메타볼로믹스 및 리피도믹스 분석을 위한 뇌종양의 현장 샘플링 및 추출

이 프로토콜은 고체 위상 미세 추출 섬유를 사용하는 서버 안또는 옆에 뇌종양에서 추출을 수행하는 데 사용할 수 있습니다. 이 기술은 절제된 종양에서 직접 작은 분자의 추출을 가능하게 하고 분석 계측에 직접 추출 장치를 결합해서 신속한 수술 내 진단을 위한 기회를 제공합니다. 고체 상 미세 추출 장치를 준비하기 위해, 각 고체 위상 미세 추출 장치 프로브의 코딩을 혼합 모드 또는 C18 코팅으로 종양의 크기에 따라 적절한 길이로 다듬는다.

그리고 샘플 수집 전에 적어도 한 시간 동안 프로브와 50 50 메탄올 물 용액을 담급니다. 이 프로토콜은 뇌종양에 초점을 맞추고 있지만 많은 다른 암의 진단을 위해 전략을 구현 할 수 있습니다. 이 기술은 완전히 휴대성이 뛰어나므로 추가 장치가 필요하지 않습니다.

종양 제거 후 가능한 한 빨리 전체 추출 단계가 종양 내부에 위치되도록 하기 위해 가능한 한 섬유를 뇌종양 조직 샘플에 삽입하기 전에 5초 동안 LCMS 급수로 프로브 섬유를 침지합니다. 정밀하게 30 분 동안 조직 내에서 프로브를 두고 샘플 종양 이외의 소스에서 유물의 존재로 인한 오류의 원인을 제거하고, 같은 기간 동안 테이블에 조건부 프로브 섬유를 배치합니다. 추출 하는 동안, 라벨 HPLC 바이알 추출 후 프로브 스토리지에 사용 됩니다.

추출의 끝에서, 어떤 혈액 또는 세포 파편을 제거하고 섬유를 고정하기 위해 하나의 HPLC 유리캡의 septa의 바닥을 통해 각 프로브를 삽입하기 위해 3 초 동안 LCMS 등급 물에 섬유를 침지. 그런 다음 고정화 된 섬유로 바이알을 캡하고 바이알을 적절한 운송 컨테이너에 넣습니다. 실험실도착 시 즉시 바이알을 영하 30도 또는 영하 80도의 냉동고에 각각 3~5년 이상 배치했습니다.

단일 실험에서 모든 샘플을 채취하면 혼합 모드 섬유를 포함하는 바이알을 실온에 놓습니다. 탈착을 위해 2밀리리터 바이알을 라벨로 붙이고 각 유리병에 유리 인서트를 넣고 각 삽입물에 갓 준비된 80 20개의 아세토나이트 워터 용액 300마이크로리터를 추가합니다. 탈착 용매의 개별 바이알에 각 프로브의 코딩을 완전히 침지하고 소용돌이에서 분당 1, 200 회전에서 120 분 동안 바이알을 동요시다.

탈착이 완료되면 바이알에서 캡을 제거하고 종양에서 추출한 각 파일에서 10개의 마이크로리터 알리코트를 따로 떼어 품질 관리 샘플을 준비합니다. 그런 다음 바이알을 새 캡으로 닫고 유리병을 액체 크로마토그래피 고해상도 질량 분광계의 섭씨 4도 자동 샘플러에 넣습니다. Lipidomic 분석을 위한 견본을 준비하기 위하여는 실온에서 C 18 섬유를 포함하는 바이알을 놓고 중단 장소에 대한 2밀리리터 HPLC 바이알을 표시하고 새로 준비된 50 50 50 isopropanol 메탄올 용액의 200 마이크로리터를 각 삽입에 추가합니다.

각 프로브 코팅을 용매에 완전히 담그고 분당 1, 200 회전에서 50분 동안 샘플을 소용돌이에 담그고 시료를 교반합니다. 시간이 끝나면 캡을 제거하여 탈착을 중지한 다음 종양에서 추출된 추출물을 포함하는 각 파일에서 10 마이크로리터 알리코트를 따로 설정하여 품질 관리 샘플을 준비하고 새 캡으로 바이알을 닫습니다. 그런 다음 액상 크로마토그래피 고해상도 질량 분광계의 섭씨 4도 자동 샘플러에 바이알을 배치합니다.

기악 분석의 재현성은 주 성분 분석 플롯에 대한 품질 관리 샘플의 단단한 클러스터링에 기초하여 매우 양호한 것으로 판단되었다. 교혈증 및 수막종 환자로부터 수집된 샘플에 대한 이러한 리피도믹스 데이터는 조직학적 기원및 악성종양에 따라 구별되는 종양 샘플의 능력을 강조합니다. 이러한 메타볼로믹스 데이터와 함께 설명된 바와 같이, 글리오마스는 악성 종양의 정도에 따라 또는 관심있는 돌연변이의 존재 또는 부재에 따라 더 나눌 수 있습니다.

통계 분석은 또한 연구된 단 내의 특정 화합물의 선택을 허용합니다. 추출 시간을 신중하게 제어하고 모든 샘플에 대한 재현 가능한 조건을 유지하는 것이 필수적입니다. 대안적으로, 시료는 크로마토그래피 분리 없이 섬유에서 Ms로 직접 용해되어 특정 마커의 표적 분석을 허용하고 전체 절차를 몇 분으로 단축할 수 있다.