierten Tumoren und bietet die Möglichkeit für eine schnelle intraoperative Diagnostik durch die direkte Kopplung von Extraktionsgeräten an analytische Instrumente. Um die Festphasen-Mikroextraktionsvorrichtung vorzubereiten, trimmen Sie die Codierung jeder Festphasen-Mikroextraktionssonde mit gemischter Modus- oder C18-Beschichtung auf eine angemessene Länge entsprechend der Größe des Tumors.
Und die Sonden und eine 50 50 Methanol-Wasserlösung mindestens eine Stunde vor der Probenentnahme einweichen. Dieses Protokoll konzentriert sich auf Hirntumoren, aber die Strategie kann für die Diagnose vieler verschiedener Krebsarten implementiert werden. Die Technologie ist vollständig tragbar, so dass keine zusätzlichen Geräte benötigt werden.
Tauchen Sie die Sondenfasern so schnell wie möglich nach der Tumorentfernung fünf Sekunden lang mit LCMS-Wasser ein, bevor Sie die Fasern so weit wie möglich in die Hirntumor-Gewebeprobe einsetzen, um sicherzustellen, dass sich die gesamte Extraktionsphase im Inneren des Tumors befindet. Lassen Sie die Sonden innerhalb des Gewebes für genau 30 Minuten, um Fehlerquellen aufgrund des Vorhandenseins von Artefakten aus anderen Quellen als dem Probentumor zu beseitigen, legen Sie konditionierte Sondenfasern auf den Tisch für den gleichen Zeitraum. Während der Extraktion, Label HPLC Fläschchen für die Sondenlagerung nach der Extraktion verwendet werden.
Am Ende der Extraktion tauchen Sie die Fasern drei Sekunden lang in WASSER der LCMS-Klasse ein, um Blut- oder Zellablagerungen zu entfernen, und legen Sie jede Sonde durch den Boden der Septa einer einzelnen HPLC-Durchstechflasche ein, um die Fasern zu immobilisieren. Dann die Fläschchen mit den immobilisierten Fasern kappen und die Fläschchen in einen geeigneten Transportbehälter legen. Bei der Ankunft im Labor legten die Fläschchen sofort für nicht mehr als drei bzw. fünf Jahre in einen Gefrierschrank von minus 30 bzw. minus 80 Grad Celsius.
Nachdem alle Proben aus einem einzigen Experiment gesammelt wurden, legen Sie die Fläschchen mit den Gemischten-Modus-Fasern bei Raumtemperatur. und beschriften Sie zwei Milliliter-Fläschchen zur Desorption einen Glaseinsatz in jede Durchstechflasche und fügen Sie 300 Mikroliter frisch zubereitete 80 20 Acetonitril-Wasserlösung zu jedem Einsatz hinzu. Vollständige Kodierung jeder Sonde in einzelne Durchstechflaschen des Desorptionslösungsmittels und rührt die Fläschchen 120 Minuten lang bei 1.200 Umdrehungen pro Minute auf einem Wirbel.
Sobald die Desorption abgeschlossen ist, entfernen Sie die Kappen von den Durchstechflaschen und legen Sie 10 Mikroliter Aliquots aus jeder Datei beiseite, die Extrakt aus dem Tumor enthält, um eine Qualitätskontrolle Probe vorzubereiten. Schließen Sie dann die Fläschchen mit neuen Kappen und legen Sie die Fläschchen in den vier Grad Celsius Auto-Sampler eines flüssigen Chromatographie hochauflösenden Massenspektrometers. Um die Proben für die Lipidomic Analysis vorzubereiten, legen Sie die Fläschchen mit den C 18 Fasern bei Raumtemperatur und beschriften Sie zwei Milliliter HPLC-Fläschchen für die Störungsplatz-Silanglaseinsätze in die Durchstechflaschen und fügen Sie 200 Mikroliter frisch zubereitete 50 50 Isopropanol Methanollösung zu jedem Einsatz hinzu.
Tauchen Sie jede Sondenbeschichtung vollständig in das Lösungsmittel ein und rühren Sie die Proben 50 Minuten lang bei 1.200 Umdrehungen pro Minute auf einem Wirbel. Am Ende der Zeit, stoppen Sie die Desorption durch Entfernen der Kappen und legen Sie dann beiseite eine 10 Mikroliter Aliquots aus jeder Datei enthält Extrakt aus dem Tumor, um die Qualitätskontrolle Probe vorzubereiten und schließen Sie die Fläschchen mit neuen Kappen. Legen Sie dann die Fläschchen in den vier Grad Celsius Auto-Sampler des flüssigen Chromatographie-Massenspektrometers mit hoher Auflösung.
Die Reproduzierbarkeit der Instrumentalanalyse wurde aufgrund der engen Clusterung der Qualitätskontrollproben auf dem Hauptkomponentenanalysediagramm als sehr gut ermittelt. Diese Lipidomik-Daten für Proben von Patienten mit Gliomen und Meningiomen unterstreichen die Fähigkeit der Tumorproben, nach ihrem histologischen Ursprung und ihrer Malignität zu unterscheiden. Wie mit diesen Metabolomik-Daten veranschaulicht, können Gliome weiter geteilt werden, je nach Grad der Malignität und oder nach dem Vorhandensein oder Fehlen von Mutationen von Interesse.
Die statistische Analyse ermöglicht auch die Auswahl spezifischer Verbindungen innerhalb der untersuchten Gruppen. Es ist wichtig, die Extraktionszeit sorgfältig zu kontrollieren und reproduzierbare Bedingungen für alle Proben aufrechtzuerhalten. Alternativ können Proben ohne chromatographische Trennung von der Faser direkt zu Ms gelöst werden, was eine gezielte Analyse bestimmter Marker ermöglicht und den gesamten Eingriff auf mehrere Minuten verkürzt.
